2010-6-82010-6-8基因工程的基本操作程序目標的獲取從基因文庫，PCR擴增，人工合成載體構建目的基因啟動子終止子和標記基因目標導入目的基因進入受體細胞內檢測鑒定基因探針法，生物學水平鑒定等1目標獲取■人工合成■技術比較2載體構建■組成■功能■步驟3目標導入■轉化■受體種類■導入方法4檢測鑒定1目標獲取編輯從基因文庫中獲取基因文庫：將含有某種生物不同基因的許多DNA片段，導入受體菌的群體儲存,各個受體菌分別含有這種生物的不同的基因，稱為基因文庫。基因文庫的種類：1、基因組文庫；2、部分基因文庫。利用PCR技術擴增目的基因PCR含義：是一項在生物體外復制特定DNA片段的核糖合成技術。全稱是多聚酶鏈式反應。PCR原理：DNA雙鏈復制。前提條件：有一段已知目的基因的核苷酸序列，以便根據(jù)這一序列合成引物。擴增過程：目的基因DNA受熱變性后解鏈為單鏈，引物與單鏈相應互補序列結合，在DNA聚合酶的作用下進行延伸，如此重復循環(huán)多次。結果：每次循環(huán)后的目的基因的量增加一倍，即成指數(shù)形式擴增。人工合成如果基因較小，核苷酸序列又已知，可以通過DNA合成儀用化學方法直接人工合成。技術比較DNA復制PCR技術基因克隆場所細胞核生物體外細胞內酶解旋酶、DNA聚合酶Taq酶限制酶、連接酶載體不需要不需要而，要遵循原則堿基互補配對堿基互補配對堿基互補配對結果DNA分子DNA分子片段DNA分子片段2載體構建編輯組成1、目的基因;2、啟動子;3、終止子;4、標記基因功能1、使目的基因在受體細胞中穩(wěn)定存在，并且可以遺傳給下一代；2、使目的基因能夠表達和發(fā)揮作用。步驟⑴、用一定的限制酶切割質粒，使之出現(xiàn)一個黏性末端切口。⑵、用同種限制酶切割目的基因，產生相同的黏性末端。⑶、將目的基因片段插入質粒切口，加入適量DNA連接酶，使目的基因與質粒形成重組質粒。⑷、基因表達載體的構成：目的基因+啟動子+終止子+標記基因3目標導入編輯轉化目的基因進入受體細胞內，并且在受體細胞內維持穩(wěn)定和表達的過程。受體種類⑴、微生物：細菌細胞⑵、植物細胞：卵細胞、受精卵、體細胞⑶、動物細胞：受精卵、胚胎細胞導入方法⑴、微生物：感受態(tài)細胞法、感受態(tài)細胞：指細菌細胞經(jīng)過Ca2+處理后，細胞壁透性增強，能夠吸收周圍環(huán)境中DNA分子的生理狀態(tài)。、過程：CaCl2+處理細胞T感受態(tài)細胞T表達載體與感受態(tài)細胞混合T感受態(tài)細胞吸收DNA分子。⑵、植物細胞：農桿菌轉化法、基因槍法、花粉管通道法、農桿菌：土壤微生物，易感染雙子葉植物和裸子植物；對大多數(shù)單子葉植物沒有感染力。、Ti質粒的T_DNA可轉移到受體細胞，并整合到受體細胞染色體DNA上。、過程：目的基因插入T_DNA，T_DNA進入農桿菌，將農桿菌導入植物細胞。⑶、動物細胞：顯微注射法、目的基因表達載體經(jīng)過提純備用，取得受體動物的卵（或受精卵）備用。、采用顯微注射技術將目的基因表達載體注射到卵（或受精卵）中。、培養(yǎng)液培養(yǎng)成為早期胚胎。、將早期胚胎移植到雌性動物子宮內，發(fā)育成新個體。4檢測鑒定編輯⑴、檢測：、導入檢測：檢測受體細胞染色體DNA上是否含有目的基因。DNA分子雜交法（DNA探針法）。、表達檢測：檢測目的基因是否完成轉錄出mRNA。分子雜交法檢測RNA。檢測目的基因是否完成表達翻譯成蛋白質。提取蛋白質，用相應的抗體進行抗原——抗體雜交。⑵、鑒定：個體生物學水平鑒定，鑒定抗性等。課時達標訓練（二）基因工程的基本操作程序（時間：25分鐘；滿分：50分）一、選擇題（每小題2分，共20分）下列不屬于獲取目的基因方法的是（）利用DNA連接酶復制目的基因利用DNA聚合酶復制目的基因從基因文庫中獲取目的基因利用PCR技術擴增目的基因在基因工程的操作過程中，獲得重組質粒不需要（）DNA連接酶②同一種限制酶③RNA聚合酶④具有標記基因的質粒⑤目的基因⑥四種脫氧核苷酸③⑥ B.②④ C.①⑤ D.①②④下列關于目的基因導入受體細胞的描述，不正確的是（）基因槍法導入植物體細胞的方法比較經(jīng)濟有效顯微注射技術是轉基因動物中采用最多的方法大腸桿菌最常用的轉化方法是：使細胞的生理狀態(tài)發(fā)生改變農桿菌轉化法是將目的基因導入植物細胞最常用的方法下列技術依據(jù)DNA分子雜交原理的是（）①觀察DNA在細胞中的分布

檢測目的基因是否導入細胞檢測目的基因是否完全轉錄并翻譯檢測目的基因是否進行轉錄②③ B.①③ C.②④ D.①④如圖為表達載體的模式圖，若結構X是表達載體所必需的，則X最可能是（）氨芐青霉素抗性基因啟動子限制酶DNA連接酶基因工程利用某目的基因（圖甲）和P1噬菌體載體（圖乙）構建重組下列分析錯誤的DNA。是（限制性核酸內切酶的酶切位點分別是BglH>EcoRI和Sau3AI下列分析錯誤的DNA。是（構建重組DNA時，可用BglII和Sau3AI切割目的基因和P1噬菌體載體構建重組DNA時，可用EcoRI和Sau3AI切割目的基因和P1噬菌體載體圖乙中的P1噬菌體載體只用EcoRI切割后，含有2個游離的磷酸基團用EcoRI切割目的基因和P1噬菌體載體，再用DNA連接酶連接，只能產生一種重組DNA利用外源基因在受體細胞中表達，可生產人類所需要的產品。下列選項中能說明目的基因完成了在受體細胞中表達的是（）A.棉花二倍體細胞中檢測到細菌的抗蟲基因B.大腸桿菌中檢測到人胰島素基因及其mRNA。山羊乳腺細胞中檢測到人生長激素DNA序列酵母菌細胞中提取到人干擾素蛋白（江蘇高考）下列關于基因工程技術的敘述，錯誤的是（多選）（）切割質粒的限制性核酸內切酶均特異性地識別6個核苷酸序列PCR反應中溫度的周期性改變是為了DNA聚合酶催化不同的反應載體質粒通常采用抗生素合成基因作為篩選標記基因抗蟲基因即使成功地插入到植物細胞染色體上也未必能正常表達用某人的胰島素基因制成的DNA探針，能與之形成雜交分子的是（）①該人胰島A細胞中的DNA②該人胰島B細胞中的mRNA③該人胰島A細胞中的mRNA④該人肝細胞中的DNAA.①③④ B.①②③ C.①②④ D.②某研究所的研究人員將生長激素基因通過質粒導入大腸桿菌細胞，使其表達，產生生長激素。已知質粒中存在兩個抗性基因：A是抗鏈霉素基因，B是抗氨芐青霉素基因，且目的基因要插入到基因B中，而大腸桿菌不帶有任何抗性基因。下列敘述正確的是（）導入大腸桿菌的質粒一定為重組質粒RNA聚合酶是構建該重組質粒必需的工具酶可用含氨芐青霉素的培養(yǎng)基檢測大腸桿菌中是否導入了重組質粒

在含氨芐青霉素的培養(yǎng)基中不能生長，但在含鏈霉素培養(yǎng)基中能生長的可能是符合生產要求的大腸桿菌二、非選擇題(共30分)(10分)農業(yè)科技工作者在煙草中找到了一種抗病基因，現(xiàn)擬采用基因工程技術將該基因轉入棉花，培育抗病棉花品系。請回答下列問題：為了能把該抗病基因轉入到棉花細胞中，常用的載體是 。要使載體與該抗病基因連接，首先應使用進行切割。假如載體被切割后，得AATTC-到的分子末端序列為 ，；一，則能與該載體連接的抗病基因分子末端是 (填序號)。-GA.--GA.-CTTAA-TB.-AATCC-CTTTAC.-G-AAATCD.-T大腸桿萌圖所示。根據(jù)題意，回答下列問題:大腸桿萌圖所示。根據(jù)題意，回答下列問題:(1)基因工程的操作程序主要包括的四個步驟是：切割完成后，用酶將載體與該抗病基因連接起來，連接后得到的DNA分子稱為。再將連接得到的DNA分子導入農桿菌，然后用該農桿菌去棉花細胞，利用植物細胞具有的性進行組織培養(yǎng)，從培養(yǎng)出的植株中出抗病的棉花。該抗病基因在棉花細胞中表達的產物是()A.淀粉 B.脂類 C.蛋白質 D.核酸轉基因棉花獲得的是由該表達產物來體現(xiàn)的。(12分)科學家將動物體內能夠合成胰島素的基因與大腸桿菌的DNA分子重組，并且在大腸桿菌體內表達成功。請據(jù)圖回答問題：該基因工程操作是采取的方法獲取目的基因(即 基因)的。圖中①DNA以模板，形成單鏈DNA，在酶的作用下合成雙鏈DNA，從而獲得所需要的目的基因。②代表，在它的作用下將質粒(DNA)切出黏性末端。圖中③代表，它往往含有 基因，以便對目的基因進行檢測。圖中④表示，為使此過程順利進行，一般需將大腸桿菌用處理，以增大其細胞壁的(6)圖中⑤表示隨大腸桿菌的繁殖而進行增殖，此基因在大腸桿菌內表達的標志是 。(8分)科學家通過基因工程方法，將蘇云金芽孢桿菌的Bt毒蛋白基因轉入普通棉株細胞內，并成功實現(xiàn)了表達，從而培育出了能抗棉鈴蟲的棉花植株一一抗蟲棉。其過程大致如、。、Ti質粒是農桿菌中的一種質粒，其上有、T-DNA,把目的基因插入Ti質粒的T-DNA中是利用T—DNA 的特點。Bt毒蛋白基因轉入普通棉株細胞內并成功實現(xiàn)表達的過程，在基因工程中稱為 。將目的基因導入受體細胞的方法有很多種，該題中涉及的是 。目的基因能否在棉株體內穩(wěn)定存在和表達其遺傳特性的關鍵是,這需要通過檢測才能知道，檢測常采用的方法。答案1.選A對目的基因(DNA片段)進行復制利用的是DNA聚合酶而不是DNA連接酶，DNA連接酶是將DNA片段連接時所使用的酶，DNA聚合酶是將單個脫氧核苷酸連接成一條鏈所使用的酶。選A重組DNA分子包括兩部分：載體DNA和目的基因DNA。同一種限制酶切割載體DNA和目的基因DNA，DNA連接酶將兩者連接，而載體上往往帶有標記基因。RNA聚合酶用于RNA的形成，四種脫氧核苷酸則用于DNA的形成。選A目的基因導入植物體細胞常用的方法是農桿菌轉化〉去該方法比較經(jīng)濟有效，此外還有基因槍法和花粉管通道法；目的基因導入動物細胞常用的方法是顯微注射法；大腸桿菌細胞最常用的轉化方法就是用Ca2+處理細胞，使細胞的生理狀態(tài)發(fā)生改變，完成轉化過程。選C觀察DNA在細胞中的分布的基本方法是利用甲基綠對細胞中的DNA分子進行染色，再利用顯微鏡進行觀察。目的基因是否導入以及是否轉錄出相應的RNA，一般是利用放射性同位素作標記(標記目的基因)，是利用DNA分子雜交原理來實現(xiàn)的。最后檢測目的基因是否翻譯出蛋白質，其方法很多，一般是利用抗原一抗體雜交的原理來實現(xiàn)。選B由X的位置可以判斷其為啟動子。啟動子是表達載體所必需的功能是啟動插入基因的轉錄過程。氨芐青霉素抗性基因可以作為標記基因，但不是必需的標記基因。限制酶和DNA連接酶都不是表達載體所需要的。選D從圖甲看出，用EcoRT切割目的基因后兩端各有一切口，與圖乙中EcoRT切口對接時，可有兩種可能，即可產生兩種重組DNA。選D目的基因的表達是指在受體細胞中產生了目的基因所控制合成的蛋白質。在受體細胞中檢測到目的基因或其轉錄產物RNA，并不能表明目的基因已經(jīng)成功表達。.選ABC限制性核酸內切酶大多是特異性識別6個核苷酸序列，但也有識別序列由4、5或8個核苷酸組成的，A錯誤；PCR中耐高溫的DNA聚合酶只是在延伸階段發(fā)揮催化作用，B項錯誤；載體質粒上抗生素抗性基因可作為標記基因供重組DNA的鑒定和選擇，不是抗生素合成基因，C錯誤；目的基因導入了受體細胞不一定就都能正常表達D正確。.選C人的胰島素基因存在于人的所有體細胞中因此該人胰島A細胞和肝細胞中均含有胰島素基因，可與用胰島素基因制成的DNA探針形成雜交分子。該人胰島B細胞中的mRNA有一部分是由胰島素基因轉錄形成的也能與用胰島素基因制成的DNA探針形成雜交分子。選D基因操作過程中，用同一種限制酶分別切割生長激素基因所在的DNA分子和質粒后，會產生相同的黏性末端，黏性末端連接時，目的基因和目的基因、目的基因和質粒、質粒和質粒都可能連接，因此，導入大腸桿菌的質粒不一定為重組質粒。構建該重組質粒必需的工具酶是限制酶和DNA連接酶。目的基因插入到基因B中后形成的重組質粒的抗氨芐青霉素基因被破壞，故導入了重組質粒的大腸桿菌對氨芐青霉素不具有抗性，對鏈霉素仍具有抗性。答案：（1）Ti質粒（2）限制酶A（3）DNA連接重組DNA（4）感染全能篩選⑸C（6）抗病性狀答案：（1）人工合成胰島素（2）胰島素信使RNA反轉錄（3）限制酶環(huán)狀（4）重組DNA分子標記（5）將目的基因導入受體細胞Ca2+通透性（6）目的基因大腸桿