cDNA全長測序RNA提取實驗用品Trizol、氯仿、異丙醇、乙醇（75%，現用現配）、RNase—free水、大量酒精、冷凍離心機、1ml、200微升、10微升槍及槍頭、EP管、研缽、剪刀、藥匙、衛生紙、冰盒、口罩、手套、工作服、棉手套、計時器實驗步驟選活力良好的貽貝，迅速剪入研缽中（盡量剪碎），加入液氮，迅速研磨成粉末狀（研缽中可以事先加入液氮預冷）。粉末狀后迅速加入1mlTrizol，研磨均勻呈液體狀，0℃向1mlTrizol中加入0.2ml氯仿，用力振蕩15s（渦旋），室溫放置3min，4℃12000g將上層水相（約500微升）移至一干凈的EP管中，加入等體積（約600微升）異丙醇，混勻，輕輕顛倒幾下，-20℃放置10min。4℃小心棄上清（直接倒，然后反扣到干凈的衛生紙上），加入1ml75%乙醇，并混合樣品（要使樣品懸浮起來），4℃12000g重復步驟5，最后空轉一下，用槍盡量吸去剩余的酒精（在超凈工作臺上操作）。通風廚（工作臺）中干燥，聞不到酒精味即可（2-10min），加30-50微升（50微升）DEPC水，室溫20min，使RNA徹底溶解。0.1%瓊脂糖凝膠檢測（膠槽，膠板用酒精擦干凈，換新鮮電泳液），140V電泳10min檢測。（99V，33min）。紫外檢測，RNA溶液立即-70℃（動作要迅速，冰上操作，試驗前準備要充分）以下｛｝中的可以不操作｛組織樣品中總RNA中DNA的消除：（1）無RNA酶活性的DNase1（5u/uL）2uLRNaseInhibitor（40u/uL）0.5uL10×DNasebuffer5uL總RNA20-50uLDEPC水補充到50uL（2）37℃（3）加入50uLDEPC水（4）加入100uL（等量）的苯酚\氯仿\異戊醇25：24：1充分混勻（5）離心，取上層（水層）移至另一微量離心管中（6）加入10uL（1/10量）的3MNaOAC（PH=5.2）（7）加入250uL的冷無水乙醇，-20℃（8）離心回收沉淀，用70%的冷無水乙醇清洗沉淀，真空干燥（9）用適量的DEPC水溶解，電泳確認DNase1消化總RNA1-6uLBuffer1uL（RQ/RNase-Free10×ReactionBuffer）DNase2uL（RQ/RNase-FreeDNase）RNaseE抑制劑0.5uLor1uLNuclease-Free水調至10uL37℃每個體系中加入1uLstopsolution65℃反轉錄變性0.2mlPCR管中依次加入總RNA（處理過的）1-2ugoligo(dT)2uL70℃反轉錄在已完成變性反應的PCR管中依次加入5×M-MLV反應緩沖液5uL無RNase的dNTP（2.5mM）5uL最后加RNaseE抑制劑1uL（2.5u）M-MLV反轉錄酶1uL（200u）無RNase水調節總體積至25uL輕彈管壁稍離心42℃反轉錄1h95actin檢驗cDNA內參引物—actionR（反）ActionF（正）體系：10×Buffer（promega）2.5uL——事先4Mgcl2（25mMpromega）1.5uL——事先4dNTP（2.5mMeach）2.0uL正向引物（10mMF）1.0uL反向引物（10mMR）1.0uLTaqDNApolymerase(5u/uLTakara)0.2uLPCR水15.8uLcDNA1.0uLn管cDNA檢測：準備n個新小EP管，分別從反轉錄完的n個小離心管中吸取1uL到新EP管中，并把剩余的cDNA-20℃條件：94℃20×94℃60℃72℃72℃4℃四、3’—RACE一擴體系：10×Buffer2.5uLMgcl2（25mM）1.2uLdNTP(2.5mM)2.0uLU0.5水17.05cDNA(模板)1Taq0.25F(F1)（引物）0.5uL/管條件：94℃10×94℃60-56℃72℃20×94℃56℃72℃72℃16℃二擴體系：（5uL一擴產物稀釋100倍，即加495uL水，到500uL）10×Buffer2.5uLMgcl2（25mM）1.2uLdNTP(2.5mM)2.0uLU0.5水17.05Taq0.25F(F1)0.5uL/管稀釋后的模板1uL/管條件：94℃30×94℃56℃72℃72℃10min16五、電泳檢測（一）制膠一般，0.5g瓊脂糖+50mL配電溶液微波爐溶解冷卻后加10uLgenefinder混勻點樣一般，5uL樣品ormarker加到1uL預染液上預染液的配制：genefinder/loadingBuffer=1/9條件90-110V25-30min——？六、切膠純化1.計算膠體積0.1g—0.1ml×P250℃溶解7min至完全溶解（一般加200uL×P22.搖晃2-3min3.溶解膠加入吸附柱中（700uL以內）（吸附柱和EP管搭配使用）10000g離心1min棄液體4.加300uL×P210000g離心1min棄液體5.加700uLspw洗液10000g離心1min棄液體6.重復57.空轉13000g2min晾干酒精8.吸附柱放入干凈的EP管中，加30-50uLElutionBuffer（EB）室溫放置1min,13000g1min（注：加到白色區域，不能加到不壁上）9.洗脫下來的EB重新加入吸附柱內，重復8（最后要的是EP管中的）七、連接（一）DNA2uL載體0.5uLSolution12.5uL（二）—常用DNA4uL（PCR純化的產物）載體0.5uL（PMD18—Tsimple載體最后加且加到液面以下）Solution12.5uL（連接液1）16℃2h16℃pause（八、轉化（開水浴鍋）1.感受態細胞冰上化開（100uL）2.10uL連接產物加到感受態細胞中（加在液面以下），彈勻不要劇烈搖晃3.冰上放置30min4.42℃5.加入600uLLB培養基（無Amp）（100uL感受態—600uLLB）6.37℃搖床45min220rpm(先慢后快170rpm約10min)7.涂布平臺紫外滅菌開照明吹風點酒精燈涂布棒95%酒精酒精燈上消毒平板蓋上冷卻直到燙不化培養基為止先將菌液滴在LB固體培養基上，涂布棒涂均勻8.37℃9.4℃10.挑菌（飽滿單個白斑）一個基因挑8個克隆分別加在1ml含Amp的LB液體培養基中11.培養3-4hor1h3