實(shí)驗(yàn)酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)蔗糖酶米氏常數(shù)的測(cè)【目的要求】1．了解酶促動(dòng)力學(xué)研究的范圍。以蔗糖酶為例，掌握測(cè)定米氏常數(shù)(Km)【實(shí)驗(yàn)原理】在酶促反應(yīng)中，當(dāng)反應(yīng)體系的溫度、pH和酶濃度恒定時(shí)，反應(yīng)初速度(v)則隨底物濃度[S]的增加而加速，最后達(dá)到極限，稱為最大反應(yīng)速度(v)。Michaelis和Menten根據(jù)反應(yīng)速度與底物濃度的這種關(guān)系，推導(dǎo)出如下方程：V[S]v二

k+[S]

m此式稱為米氏方程，式中Km稱為米氏常數(shù)，按此方程，可用作圖法求出Km。方法有：1?以v[S]作圖由米氏方程可知，v=V/2時(shí)，Km=[S]即米氏常數(shù)值等于反應(yīng)速度達(dá)到最大反應(yīng)速度一半時(shí)所需底物濃度。因此，可測(cè)定一系列不同底物濃度的反應(yīng)速度v,以v對(duì)[S]作圖。當(dāng)v=V/2時(shí)，其相應(yīng)底物濃度即為Km。2.以1/v對(duì)1/[S]作圖取米氏方程的倒數(shù)式：1k1 1———? —vV[S]V以1/v以1/v對(duì)1/[S]作圖可得一直線，其斜率為Km/V，截距為1/V。若將直線延長(zhǎng)與橫軸相交，則該交點(diǎn)在數(shù)值上等于一I/Km。丄AVm=Ko/V—"-一’心〕m本實(shí)驗(yàn)以蔗糖為底物.利用一定量蔗糖酶水解不同濃度蔗糖所形成的產(chǎn)物(葡萄糖和果糖)的量來(lái)計(jì)算蔗糖酶的Km值。葡萄糖和果糖能與3，5一二硝基水楊酸試劑反應(yīng)，生成桔紅色化合物，可于520nm處比色測(cè)定之。【試驗(yàn)材料】試劑(1)標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液：準(zhǔn)確稱取100mg葡萄糖溶于少量飽和的苯甲酸溶液%)，再轉(zhuǎn)移到100ml容量瓶中，用飽和苯甲酸溶液稀釋到刻度，混勻，即得濃度為1mg/m1的標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液。冰箱貯藏可長(zhǎng)期保存；⑵的L醋酸緩沖液：取Imol/L醋酸鈉溶液43m1及l(fā)mol/L醋酸溶液57m1,稀釋至1000m1即得；的10％蔗糖溶液：準(zhǔn)確取l0g蔗糖溶于少量的/L醋酸緩沖液，轉(zhuǎn)移到100ml容量瓶中，用同樣緩沖液稀釋到刻度備用；3，5—二硝基水楊酸試劑：溶液I：％NaOH溶液300m1，1％3，5一二硝基水楊酸溶液880m1及酒石酸鉀鈉(KNaC4O6?4H20)255g三者一起混合均勻。溶液II：取結(jié)晶酚10g及Io%NaOH溶液22m1，加蒸餾水稀釋成100ml，混勻。溶液III：取溶于64ml溶液n中。將溶液皿和溶液I混合，激烈振搖混勻，即得3，5—二硝基水楊酸溶液，放置一周后備用。酵母蔗糖酶溶液：稱取鮮酵母I0g于研缽中，加少量細(xì)砂及10一15ml蒸餾水研磨。磨細(xì)后置冰箱中，過(guò)濾，濾液加2—3倍體積冷丙酮，攪拌均勻后離心，沉淀用丙酮洗兩次，真空干燥得固體粉末狀酶，再溶于100ml蒸餾水，即得酶溶液。若有不溶物可用離心法除去。該酶液活力以6—12單位為佳。蔗糖酶活力單位的定義為：在一定條件下反應(yīng)5min，每產(chǎn)生lmg葡萄糖所需要的酶量。備用。2．器材100m1三角燒瓶2只；研缽1只；50m1及100m1容量瓶各1只；⑷離心機(jī)1臺(tái)(4000rpm)；糖管8支；恒溫水浴1臺(tái)；吸量管：X2支；秒表1只；(9)72l型分光光度計(jì)1臺(tái)。【實(shí)驗(yàn)方法】1．標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制取干凈糖管6支，如下表所示添加試劑。-管號(hào)試劑012345標(biāo)準(zhǔn)匍萄糖溶液，ml蒸餾水， ml3,5二硝基水楊酸液，ml0加畢混勻.于沸水中準(zhǔn)確煮5min，取出用自來(lái)水冷卻3min，稀釋至25ml，混勻后以零號(hào)管調(diào)零點(diǎn)，于520nm處測(cè)定吸光度。以葡萄糖含量為橫坐標(biāo)，以吸光度為縱坐標(biāo)作圖。2.根據(jù)活力選擇酶濃度將10%蔗糖溶液稀釋成的％的溶液，取此溶液5m1于試管中，共加兩管。將兩管同時(shí)置于25水浴中保溫5min，然后向管中加入蔗糖酶溶液，立即混勻，同時(shí)用秒表計(jì)時(shí)，準(zhǔn)確反應(yīng)5min后，立即加入LNaOH溶液終止酶反應(yīng)。另一管先加入溶液，再加入蔗糖酶溶液(此為對(duì)照管)。取干凈糖管3支，第l、2管分別加入上述反應(yīng)液各及水各，第3管加蒸餾水，然后各管均加二硝基水楊酸溶液。置沸水浴中煮5min,取出后經(jīng)自來(lái)水冷卻3min,加水至25m1,混勻，以第3管調(diào)零點(diǎn)，于520nm處測(cè)吸光度值。以測(cè)定管的吸光度值減去對(duì)照管吸光度值，求得的差值從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得相應(yīng)的葡萄糖含量，并乘以II,即為每1ml酶溶液的活力。測(cè)定管中因酶催化水解而產(chǎn)生的葡萄糖含量以在—之間為佳，過(guò)高或過(guò)低均應(yīng)適當(dāng)改變蔗糖酶溶液的濃度或反應(yīng)液用量后再測(cè)。3．底物濃度對(duì)酶促反應(yīng)速度的影響——米氏常數(shù)購(gòu)測(cè)定取試管7支，按下表所示加入試劑。管號(hào)12345 右7mJ0.51.0K52.D3.755.0ptU*幣蘆最沖液*ml4.54.03.53.a2.51,250醉誹薦融酵磐啟，nJJOi+01.01.01.0LU1.0加「；戒冇V準(zhǔn)確阪應(yīng)血旳O.lmcVLNhOH寓瓶.nd5.05川5.05.05.05.0當(dāng)加完蔗糖溶液及醋酸緩沖液后，均放置室溫或恒溫水浴（20°C或25°C）保溫5min，再分別依次向各管加入蔗糖酶溶液，立即搖勻.記錄時(shí)間。準(zhǔn)確反應(yīng)5min，再準(zhǔn)時(shí)加入L的NaOH溶液，立即搖勻，以終止反應(yīng)。測(cè)定管反應(yīng)完成后，取8支潔凈糖管，前7支分別加入相應(yīng)的上述反應(yīng)液各及蒸餾水各，第8支糖管加入蒸餾水作空白，然后各管均加入二硝基水楊酸溶液，沸水浴5min。取出用自來(lái)水冷卻3min，稀釋到25m1，混勻，于520nm處比色測(cè)定并記錄吸光度值。對(duì)照管的測(cè)定與測(cè)定管的操作相同。【結(jié)果處理】根據(jù)各測(cè)定管的吸光度值（需減去相應(yīng)對(duì)照管的吸光度值），從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出相應(yīng)的還原糖毫克數(shù)（以在0.4—1.6mg范圍內(nèi)為佳，否則應(yīng)調(diào)整反應(yīng)液用量后重新測(cè)定），再乘以11,即得各管的產(chǎn)物量，然后分別計(jì)算各反應(yīng)管相應(yīng)的⑸、丨/⑸、v及1/v,并作出v—[S]及1/v—1/[S]曲線。再根據(jù)所作的兩種動(dòng)力學(xué)曲線，分別求出酵母蔗糖酶的Km值，并加以比較。上述數(shù)據(jù)可記錄在下表中。蟻號(hào)站J123A567辰魄度(v)=1葡瞬產(chǎn)Bxu]…10%XV^lOOfl”[創(chuàng)1/v■曲1心為薦帯甘子■°酵母蔗糖酶的提取實(shí)驗(yàn)原理：蔗糖酶主要存在于酵母中，但工業(yè)上通常從酵母中制取。酵母蔗糖酶系胞內(nèi)酶，提取時(shí)細(xì)胞破碎或菌體自溶。常用的提純方法有鹽析、有機(jī)溶劑沉淀、離子交換和凝膠柱層析。以此可得到較高純度的酶。細(xì)胞破壁的幾種方法1、高速組織搗碎：將材料配成稀糊狀液，放置于筒內(nèi)約1/3體積，蓋緊筒蓋，將調(diào)速器先撥至最慢處，開(kāi)動(dòng)開(kāi)關(guān)后，逐步加速至所需速度。2、玻璃勻漿器勻漿：先將剪碎的組織置于管中，再套入研桿來(lái)回研磨，上下移動(dòng)，即可將細(xì)胞研碎，此法細(xì)胞破碎程度比高速組織搗碎機(jī)為高，適用于量少和動(dòng)物臟器組織。3、反復(fù)凍融法：將細(xì)胞在-20度以下冰凍，室溫融解，反復(fù)幾次，由于細(xì)胞內(nèi)冰粒形成和剩余細(xì)胞液的鹽濃度增高引起溶脹，使細(xì)胞結(jié)構(gòu)破碎。4、超聲波處理法：用一定功率的超聲波處理細(xì)胞懸液，使細(xì)胞急劇震蕩破裂，此法多適用于微生物材料。5、化學(xué)處理法：有些動(dòng)物細(xì)胞，例如腫瘤細(xì)胞可采用十二烷基磺酸鈉(SDS)、去氧膽酸鈉等細(xì)胞膜破壞，細(xì)菌細(xì)胞壁較厚，可采用溶菌酶處理效果更好。有機(jī)溶劑沉淀法即向水溶液中加入一定量的親水性的有機(jī)溶劑可降低溶質(zhì)的溶解度使其沉淀被析出。三、試劑：啤酒酵母、二氧化硅、甲苯(使用前預(yù)冷到0€以下)、去離子水(使用前冷至4°C左右)、1mol/L醋酸、95%乙醇四、儀器：研缽1個(gè)、離心管3個(gè)、3.滴管3個(gè)、量筒50ml1個(gè)、水浴鍋1個(gè)、恒溫水浴、燒杯100ml2個(gè)、廣泛pH試紙、高速冷凍離心機(jī)四、操作步驟：1.提取準(zhǔn)備一個(gè)冰浴，將研缽穩(wěn)妥放入冰浴中。預(yù)先在冰箱中冷卻20g干酵母和10g二氧化硅。將20g干酵母粉和10g二氧化硅，放入研缽中。量取預(yù)冷的甲苯30ml緩慢加入酵母中，邊加邊研磨成糊狀，約需60分鐘。研磨時(shí)用顯微鏡檢查研磨的效果，至酵母細(xì)胞大部分研碎。緩慢加入預(yù)冷的40ml去離子水，每次加2ml左右，邊加邊研磨，至少用30分鐘。以便將蔗糖酶充分轉(zhuǎn)入水相。將混合物轉(zhuǎn)入兩個(gè)離心管中，平衡后，用高速冷離心機(jī)離心，4C，1