柴胡加龍骨牡蠣湯對慢性應(yīng)激抑郁大鼠的抗抑郁作用

柴胡嘉隆谷煮牡蠣治療（clsd）源于傷寒。根據(jù)小柴胡湯（xcd）的記載，它是由甘草和其他藥物引起的。然后加入龍骨、牡蠣、桂枝、椰子和大黃。原書主治“傷寒八九日,下之,胸滿煩驚,小便不利,譫語,一身盡重,不可轉(zhuǎn)側(cè)者”。全方寒溫并用,攻補(bǔ)兼施,具有疏肝理氣,通陽泄熱,重鎮(zhèn)安神之功,尤適用于病情錯(cuò)綜復(fù)雜的證候?，F(xiàn)今在臨床上多用于抑郁癥的治療,被認(rèn)為是最適合的古方之一。而小柴胡湯則鮮有用于抑郁癥的報(bào)道。近年本實(shí)驗(yàn)室研究發(fā)現(xiàn),柴胡加龍骨牡蠣湯對多種經(jīng)典的抑郁動(dòng)物模型均顯示出抗抑郁作用,對抑郁大鼠腦內(nèi)單胺遞質(zhì)具有明顯的升高作用,并通過逆轉(zhuǎn)HPA軸(下丘腦-垂體-腎上腺素)功能亢進(jìn)發(fā)揮抗抑郁活性。為了研究柴胡加龍骨牡蠣湯全方、小柴胡湯以及非小柴胡湯部分(即龍骨、牡蠣、桂枝、茯苓、大黃)抗抑郁作用的差別,本實(shí)驗(yàn)采用慢性應(yīng)激的方法造成大鼠抑郁模型,觀察不同藥物組成對慢性應(yīng)激引起的動(dòng)物行為的變化。1材料表面1.1不同種類植物的干酵母粉的制備柴胡加龍骨牡蠣湯中各藥材(去鉛丹)均購自南京市金陵大藥房,并經(jīng)本校中藥資源學(xué)研究室秦民堅(jiān)博士鑒定:人參為五加科植物人參PanaxginsengC.A.Mey.的干燥根;桂枝為樟科植物肉桂CinnamomumcassiaPresl的干燥嫩枝;半夏為天南星科植物半夏Pinelliaternata(Thunb.)Breit.的干燥塊莖;茯苓為多孔菌科真菌茯苓Poriacocos(Schw.)Wolf的干燥菌核;黃芩為唇形科植物黃芩ScutellariabaicalensisGeorgi的干燥根;柴胡為傘形科植物柴胡BupleurumchinenseDC.的干燥根;大黃為蓼科植物掌葉大黃RheumpalmatumL.的干燥根及根莖;甘草為豆科植物甘草GlycyrrhizgauralensisFisch.的干燥根及根莖;牡蠣ConchaOstreae;龍骨FossiliaOssisMastodi;姜為姜科植物姜ZingiberofficinaleRosc.的根莖;大棗為鼠李科植物棗ZiziphusjujubeMill.的干燥成熟果實(shí)。柴胡加龍骨牡蠣湯全方、小柴胡湯和龍骨、牡蠣、桂枝、茯苓、大黃方(龍牡桂苓軍)均按原方比例配方。用10倍量水煎煮兩次,合并濾液蒸干,制備成浸膏凍干粉,柴胡加龍骨牡蠣湯全方、小柴胡湯、龍骨牡蠣軍的得率分別為16.9%、19.8%以及12.3%。各凍干粉放于-20℃冰箱里儲存?zhèn)溆?臨用時(shí)用蒸餾水配成所需濃度。鹽酸氟西汀膠囊(fluoxetinehydrochloridecapsules,FLU)為加拿大奧貝泰克制藥有限公司生產(chǎn),批號HD0560。1.2動(dòng)物SD大鼠,♂,體重180~200g,由中國藥科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。動(dòng)物分籠飼養(yǎng),保持晝夜節(jié)律,室溫22±1℃,食水自由。2方法2.1動(dòng)物模型轉(zhuǎn)化所有大鼠適應(yīng)飼養(yǎng)7天后,用Open-Field法作行為學(xué)評分,選擇得分相近的90只大鼠隨機(jī)分為9組:正常組(Normal);模型組(Model);陽性藥對照組(FLU,20mg/kg);柴胡加龍骨牡蠣湯高、低(500、200mg/kg)劑量組;小柴胡湯高、低(800、320mg/kg)劑量組;龍牡桂苓軍高、低(200、80mg/kg)劑量組。除正常組外,其余各組均連續(xù)接受各種不同的應(yīng)激以復(fù)制慢性應(yīng)激抑郁模型。動(dòng)物模型根據(jù)文獻(xiàn)方法改進(jìn),每天隨機(jī)選取以下應(yīng)激中的任意一種:冷水游泳(4℃,5min)、熱應(yīng)激(45℃,5min)、禁水(24h)、禁食(24h)、夾尾(1min)、水平搖晃(60Hz,15min)和晝夜顛倒等刺激,平均每種刺激各3次,使大鼠不能預(yù)料刺激的發(fā)生,以避免發(fā)生適應(yīng)性。各組每日上午8時(shí)灌胃給藥,連續(xù)21d,正常組和模型組給予等量蒸餾水。各組動(dòng)物于d1、d7、d14、d21稱量體重。2.2行為觀察指標(biāo)2.2.1運(yùn)動(dòng)運(yùn)動(dòng)得分所有動(dòng)物于d21灌胃后1~2h,置于安靜、黑暗的箱子里進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。水平運(yùn)動(dòng)得分:大鼠置于敞箱中央格,以穿越1格為1分(四爪均進(jìn)入方格才計(jì)數(shù));垂直運(yùn)動(dòng)得分:兩前爪騰空或攀附墻壁次數(shù)。水平活動(dòng)得分反映大鼠的運(yùn)動(dòng)活動(dòng)性水平;垂直活動(dòng)得分則反映其興趣高低。2.2.2大鼠攝食蔗糖溶液量的檢測所有大鼠于實(shí)驗(yàn)d19起禁食水24h(期間灌胃1次),于d20予食物及1%蔗糖水溶液200mL,觀測大鼠在24h內(nèi)的飲用蔗糖水溶液量。比較正常組大鼠、模型組以及各給藥組大鼠在糖水消耗及糖水偏愛方面的差異。糖水偏愛(SucrosePreference,SP)以蔗糖水溶液的消耗量(mL)/總液體的消耗量(mL)×100%表示。2.3各組大鼠的馬匹比測量實(shí)驗(yàn)最后一天各組大鼠稱重,股動(dòng)脈取血處死,取雙側(cè)的海馬,稱重。取海馬與大腦重量的比值,以消除各組體重差異的影響。2.4腺組織的制備實(shí)驗(yàn)最后一天各組大鼠稱重,股動(dòng)脈取血處死,剖開腹腔,把腎上腺連同周圍少量脂肪組織一起摘出,浸入生理鹽水中洗凈附著的血液,并將殘余的脂肪組織剔除干凈,用濾紙吸干表面水分,迅速稱重。腎上腺指數(shù)=腎上腺重量(g)×1000/大鼠體重(g)2.5統(tǒng)計(jì)方法數(shù)據(jù)以xˉ±sxˉ±s表示,組間比較采用t檢驗(yàn)。3結(jié)果3.1動(dòng)物行為指標(biāo)的影響3.1.1大鼠的運(yùn)動(dòng)、垂直運(yùn)動(dòng)情況結(jié)果見表1。經(jīng)過21天的不可預(yù)見性慢性應(yīng)激,模型組與空白組相比較,大鼠的水平運(yùn)動(dòng)、垂直運(yùn)動(dòng)均明顯減少;與模型組相比,氟西汀、柴胡加龍骨牡蠣湯(全方組)高低劑量組及龍牡桂苓軍高劑量組均能明顯增加大鼠的水平得分、垂直得分,高劑量小柴胡湯組的水平得分明顯增加。3.1.2水消耗量測定結(jié)果見表1。模型組與空白組相比,24h糖水消耗量明顯減少;柴胡加龍骨牡蠣湯高低劑量組、龍牡桂苓軍高低劑量組、小柴胡湯高劑量組以及氟西汀組可顯著增加24h糖水消耗量。3.2慢性應(yīng)激測試大鼠海馬小結(jié)果見表1。與空白組相比,模型組的海馬體積明顯減小(P<0.01),提示慢性應(yīng)激可造成大鼠海馬的縮小。氟西汀組、柴胡加龍骨牡蠣湯高低劑量組以及龍牡桂苓軍高低劑量組能明顯對抗慢性應(yīng)激大鼠的海馬萎縮。3.3對慢性應(yīng)激大鼠臟器臟器免疫組化的影響結(jié)果見表1。模型組與空白組相比,腎上腺指數(shù)明顯升高,氟西汀組、柴胡加龍骨牡蠣湯高低劑量組、龍牡桂苓軍高低劑量組可明顯降低慢性應(yīng)激大鼠的腎上腺指數(shù),龍牡桂苓軍低劑量組的效果尤為明顯。4慢性應(yīng)激模型傳統(tǒng)中醫(yī)認(rèn)為,抑郁癥屬郁證范疇。由情志不舒,肝氣郁結(jié),漸致五臟不和,化火、生痰、瘀阻、耗氣、傷陰等而致。臨床多從肝臟論治,常用柴胡劑。其中柴胡加龍骨牡蠣湯被認(rèn)為是最適合于治療抑郁癥的古方之一,甚至有“抑郁狀態(tài)為柴胡加龍骨牡蠣湯之證”之說。雖然柴胡加龍骨牡蠣湯是由小柴胡湯演變而來的,但是臨床上鮮有用小柴胡湯原方治療抑郁癥的報(bào)道。抑郁癥的病因尚未徹底闡明,目前認(rèn)為慢性、低水平、長期的應(yīng)激源是促進(jìn)抑郁發(fā)生、加重病情的主要原因。慢性輕度不可預(yù)見性應(yīng)激抑郁模型就是根據(jù)此理論依據(jù)建立,其特點(diǎn)就是應(yīng)激因子的多變性和不可預(yù)見性,已成為國內(nèi)外學(xué)者探討抑郁癥的發(fā)病機(jī)制及抗抑郁劑作用機(jī)理而廣泛應(yīng)用的動(dòng)物模型。慢性應(yīng)激模型中大鼠活動(dòng)減少、快感缺失與抑郁證患者表現(xiàn)出的情緒低落、興趣喪失有一定程度的相似性。海馬是在眾多腦區(qū)中被認(rèn)為與抑郁癥的關(guān)系最為密切的腦區(qū)之一。重癥抑郁病人左右側(cè)海馬較之正常人顯著縮小,且縮小程度與抑郁持續(xù)時(shí)間呈正相關(guān)。Rubin等研究發(fā)現(xiàn),與健康者相比,抑郁患者的腎上腺皮質(zhì)增生約38%,增生的程度與皮質(zhì)醇的濃度有關(guān),且隨著抑郁的緩解,這種增生似乎也隨著皮質(zhì)醇的正?；鸩较?。因此,本實(shí)驗(yàn)采用慢性應(yīng)激模型,通過大鼠活動(dòng)能力、糖水消耗、腎上腺指數(shù)以及海馬體積的變化,考察了小柴胡湯、柴胡加龍骨牡蠣湯及龍骨牡蠣桂枝茯苓大黃的抗抑郁作用。發(fā)現(xiàn)龍骨牡蠣桂枝茯苓大黃與柴胡