苦瓜多糖脫蛋白方法的比較研究

杏仁是甘薯科的一種水果。它具有良好的食用價值和明顯的藥物功能，被稱為“植物”。苦瓜多糖作為苦瓜中含量較高的生物活性物質之一,引起了人們的極大興趣和廣泛關注。研究表明,苦瓜多糖具有降血糖、降血脂、抗腫瘤和提高人體免疫力的功效。天然植物中的多糖與蛋白質2種高分子成分往往共存,且常結合形成糖蛋白復合物,因此從粗多糖中脫除蛋白質較為困難。另外,植物多糖一般采用熱水浸提-乙醇沉法提取,所得粗多糖含較多游離的蛋白質,這對苦瓜多糖的分離純化帶來了很大的影響,不利于進一步對苦瓜多糖的結構及其生物活性的研究。因此,尋找一種盡可能多地除去苦瓜粗多糖中的蛋白質且有效保留多糖成分的方法已成為了一個突出的問題。對此,筆者就幾種脫蛋白方法進行了比較研究,探索了苦瓜多糖最佳脫蛋白工藝;并測定了脫蛋白前后苦瓜多糖的紫外光譜特性,以期為苦瓜多糖的開發利用提供一定的理論基礎。1材料和方法1.1試驗材料1.1.1牛血清蛋白、考馬斯亮藍g-25、葡萄糖標準品苦瓜,購于韶關農貿市場;木瓜蛋白酶(sigma公司)、牛血清蛋白(sigma公司)、考馬斯亮藍G-250、葡萄糖標準品;三氯乙酸、鹽酸、濃硫酸、蒽酮、氨水、三氯甲烷、磷酸、正丁醇、無水乙醇、乙醚、丙酮等均為國產分析純。1.1.2儀器、儀器和儀器721型紫外可見分光光度計,上海第三分析儀器廠;FA1104電子天平,上海精天電子儀器廠;DK-8D數顯電熱恒溫水槽,上海森信實驗儀器有限公司;EYELAN-1000旋轉蒸發儀,日本東京理化器械株式會社;ZK-828型電熱真空干燥箱,上海躍進醫療器械廠。1.2測試方法1.2.1提取液用量的提取苦瓜多糖的提取和制備參照文獻進行。稱取已干燥的苦瓜粉末10g,置索氏提取器中,加入石油醚100ml,90℃回流提取1h脫脂,抽濾,濾渣經揮干溶劑后,加入200ml80%乙醇于90℃下回流1h,過濾,離心。上清液濃縮至20ml,加入無水乙醇使醇沉濃度達80%,于4℃冰箱中醇沉過夜,離心,取沉淀,并依次用無水乙醇、丙酮、乙醚各洗滌2次,真空干燥至恒重,即得苦瓜粗多糖,備用。1.2.2脫蛋白質法(1)veing試劑苦瓜粗多糖溶液(50ml)以體積比1∶5加入Seveage試劑,混合物劇烈振搖15min離心(4000r/min,5min),除去水層和溶液層交界處的變性蛋白質。反復進行至無蛋白層,得到脫蛋白液。(2)脫蛋白液的制備苦瓜粗多糖溶液(50ml)用10%三氯乙酸調節其pH值至3,室溫下放置過夜,離心(4000r/min,5min),棄去沉淀,反復進行直至無沉淀,得到脫蛋白液。(3)西瓜蛋白酶脫蛋白液的制備苦瓜多糖溶液(50ml),調pH值至6.5,60℃下放置1h后,用1.25%(V/V)的木瓜蛋白酶55℃恒溫5h后,離心(4000r/min,5min),得到脫蛋白液。(4)西瓜蛋白酶脫蛋白液的制備苦瓜多糖溶液(50ml),調pH值至6.5,60℃下放置1h后,用1.25%(V/V)的木瓜蛋白酶55℃恒溫5h后,離心(4000r/min,5min),得上清液,上清液再經Seveage法脫蛋白,反復進行3次至無蛋白層,得到脫蛋白液。(5)脫蛋白液的制備苦瓜粗多糖溶液(50ml)+1mol/L鹽酸溶液,調pH值至3,4℃下放置12h后,離心(4000r/min,5min),得到脫蛋白液。1.2.3測試(1)測定了蛋白質含量以牛血清蛋白為標準品,采用考馬斯亮藍G-250測定。(2)測定了杏仁的糖含量以葡萄糖為標準品,采用蒽酮-濃硫酸法測定。測定脫蛋白后各多糖溶液中多糖含量、蛋白質含量,然后計算蛋白清除率和多糖損失率。2結果與分析2.1標準曲線的繪制蛋白質的測定方法有紫外分光光度法、Lowry法、雙縮脲法和考馬斯亮藍法。考慮考馬斯亮藍法具有使用方便、反應時間短、染色穩定、抗干擾性強等特點,筆者選用其作為蛋白質的測定方法。考馬斯亮藍G-250與蛋白質結合后變為青色,其結合物在595nm波長下有最大光吸收。其光吸收值與蛋白質含量成正比,因此可用于蛋白質的定量測定。以牛血清蛋白為標準品,做標準曲線,求得回歸方程。標準曲線見圖1。標準曲線的回歸方程為Y=0.0052X-0.0023,R2=0.9972,由圖1可見,標準品在0～100μg/ml范圍內呈良好的線性關系。此法試劑配制簡單,操作簡便快捷,反應靈敏,適合苦瓜粗多糖溶液中蛋白質含量的定量分析。2.2操作次數對多糖去除率和多糖損失率的影響由于苦瓜粗多糖中蛋白質含量高,Seveage法脫蛋白過程中需反復處理1～6次,分別測定每次脫蛋白粗多糖溶液中的蛋白及多糖含量,結果見圖2。由圖2可見,隨著操作次數的增加,蛋白質去除率也增加,3次后,蛋白質去除率即可達到50%以上;但操作次數的增加也會導致多糖的損失,3次后多糖損失率已達50%,其原因是每次除去蛋白質變性膠狀物時,不可避免地裹脅了部分多糖,另外那些與蛋白質相結合的蛋白聚糖和糖蛋白在處理時也可能會沉淀下來,從而造成了多糖損失。因此,采用Seveage法除蛋白,反復處理5次時,脫蛋白效率相對較高,但多糖損失率也較高,要將其控制在較理想的范圍較為困難。2.3果汁多糖的脫蛋白試驗結果酶法脫蛋白是利用酶的作用使蛋白質變性沉淀而分離。分別添加濃度為0.50%、0.75%、1.00%、1.25%、1.50%和2.00%(V/V)的木瓜蛋白酶于苦瓜粗多糖溶液中,測定脫蛋白后的蛋白質去除率和多糖損失率。木瓜蛋白酶法脫蛋白的試驗結果見圖3。由圖3可知,隨著木瓜蛋白酶濃度的升高,蛋白質去除率明顯增加,但是當用量達到1.25%后,蛋白質去除率效果變化不明顯,此時其蛋白質去除率約為50%;另一方面,木瓜蛋白酶濃度對多糖損失影響不大,損失率均較低,最高時僅為11.6%。綜合考慮,選擇木瓜蛋白酶的用量為多糖體積的1.25%較為合理。2.45果汁蛋白脫除率及多糖損失率該試驗對鹽酸法和三氯乙酸法脫蛋白效果進行了研究,其脫蛋白率和多糖損失率見圖4。由圖4可知,5種方法對苦瓜粗多糖提取液中蛋白質的脫除效果存在明顯差別,脫除率由大到小依次為:Seveage法(操作6次)>酶+Seveage法>鹽酸法>三氯乙酸法>酶法。Seveage法與酶+Seveage法在蛋白質脫除率方面的差別不大,都達到75%以上。5種方法中多糖損失率由低到高依次為:三氯乙酸法<酶法<酶+Seveage法<鹽酸法<Seveage法。由此可見,鹽酸法脫蛋白效果較好,但多糖損失率仍較高(48.2%)。此外,鹽酸為強酸,若實驗條件未得到嚴格控制,經鹽酸脫蛋白后,部分多糖很可能會降解。Seveage法脫蛋白,需要重復進行多次才能有較好的脫除效果,經6次處理后,蛋白質去除率達78.8%,而多糖損失率也高至60.8%。三氯乙酸作為一種有機酸,能使蛋白質變性沉淀,以達到脫除蛋白質的目的,但蛋白質去除率不高,僅50.8%。采用酶法和Seveage法結合使用的方法,既可以有效地脫除蛋白質,又能較好地保留多糖。經木瓜蛋白酶處理后,絕大部分游離蛋白質及部分與多糖結合的蛋白質被水解,因此多糖沉淀中蛋白質的含量大為降低,且酶解后只需用Seveage試劑處理1～2次即可將蛋白質有效除去,從而能減少多糖的損失。因此,酶和Seveage相結合法是比較理想的脫蛋白方法。2.5紫外-可見吸收光譜采用酶法和Seveage法結合脫蛋白。取脫蛋白前后的粗多糖在200～400nm做紫外-可見吸收光譜掃描,結果見圖5。由圖5可知,未經除蛋白處理的苦瓜粗多糖溶液在280nm處有明顯的蛋白特征吸收峰,而脫蛋白后在280nm處無特別明顯吸收峰,說明酶法和Seveage法結合脫蛋白的效果顯著。3脫蛋白法或酶法近年,植物多糖的藥理作用逐漸被人們所認識。但是,在研究植物多糖過程中,植物蛋白常影響植物多糖純度,以致其藥理研究出現較大差異。所以多糖脫蛋白是多糖純化的關鍵。該試驗結果表明,在Seveage法脫除蛋白質過程中,蛋白質與糖的變化趨勢相同。在脫除蛋白質的同時,多糖中的糖隨之損失,蛋白質和糖損失變化趨勢十分相似。此外,Seveage法脫蛋白使用的試劑是氯仿和正丁醇,而氯仿是有毒物質,容易造成多糖活性下降和溶劑殘留,可能影響其生物活性的研究,此方面仍需深入研究。值得注意的是,無論采用哪種脫蛋白方法,所得的多糖制品中都仍存在著20%以上的蛋白質成分。這可能