細胞融合與單克隆抗體CellFusionandMonoclonalAntibodies編輯ppt4.1細胞融合4.2雜種細胞的遺傳特性和應用4.3淋巴細胞雜交瘤和單克隆抗體技術編輯ppt4.1細胞融合4.11聚乙二醇介導的細胞融合4.12細胞電融合4.13雜種細胞的篩選編輯ppt4.1細胞融合定義：指用自然或人工方法、使兩個或更多個不同的細胞融合成一個細胞的過程，又稱為體細胞雜交編輯ppt4.11聚乙二醇〔PEG〕介導的細胞融合原理：PEG帶有大量的負電荷,和原生質體外表的負電荷在鈣離子的連接下，形成靜電鍵，促使異源的原生質體間的粘著和結合，在高pH,高鈣離子的溶液的作用下，將鈣離子和與質膜結合的PEG分子洗脫，導致電荷平衡失調并重新分配，使兩種原生質體上的正負電荷連接起來，進而形成具有共同質膜的融合體。編輯ppt影響因素：分子量：400—6000〔通常：1000—4000〕濃度：20—60%〔通常：30—50%〕時間：懸浮法1—2min離心法5—8minpH：偏堿為宜〔pH7.4—8.0〕其他：二甲亞砜、植物血凝素編輯ppt4.12細胞電融合原理：懸于大小不同的兩平行電極間的低導電率溶液中的細胞，在1—100MHz和100—1000V/cm的交流電場中，會向小電極移動，并極化成偶極子，而沿電場方向發生雙向電泳，此時再加上適當強度和持續時間的高壓電脈沖，即可使相鄰細胞膜的接觸區產生可逆電降解，從而觸發細胞融合。編輯ppt雙向電泳：在交流電場的作用下〔1MHz，150V/cm〕細胞膜上正負電荷別離，產生偶極，兩個極化的細胞會發生相互的緊密接觸。編輯ppt可逆電降解：在高頻電場的脈沖作用下〔50ms，電場強度1.2－2kV/cm〕，細胞膜上的離子發生位移，而使電荷分開，細胞質膜產生電勢，正、負電荷相互吸引，細胞膜變薄，隨細胞勢的增加，膜降解穿孔，形成微孔。電場誘發的微孔面積和數目與細胞膜總外表積相對不大時，微孔可以重新封閉。編輯ppt電場示意圖編輯ppt甜菜原生質體電融合過程1〕在高頻電流電場下的相互接觸。2〕脈沖刺激后30s3)50秒后4〕1.5分鐘后5〕6分鐘后6〕15分鐘后，原生質體融合完成。編輯ppt本卷須知1〕對介質要求高，一般用高純度的蒸餾水并選用適當的非電介質溶液，如甘露醇等配制等滲性介質。2〕注意控制高頻交流電壓和直流脈沖電壓的強度和時間，以防止細胞連接成串或發生可逆性降解。編輯ppt優點：融合率高，達70％－80％，甚至100％融合率＝〔融合組多核細胞的核數－對照組多核細胞的核數/對照組的全部細胞數〕×100％可在顯微鏡下定向誘導細胞融合可直接挑選雜種細胞編輯ppt4.13雜種細胞的篩選原理：兩種親本細胞融合的混合物中可能有多種類型細胞，篩選的目的是獲得優良的雜種細胞。1〕親本2〕同核體：同源原生質體的融合體3〕異核體：非同源的原生質體的融合體4〕多核體：含有雙親不同比例核物質的融合體5〕異胞質體：具有不同胞質來源的雜合細胞。6〕核質體：有細胞核而帶有少量細胞質的亞原生質體編輯ppt植物細胞篩選方式1〕遺傳互補篩選法：利用每一親本奉獻一個功能正常等位基因，糾正另一親本的缺陷，令雜種細胞表現正常。如親本1：葉綠體缺陷型親本2：光致死型兩親本在光照下一種死亡，另一種呈白色，融合細胞長成植株呈綠色，并能成長編輯ppt2〕抗性互補篩選法：利用親本細胞原生質體對抗生素、除草劑及其它有毒物質抗性差異選擇雜種細胞。如：親本1：對放線菌素D抗性，但在MS培養基上不能超過50個世代親本2：對放線菌素D很敏感，但能在MS上生長雜種細胞能在含有放線菌素的MS培養基上生長，而親本和其它細胞死亡編輯ppt3〕利用物理特性篩選法：根據親本的原生質體大小、顏色、漂浮密度及電泳遷移率、形成的愈傷組織的差異篩選雜種細胞。親本1：用異硫氰酸熒光素染色原生質體親本2：葉肉細胞原生質體在熒光顯微鏡下，親本1為紅色，親本2為綠色，雜種細胞可以區分編輯ppt4〕利用生長特性篩選法：利用原生質體對培養基成分要求與反響的差異選擇雜種細胞。例如粉蘭煙草與朗氏煙草細胞原生質體均需外源激素才能生長，但其融合細胞可以產生內源激素，在培養基上不需加激素。編輯ppt動物細胞的篩選方式：1〕利用抗藥性篩選系統：利用生物細胞對藥物敏感性差異篩選雜種細胞。親本A：對氨芐青霉素敏感，對卡娜霉素不敏感親本B：對卡娜霉素敏感，對氨芐青霉素不敏感雜種細胞可以在含有兩種抗生素的培養基上生長編輯ppt2〕營養互補篩選系統：細胞在缺乏一種或幾種營養成分時，不能生長繁殖，即營養缺陷型細胞。利用兩種親本細胞營養互補作用原理可以篩選雜種細胞。親本A：色氨酸缺陷型親本B：蘇氨酸缺陷型雜種細胞可以在不含色氨酸和蘇氨酸的培養基上培養，而親本細胞均會死亡。編輯ppt3〕溫度敏感突變型雜種細胞的篩選：一般的培養細胞能在32度到40度的范圍內生長，但溫度敏感突變型的細胞能在高溫或低溫下生長。由此篩選雜種細胞。親本一：具有卡那霉素抗性但只能在37度左右生長。親本二：高溫敏感突變型，但不能抗卡娜霉素。雜種細胞能在高溫和含卡娜霉素的培養基上生長。編輯ppt4.2雜種細胞的遺傳特性和應用4.21雜種細胞在細胞生物學研究中的應用4.23雜種細胞在植物育種中的應用編輯ppt4.21雜種細胞在細胞生物學研究中的應用1〕基因定位不同種屬的細胞融合時，常會出現一個親本細胞的染色體被優先排除，而另一個親本的染色體被選擇性留下，即染色體別離的現象。由此，可根據表型和與表型特征相對應的基因在特定染色體上。例如：HGPRT－人細胞與TK－的小鼠細胞融合后，可用HAT培養基別離得到一種僅含一條人E組染色體的雜種細胞，具有TK活性，由此得到人的TK基因是在E組染色體上的。編輯ppt2〕體細胞雜種的致瘤性分析通過正常二倍體細胞和致瘤性或病毒轉化細胞的融合來進行致瘤性的遺傳分析。3〕遺傳缺陷的基因互補基于雜種細胞的基因互補作用，可分為基因間和基因內的互補作用，即雜種細胞可以具有兩種親本在遺傳上缺陷的基因表型。通過這種基因互補，可以用正常基因來治療由于基因突變或基因缺失的疾病。編輯ppt4〕分化功能表達調控的研究通過細胞融合可將不同分化狀態或組織類型的細胞構建成為能夠存活的種內或種間雜種，同時對雜種細胞內的基因組和胞質觀察和分析，了解如何通過相互作用而最終導致原先表達的分化性狀熄滅或保存。編輯ppt4.22雜種細胞在植物育種中的應用雜種細胞是一條新的育種途徑，可以產生新經濟性狀的良種。科學家已經在禾本科、茄科、豆科、十字花科等植物中得到了雜種再生植株。一些近親植物、有性不親和的組合，如馬鈴薯×番茄等都得到了再生植株。目標：地上和地下部兼用種、固氮禾等具有兩種不同優勢性狀的新品種。編輯ppt4.3單克隆抗體4.31抗體的結構與功能4.32單克隆抗體的制備和生產4.34單克隆抗體的改造和應用編輯ppt4.31抗體的結構與功能編輯ppt編輯ppt抗體是由B細胞受抗原刺激后所分泌的蛋白質。抗體分子：由四條肽鏈所組成，兩條重鏈〔H鏈〕兩條輕鏈〔L鏈〕。結合區：抗體分子上有兩個抗原結合區可變區〔V區〕穩定區〔C區〕編輯ppt人體內的五種抗體編輯ppt4.32單克隆抗體的制備單克隆抗體(monoclonalantibody，簡稱McAb)：將能夠產生抗體的B淋巴細胞和具有無限增殖力的骨髓瘤細胞融合在一起，形成雜交瘤細胞。雜交瘤細胞既能在體外快速生長，又能持續分泌成分單一的特異性抗體。這種單一類型的只針對某一特定抗原決定簇的抗體分子，就是單克隆抗體。編輯ppt單抗的制備過程動物免疫與親本細胞的選擇細胞融合：淋巴細胞雜交瘤的制備雜交瘤細胞的篩選：有限稀釋法等單克隆抗體的制備和凍存單克隆抗體的純化編輯ppt親本細胞的選擇骨髓瘤細胞：一般不分泌抗體，能在體外無限繁殖和連續繼代培養，且為HPRT－或TK－。多用BALB/C小鼠的骨髓瘤細胞。編輯ppt淋巴細胞：經過免疫處理的淋巴細胞，多用大鼠或小鼠。免疫方法：體內法或體外法。體內法：對細胞或微生物抗原可直接注射如小鼠體內，可溶性蛋白抗原可與等量的福氏完全佐劑混合乳化后，注入到動物體內。3－4天后，在無菌條件下可以取出脾或淋巴結制成懸液，存活率在95％以上的可以用于融合。體外法：直接提取大、小鼠淋巴細胞，調整為107個/ml，加適當濃度抗原，3－4天后，收集被刺激的淋巴細胞。

編輯ppt細胞融合將免疫脾細胞和小鼠骨髓細胞以2：1或10：1的比例混勻于50ml錐形離心管內，1200rpm離心7—10分鐘，盡量吸凈上清液，用手指輕擊管壁，使管底沉淀的細胞鋪展成薄層，在室溫條件下邊輕輕振搖離心管邊在60秒鐘內逐滴參加50%的PEG0.5ml，隨后靜置90秒，再于5分鐘內邊振搖邊逐滴參加5－10ml不含血清的培液或鹽水緩沖液，以終止PEG的作用，再靜置10分鐘。編輯pptHAT培養基篩選雜交瘤細胞細胞團塊分散后，加HAT溶液，稀釋至骨髓瘤細胞不超過2×105ml，即可參加有飼養細胞的96孔塑料培養板內每孔0.1ml，如是24孔板，每孔0.5ml；總量分別為0.2ml和1ml。用HAT選擇性培養時每隔2－3天半量換液，7天后可以選擇出雜交瘤細胞。編輯ppt細胞融合的選擇示意圖編輯pptHAT選擇系統HAT是含一定濃度次黃嘌呤〔H〕、氨基喋呤〔A〕及胸腺嘧啶核苷〔T〕的一種選擇性培養基，其中三種成分與細胞DNA合成有關。DNA合成途徑有兩種。編輯ppt雜交瘤技術中，常選用次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉移酶缺陷〔HPRT-〕骨髓瘤細胞或胸腺嘧啶核苷激酶缺陷型〔TK-〕骨髓瘤細胞為親本之一。HPRT-細胞的嘌呤只能由全合成途徑產生；TK-細胞的嘧啶只能由全合成途徑合成。含氨基喋呤培養基抑制了細胞內嘌呤和嘧啶的全合成途徑。編輯ppt嘌呤合成通路的阻斷編輯ppt淋巴細胞具有合成DNA的兩條途徑。雜種細胞通過互補作用獲得HRPT或TK基因，可應用培養基中次黃嘌呤及胸腺嘧啶核苷，通過補救合成途徑合成DNA。在HAT培養基中，HPRT-

或TK-

親本細胞死亡，淋巴細胞亦逐漸死亡，只有雜種細胞存活。編輯ppt特異性雜交瘤細胞的篩選通過選擇性培養后生長的雜交瘤細胞，僅有局部是分泌預定特異性抗體的雜交瘤細胞。可取上清液，根據抗原的性質、抗體類型及所需靈敏度等具體情況來加以選擇。可溶性抗原可采用放射免疫、免疫酶標測定、間接血凝等方法測定。細胞抗原可采用免疫熒光、51Cr釋放試驗、溶血空斑測定、補體依賴的細胞毒等方法直接測定針對這些抗原的抗體。編輯ppt利用培養基對單抗進行鑒定的過程編輯ppt雜交瘤細胞的克隆化培養利用單個細胞培養技術選育出遺傳穩定的分泌特異抗體的細胞系。在培養過程中，一般要加能釋放某些生長因子促進雜交瘤生長的飼養細胞，如小鼠的腹腔巨噬細胞、脾細胞或胸腺細胞等。方法有有限稀釋法、軟瓊脂培養法、顯微操作法、應用熒光激活分選儀等。編輯ppt有限稀釋法通過適當的稀釋到達別離單個細胞進行培養的目的1〕取出陽性孔內的細胞進行計數2〕用培液將其稀釋到例如每毫升內10個細胞。3〕如果在96孔板內每孔加0.1ml，其機率將為每孔內落入一個細胞。4〕參加一定數量的飼養細胞，經過8~12天后，可觀察到有集落生長的孔。5〕根據檢測的陽性結果再次進行克隆化。編輯ppt軟瓊脂培養法在參加飼養細胞的無菌平皿內鋪上一層0.5％的瓊脂，待凝固后再鋪上一層混有雜交瘤細胞的0.25％的軟瓊脂。待細胞長成集落后，用毛細管吸出移種于含飼養細胞的96孔板內。編輯ppt單抗的大規模生產1〕誘生腹水將穩定分泌單抗的細胞株，通過擴大培養，接種于Balb/c小鼠腹腔內，使其以腹水瘤形式在小鼠腹腔內增殖，從而得到大量含單抗的腹水。方法是將降植烷或石蠟油注入Balb/c小鼠腹腔，0.5ml/只，7天后腹腔接種3~5×106雜交瘤細胞。10~20天后即可抽取腹水，每毫升腹水中約含1~10mg單抗。2〕利用微載體、微囊、旋轉瓶、中空纖維培養系統等進行大規模培養。編輯ppt4.33

單克隆抗體的改造和應用單抗作為體內體外診斷試劑在臨床生化診斷、病理組織定位、體內腫瘤的定位等單克隆抗體靶向制劑，治療癌癥等疾病雜交人－鼠單克隆抗體編輯ppt單抗作為體內體外診斷試劑現在已經有各種不同類型的單抗試劑合在市場出售，例如乙型肝炎的外表抗原，鐵蛋白、促絨毛膜性激素、促甲狀腺激素、癌癥、艾滋病等診斷試劑。用同位素標記的單抗在特定的組織中成象的技術可以用于腫瘤、心血管畸形的體內診斷。編輯ppt1、單克隆抗體靶向制劑1〕藥物與單抗直接偶聯通過化學反響使藥物分子的氨基與抗體分子的羧基之間直接形成穩定的酰胺鍵。利用氧化劑把藥物分子上的糖基氧化成羰基。利用羰基與抗體分子的氨基反響形成西佛氏堿，最后復原。這樣的靶向制劑保存一定的藥物活性，并具有一定的選擇性。如：1，4－溴柔紅霉素與腫瘤細胞單抗形成的偶合物，對腫瘤有明顯的選擇性毒性。編輯ppt2〕藥物通過小分子與單抗連接通過一些小分子交聯劑，把藥物分子上的某些基團連接起來。小分子交聯劑：如同型雙功能試劑，包括戊二醛、順烏頭酸酐、馬來酸酐、戊二酐；異型雙功能試劑：N－琥珀酰胺基－3－丙酸和寡肽等。順烏頭酸酐制成的最常用，在中性條件下較穩定，在酸性條件下容易發生水解。這種靶向試劑與腫瘤的外表抗原結合后，會進入溶酶體，在酸性環境下釋放藥物，而殺死腫瘤細胞。編輯ppt3〕藥物通過大分子與抗體相連大分子聚合物：葡聚糖、多聚賴氨酸、多聚谷氨酸、聚合多肽和血清蛋白等。總之，利用單抗試劑合可以作為靶向藥物，針對腫瘤、自身免疫系統疾病、各種病原體病等。編輯ppt2、雜交人－鼠單克隆抗體鼠源抗體一般無法有效地激發宿主的免疫防衛系統，還可能引發人對鼠源抗體本身的免疫反響。在抗體中，Fc片段在抗體中的作用是激活機體免疫反響。對鼠源抗體進行改造，利用人源的Fc區域的DNA片段替換鼠源單抗的Fc的DNA片段。嵌合抗體可以保存其目標專一性，降低人的抗鼠反響。編輯ppt一種制備人腫瘤單克隆抗體的方案編輯ppt3、人源單克隆抗體方法1：別離人B細胞，使之與熒光標記的抗原相結合，通過熒光標記選擇能產生特殊抗體的B細胞，并用Epstein－Barr病毒轉化，得到少量的單抗。方法2：將人源免疫干細胞導入缺失大局部免疫細胞的小鼠