GFP轉染哺乳動物細胞實驗和細胞的傳代培養實驗

實驗課流程安排1.分組：A1~AD162.移液槍的介紹和熟悉:三種規格的移液槍（P1000,P200,P20）；刻度的調節；Tip頭的使用。3.

實驗內容簡介4.實驗原理和應用的介紹【轉染（轉染方式的介紹；脂質體轉染的原理；LTX脂質體的特點）；熒光蛋白、表達質粒及其應用】5.轉染的實驗步驟6.實驗的時間安排和注意事項（超凈臺操作）7.熒光顯微鏡的使用及注意事項8.細胞傳代操作9.實驗總結GFP轉染哺乳動物細胞實驗實驗目的理解細胞轉染的原理，掌握細胞轉染的操作步驟學習熒光顯微鏡的結構、操作及注意事項學習超凈臺內操作及注意事項back材料轉染(transfection)指真核細胞由于外源DNA摻入而獲得新的遺傳標志的過程pEGFP-N1載體帶有熒光蛋白的空質粒（看作攜有外源基因的質粒）HeLaCells人宮頸癌細胞系是一種人工培養，具有無限增殖能力的細胞，1951年誕生至今已經整整60年了。在醫學界，HeLa細胞被廣泛應用于腫瘤研究、生物實驗或者細胞培養，已經成為醫學研究中非常重要的工具。HilyMax基因轉染試劑日本研發的一種新型陽離子脂質體貼壁或懸浮細胞的瞬轉及穩轉適用于含血清的培養基，毒性低，效率高且穩定適用于siRNAOpti-MEM?Opti-MEM?無血清培養基是EMEM的改良型，其中使用了HEPES和碳酸氫鈉進行緩沖，并添加次黃嘌呤、胸苷、丙酮酸鈉、L-谷氨酰胺、微量元素和生長因子。在含血清培養基中生長的大多數細胞都能轉移到Opti-MEM?培養基中。操作步驟1．細胞準備：密度40%-90%2．形成DNA-HilyMax轉染復合物：3ul質粒，3ul脂質體，120ul培養液(混合后在室溫下靜置15-25分鐘)3．添加轉染復合物至細胞培養皿中4．培養：放置于37℃，CO2培養箱培養5．檢測：轉染后24至72小時觀察要求:每小組不得超過5分鐘(看好時間)戴口罩、穿鞋套入內；操作前手用75%酒精消毒。在超凈臺內進行關于轉染（transfection）關于熒光蛋白關于脂質體轉染法實驗原理和應用的介紹關于轉染（transfection）Transfectionistheprocessofdeliberatelyintroducingnucleicacidsintocells.Thetermisusednotablyfornon-viralmethodsineukaryoticcells.Geneticmaterial(suchassupercoiledplasmidDNAorsiRNAconstructs),orevenproteinssuchasantibodies,maybetransfected.Transfectionofanimalcellstypicallyinvolvesopeningtransientporesor"holes"inthecellmembrane,toallowtheuptakeofmaterial.DNA小片段插入體細胞或細胞系的過程，指真核細胞由于外源DNA摻入而獲得新的遺傳標志的過程

轉化(transformation)指將質粒或其他外源DNA導入處于感受態的宿主細胞，并使其獲得新的表型的過程轉染(transfection)指真核細胞由于外源DNA摻入而獲得新的遺傳標志的過程轉導(transduction)由噬菌體將一個細胞的基因傳遞給另一細胞的過程。它是細菌之間傳遞遺傳物質的方式之一，其具體含義是指一個細胞的DNA或RNA通過病毒載體的感染轉移到另一個細胞中瞬轉若此DNA未與宿主細胞DNA整合而獲表達，稱“瞬時轉染(transienttransfection)外源DNA不整合到宿主染色體中，因此一個宿主細胞中可存在多個拷貝數，產生高水平的表達。細胞可以快速表達，迅速合成小量蛋白，但通常只持續幾天。適用于驗證質粒表達和監測轉染步驟的效率。可以用報告基因確定優化條件。穩轉若與宿主細胞DNA整合并隨后者的復制而復制稱“穩定轉染(stabletransfection)大部分外源DNA會被核酸酶降解或隨細胞分裂而稀釋，僅小部分整合到基因組上。穩定轉染的細胞系形成需數周。需要用抗藥性篩選，并酶切測序鑒定。Chemical-basedtransfection：calciumphosphate

；liposomes

Nonchemicalmethods：Electroporation

Particle-basedmethods：genegun

Viralmethods：viraltransduction

Other(andhybrid)methods：nucleofection；heatshock.

轉染的方法TherearevariousmethodsofintroducingforeignDNAintoaeukaryoticcell脂質體（liposome）是磷脂分散在水中時形成的脂質雙分子層，又稱為人工生物膜。最初，人們只是運用脂質體模擬生物膜，研究膜的構造及功能，而發現了膜的融合及內吞作用，因而可用作外源物質進入細胞的載體。

陽離子脂質體表面帶正電荷，能與核酸的磷酸根通過靜電作用將DNA分子包裹人內，形成DNA一脂復合體，也能被表面帶負電荷的細胞膜吸附，再通過膜的融合或細胞的內吞作用，偶爾也通過直接滲透作用，將DNA傳遞進入細胞。

其中一小部分DNA能從包涵體內釋放，并進入細胞質中，再進一步進入核內轉錄、表達轉染對細胞的要求：被用于作靶基因轉染的細胞，其生長狀態如何，將直接決定了基因轉染效率。如為貼壁生長的細胞，一般要求在轉染前一日，必需應用胰酶處理成單細胞懸液，重新接種于培養皿或瓶，細胞密度以鋪滿培養器皿的60%為宜，轉染當日，在轉染前4小時換一將近新鮮培養液。對于懸浮細胞，也需在轉染前4小時換一次新鮮培養液

轉染對DNA的要求：

用于轉染的質粒DNA必須無蛋白質、無RNA和其它化學物質的污染，OD260/280比值應在1.8以上。應用酚-氯仿抽提法制備的質粒DNA一般難以達到此標準，目前大多采用進口的提取純化試劑盒

靶基因被導入細胞后，一般在轉染后24～72小時，可在細胞內進行靶基因表達的檢測等實驗。如若建立穩定的細胞系，則可對靶細胞進行篩選，根據不同基因載體中所含有的抗性標志選用相應的藥物，最常用的直核表達基因載體的標志物有潮霉素（hygromycin）和新霉素（neomycin）

DNA----脂質體+++++++++++細胞———————————————————報告基因是一種編碼可被檢測的蛋白質或酶的基因,是一個其表達產物非常容易被鑒定的基因.把它的編碼序列和基因表達調節序列相融合形成嵌合基因,或與其它目的基因相融合,在調控序列控制下進行表達,從而利用它的表達產物來標定目的基因的表達調控常用的報告基因系統:

半乳糖苷酶報告系統熒光素酶報告系統熒光蛋白報告系統(GFP)等綠色螢光蛋白(greenfluorescentprotein)，簡稱GFP，最早在一種學名Aequoreavictoria的水母中發現。其基因所產生的蛋白質是一個由238個氨基酸殘基組成的單鏈，在藍色波長范圍的光線激發下，會發出綠色螢光由水母Aequoreavictoria中發現的野生型綠色螢光蛋白，395nm和475nm分別是最大和次大的激發波長，它的發射波長的峰點是在509nm，在可見光綠光的范圍下是較弱的位置。由海腎(seapansy)所得的綠色螢光蛋白，僅有在498nm有一個較高的激發峰點GFP的化學性質相當穩定，其變性需要在90℃或pH<4或pH>12的條件下用6mollL鹽酸胍處理GFP的生色基團附著于α-螺旋上，是蛋白質自身催化環化的結果，由于環化是一個有氧過程，O2使Tyr66脫氫氧化形成生色團。因此在嚴格厭氧條件下GFP不能形成熒光

關于熒光蛋白(reportergene)利用DNA重組技術，將目的基因與GFP基因構成融合基因，轉染合適的細胞進行表達，然后借助熒光顯微鏡便可對標記的蛋白質進行細胞內活體觀察。由于GFP相對較小，只有238個氨基酸，將其與其他蛋白融合后不影響自身的發光功能除用于特定蛋白的標記定位外，GFP亦大量用于各種細胞器的標記如細胞骨架、質膜、細胞核等等GFP還常被用作熒光探針。利用信號轉導中信號分子的遷移功能，將熒光蛋白與信號分子相偶聯，根據熒光蛋白的分布情況即可推斷信號分子的遷移狀況，并推斷該分子在遷移中的功能

例：在一96孔板中培養細胞，并以一編碼hGRGFP蛋白的質粒轉染該細胞。當細胞用待篩選的藥物處理后，hGR-GFP從細胞質遷移人細胞核的過程可實時或在某一時段內被證實，根據熒光分布即可推斷哪一種藥物具有與hGR配體相類似的功能關于熒光蛋白pEGFP-N1載體具有以下幾方面特點：①該質粒具有很強的復制能力，可以滿足隨宿主細胞分裂時跟隨胞質遺傳給新生的子細胞，這是保證目的基因穩定表達的因素之一②含有高效的功能強大的啟動子SV40和PCMV，可以使目的基因在增殖的細胞中穩定表達③具有多克隆位點，便于目的基因的插入④該載體具有neo基因，可以采用G418來篩選已成功轉染了該載體的靶細胞這些特殊的結構可以實現目的基因在靶細胞內的穩定表達back載體名稱：pEYFP-C1載體類型：哺乳動物細胞表達載體載體大小：4.7kb

載體宿主：大腸桿菌，哺乳動物細胞（E.coli,Mammaliancells）細菌抗性：卡納（kan）真核篩選標記：新霉素（Neomycin）5'測序引物：EGFP-NSequencingPrimer(#6479-1)3'測序引物：EGFP-CSequencingPrimer(#6478-1)載體描述：encodesanenhancedyellow-greenvariantoftheAequoreavictoriagreenfluorescentprotein(GFP).該載體表達一個增強信號的黃色螢光蛋白，插入的外源基因位于黃色螢光蛋白基因的3端，因此表達的蛋白為螢光蛋白在N端，外源基因在C端。該類載體可用于檢測蛋白的定位，分析蛋白在細胞中的運輸，以及不同蛋白的共定位等等

pEYFP-C1,PEGFP-N1兩個載體都是可以用來表達融合熒光蛋白的目的蛋白載體，只是pEYFP-C1靶蛋白結合在C端,而pEGFP-N1的靶蛋白結合在N端，在用pEYFP-C1構建熒光蛋白融合表達載體時，目的基因直接連在多克隆位點后，很方便，而在用pEGFP-N1構建熒光蛋白融合表達載體時,需要把目的基因后的終止密碼子去掉,并且讀碼框要和熒光蛋白的起始密碼子相匹配。ImportantGuidelinesforTransfectionwithLTX?Theadditionofantibioticstomediaduringtransfectionmayresultincelldeathinsomecelllines.Testeachcelllineindividually.?Visit/transfectionforspecializedtransfectionprotocols(includingcell-typespecificadviceonuseofantibiotics,andaprotocolforvector-basedRNAi).?WerecommendOpti-MEM?IReducedSerumMediumtodilutetheDNAandLipofectamine?LTXReagentbeforecomplexing.?Maintainthesameseedingconditionsbetweenexperiments.Transfectioncanbeperformedbothinthepresenceorabsenceofserum.1.6ml400mlback實驗目的1、通過熒光顯微鏡觀察細胞內的熒光蛋白，從而掌握熒光顯微鏡的使用2、熟練掌握動物細胞的傳代培養和細胞計數3、學會相關實驗結果的分析熒光蛋白顯微觀察和細胞的傳代培養實驗（二）

熒光蛋白顯微觀察和細胞的傳代培養實驗（二）

傳代培養的實驗原理

傳代培養是組織培養常規保種方法之一。也是幾乎所有細胞生物學實驗的基礎。當細胞在培養瓶中長滿后就需要將其稀釋分種成多瓶，細胞才能繼續生長。這一過程就叫傳代。傳代培養可獲得大量細胞供實驗所需。傳代要在嚴格的無菌條件下進行，每一步都需要認真仔細的無菌操作(本次實驗因條件限制，只能在一個模擬的環境下進行實驗)

貼壁細胞消化后的應用：

除了繼續傳代培養外，貼壁細胞消化后還可有許多其他的應用。1、計數、計算細胞活力，了解細胞的生長狀況。2、制備細胞懸液，以備后期的繼續實驗。（重新鋪板，MTT實驗；標記、流式分析、分選；爬片、免疫熒光；電轉；提取和分離；洗滌、動物注射等）**此步常省略一）細胞的傳代和計數的實驗步驟實驗內容1．倒置顯微鏡下觀察細胞形態，確定細胞是否需要傳代。2．關閉超凈臺紫外燈，打開風機和照明。在超凈臺中用吸去培養皿中原有的細胞培養液。3．培養皿中加入1-2mL高壓滅菌過的PBS，以洗去培養液的殘留（培養液中的血清會抑制胰酶的消化作用）。洗滌可進行1～2次。4．吸去PBS，加入200μl0.125％～0.25％的胰蛋白酶，蓋上蓋子，輕輕搖晃，使胰酶能均勻地作用于所有皿底的細胞。室溫或37°C放置1～2分鐘，倒置顯微鏡下觀察，當觀察到細胞收回突起變圓時可于超凈臺中立即加入800μl的含血清的新鮮培養基（可37℃預熱），終止胰酶的作用，經反復吹打，制成細胞懸液。5．細胞懸液制成后，即可進行傳代。傳代可按照1傳2或者1傳3等比例進行，也可在完成計數后，按一定的細胞量進行傳代。細胞計數時，如果懸液的細胞濃度過大，需先按一定比例稀釋后，再進行計數。通過細胞計數還可計算出細胞的活力。以稀釋10倍為例，取10μl細胞懸液，加入到裝有40μlPBS的Ependorf管中，再加入50μl0.4%臺盼藍溶液，混勻后吸出10μl加到計數板上進行一次計數，最終的細胞數要乘以10。另外，懸液也可收集到管中，離心后用PBS洗滌。完成3次細胞計數，計算細胞總數、活細胞數、細胞活力。將2.5

104個活細胞傳35mm的培養皿。Facilitiesforcountingcells

細胞記數細胞數/ml原液=（4大格細胞數之和/4）×104

×稀釋倍數Quantitationofcellviabilitybytrypanblueexclusion.Mixasmallaliquotofcellsuspensionwithanequalvolumeof0.4%trypanbluesolution.實驗結果和記錄一、每個實驗組實驗結果記錄表格實驗組（2.1）計數123細胞總數活細胞數細胞活力平均活力二、繪制細胞存活曲線（略）二）熒光蛋白顯微觀察實驗內容轉染試劑：LipoLTX細胞：HeLaDNA轉染量：0.6μg。20X實驗結果和記錄細胞熒光表達率的數學統計分析實驗組（A1-1）視野123細胞總數綠色熒光細胞轉染效率平均轉染效率實驗組（2.1~2.5）組內均值組內偏差12345平均轉染效率實驗思考

1．什么是轉染？有多少種方式？2．本次實驗用的脂質體轉染其原理是什么?有什么特點？3．試比較Lipo2000和LipoLTX的區別。4．細胞傳代培養的目的是什么?5．如何保證在傳代過程中不被微生物污染?6．貼壁細胞和懸浮細胞傳代方法上有什么不同?7.用轉染、細胞培養以及傳代技術能解決哪些研究問題？徠卡DMI3000B倒置熒光顯微鏡熒光顯微鏡的原理、構造

熒光顯微鏡與普通光學顯微鏡不同，它不是通過普通光源的照明觀察標本，而是利用一定波長的光(通常是紫外光、藍紫光)激發顯微鏡下標本內的熒光物質，使之發射熒光，所以，熒光顯微鏡的光源所起的作用不是直接照明，而是作為一種激發標本的內熒光物質的能源。我們之所以能觀察標本，是由于光源的照明，而是標本內熒光物質吸收激發的光能后所呈現的熒光現象。

由此可知，熒光顯微鏡的特點，主要是它的光源能供給大量特定波長范圍的激發光，使受檢標本內的熒光物質能獲得必要強度的激發光。同時，熒光顯微鏡必須具備相應的濾光鏡系統。它是由超高壓光源、濾片系統、光學系統和攝影系統等主要部件組成。12345101146（1）－投射電源開關（2）－聚光器（3）－載物臺（4）－物鏡（5）－調焦操縱輪（6）－透射光檔片（10）－載物臺操縱輪（11）－CCD光路活動桿徠卡DMI3000B倒置熒光顯微鏡（9）－熒光轉盤（7）－熒光獨立電源（8）－熒光光柵拉桿（2）－聚光器（3）－載物臺（4）－物鏡（5）－調焦操縱輪2345789徠卡DMI3000B倒置熒光顯微鏡明場：1．打開右下方顯微鏡透射光電源（1）。2．設置聚光器（2），若只需要普通的明場觀察，將聚光器設置為“BF”。若需進行相差觀察，按所選擇的物鏡放大倍數將聚光器設置為“PH1”(10×、20×)或“PH2”(40×)。3．將所需觀察的標本置于載物臺上（3）。4．選擇你要用的物鏡（4）(4×、10×、20×、40×)。5．利用調焦操縱輪（5）聚焦和觀察圖像。6．若尚需采集圖像，見操作步驟13“圖像采集操作”。徠卡DMI3000B倒置顯微