不同提取工藝對產油酵母油脂產率的影響

微生物油主要由微生物通過碳氫化合物合成，其脂肪酸的組成與植物油相似。由于它能夠取代水生植物作為生物柴油生產的原料油，因此引起了人們的注意。本文主要以實驗室前期分離獲得的高產油酵母菌株JM-D為研究對象,比較了不同的預處理方法(酸熱法、細胞勻漿機破碎法、微波法、反復凍融法、超聲波清洗器法、超聲波細胞粉碎機法、研磨法和酶法)對產油酵母細胞破碎效果的影響,同時對兩種油脂提取方法進行了比較(有機溶劑提取法與索氏抽提法),以期在提高微生物油脂產量和節約成本方面,為微生物細胞破碎和油脂提取的工業化生產提供一定的借鑒。1材料和方法1.1病毒產油酵母JM-D為實驗室篩選保藏菌種。前期研究1.2滅菌固體斜面培養基:于9°Brix麥芽汁中加入2%瓊脂,115℃滅菌20min。液體種子培養基:葡萄糖20g/L,酵母膏10g/L,(NH液體發酵培養基:葡萄糖60g/L,酵母膏10g/L,蛋白胨3.5g/L,KH1.3化培養民警將冷凍保藏的產油酵母JM-D接種于固體斜面培養基上,于28℃活化培養72h;取2環活化菌接種于液體種子培養基中,于28℃、140r/min搖床培養12h后,以10%的接種量接種于液體發酵培養基中,于28℃、140r/min搖床發酵培養120h。1.4最適菌種的確定考慮到菌體含水量可能會對某些細胞破碎方法的效果產生影響,故在破碎之前準備干濕兩種菌體。因此,發酵結束后,以3000r/min離心發酵液10min,所得菌體用蒸餾水清洗后離心,重復此操作2次,得濕菌體。取部分濕菌體在65℃干燥箱中烘干至恒重,得到產油酵母JM-D干菌體,菌體干重≈0.2×菌體濕重。1.5產油螺母jm-d的預處理1.5.1養殖脂質蛋白的制備取3份濕菌體各2.5g,分別加入蒸餾水40mL制成菌懸液,調節pH5.0~6.0,并依次加入6、10、15mg/mL的蝸牛酶,置于45℃水浴中酶解4~6h,隨后加入菌懸液2倍體積的無水乙醇終止酶解反應,將反應液移入具塞量筒中,進一步用有機溶劑提取油脂1.5.2官液的制備分別稱取2.5g濕菌體3份置于小燒杯中,分別加入10mL蒸餾水制成菌懸液。以蒸餾水為介質,處理時間分別為5、10、15min。1.5.3濕菌體菌懸液的制備將GY92-II型超聲波細胞粉碎機調至:超聲時間15s、間隙時間20s、功率600W,工作次數為40。分別稱取2.5g濕菌體3份于小燒杯中,加入10mL蒸餾水制成菌懸液。將裝有菌懸液的小燒杯置于冰浴上并放入儀器內,處理時間分別為5、10、15min,從而完成對產油酵母JM-D的細胞破碎1.5.4解凍冷凍管分別稱取2.5g濕菌體3份放入3支離心管中,并各加入10mL蒸餾水制成菌懸液。放入-20℃冰箱冷凍12h。然后取其中1支冷凍管放入100℃水浴鍋內水浴10min進行解凍;1支冷凍管放在室溫條件下10min完全解凍;1支冷凍管放入微波爐中,調至“解凍”檔解凍30s,靜置1min,再進行解凍30s,重復操作20次。最后將3支離心管再次放入-20℃冰箱冷凍12h再解凍,重復以上操作3次1.5.5漿機菌懸液的制備分別稱取2.5g濕菌體和0.5g干菌體各3份,分別置于細胞勻漿機專用圓底燒瓶中,向6組圓底燒瓶各加入10mL蒸餾水制成菌懸液。將細胞勻漿機轉速調至6000r/min,破碎處理時間分別為5、10、15min,從而達到對產油酵母JM-D細胞破碎的目的。1.5.6官液的制備分別稱取2.5g濕菌體3份于小燒杯中,分別加入10mL蒸餾水制成菌懸液。將微波爐調至“中火”檔,對3組菌懸液處理時間分別設置為5、10、15min。1.5.7提取油脂稱取干菌體0.5g,放入22mm×200mm大試管中,加入4mol/L鹽酸15mL,搖勻,放入沸水浴中1h,取出冷卻,以待進一步提取油脂1.5.8研磨法稱取干菌體2g,放入研缽中研磨1h,取研磨后的干菌粉0.5g,準備下一步提取油脂。1.6油提取采用有機溶劑(乙醚與石油醚)提取法2結果與分析2.1不同的破裂法對jm-d油的產量影響2.1.1犀牛酶破壁程度的測定采用不同加酶量的蝸牛酶進行破壁處理,經先乙醚后石油醚提取,所得油脂提取結果如圖1所示。由圖1可以看出,在加酶量為6~15mg/mL的范圍內,油脂產率先升高后降低,表明蝸牛酶的破壁程度也是先升高后降低。在10mg/mL蝸牛酶的條件下,油脂產量最大,達到0.242g,油脂產率也最高,為46.2%。出現這一現象的原因可能是較低的加酶量不能有效地破碎細胞,而加酶量過多會導致產物抑制而影響酶活,最終影響油脂產率2.1.2超聲波破碎細胞的產油結果分別采用超聲波清洗器和超聲波細胞粉碎機破碎濕菌體細胞,經先乙醚后石油醚提取,所得油脂提取結果如圖2所示。由圖2可以看出,采用超聲波清洗器破碎菌體細胞10min,所提取的油脂產率最大,為35.2%;且采用超聲波清洗器破碎細胞比采用超聲波細胞粉碎機破碎細胞的效果好。從兩種超聲波破碎方法可以看出并非處理時間越長越好,兩種方法都在超聲破碎10min時油脂產率最大。出現這種現象的原因可能是超聲波處理時間較長時儀器產生熱量,部分油脂分解,油脂產率下降2.1.3解凍破碎細胞所提取的油脂產率采用1.5.4的方法破碎菌體細胞,經先乙醚后石油醚提取,所得油脂提取結果如圖3所示。由圖3可以看出,在100℃水浴鍋中解凍破碎細胞所提取的油脂產率最大,為43.4%;其次是室溫條件下解凍的;而在微波爐中解凍破碎細胞的油脂產率最低,破碎細胞的效果最差。出現這種現象的原因可能是水浴鍋中解凍溫差相對較大,破碎細胞效果最好;而微波爐解凍溫度太高使部分油脂分解。2.1.4菌細胞的油脂提取利用細胞勻漿機的勻漿刀在高速旋轉過程中產生的機械切力,對產油酵母JM-D進行物理破碎。采用1.5.5方法破碎菌體細胞,經先乙醚后石油醚提取,所得油脂提取結果如圖4所示。由圖4可以看出,菌體是否為干菌體或濕菌體對細胞勻漿機破碎細胞的影響很小,破碎后提取所得油脂產量及油脂產率相差不大。當干、濕菌體破碎時間為10min時,所得油脂產率最大,但最大值僅為7.1%,與超聲波破碎法、反復凍融法相比破碎效果較差,所得油脂產率較低。2.1.5反復凍融法提取細胞的產油結果微波破碎法是利用微波爐在加熱過程中產生的大量熱量,使菌體細胞壁中的蛋白質等物質發生變性,從而達到細胞破碎的效果。采用1.5.6方法破碎菌體細胞,經先乙醚后石油醚提取,所得油脂提取結果如圖5所示。由圖5可以看出,在5~15min的處理時間內,當處理10min時所得油脂產率較高,為3.6%,低于反復凍融(微波爐解凍法)處理的。微波法破碎濕菌體細胞的效果很差,油脂產率很低。其原因有可能是微波爐在加熱過程中產生的高溫使部分油脂分解,從而使油脂產量偏低。2.1.6酸熱法與研磨法破碎細胞的產油結果比較分別采用酸熱法、研磨法、研磨法+酸熱法相結合對干菌體細胞進行破碎,再經先乙醚后石油醚提取,所得油脂提取結果如圖6所示。由圖6可以看出,酸熱法破碎干菌體細胞所得油脂產率為34.6%,明顯高于研磨法,而研磨法+酸熱法破碎細胞所得油脂產率為37.8%,略高于采用酸熱法的。分析原因可能是由于單獨研磨時,菌體細胞與研缽的接觸點少,從而導致細胞破碎效果較差,油脂產量較低。而使用酸熱法破碎時,對菌體先進行研磨處理能使菌體細胞充分與酸接觸,破碎效果最好,從而油脂產量最高。因此,采用復合細胞破碎方法所得油脂產量要高于使用單一破碎方法的油脂產量。2.2索氏抽法提取脂選擇酸熱法及研磨法處理干菌體細胞,再分別采用索氏抽提法、有機溶劑(先乙醚后石油醚)提取法提取菌體油脂,結果如表1所示。由表1可以看出,采用研磨法破碎細胞,后采用索氏抽提法所得菌體油脂產量明顯高于有機溶劑提取所得油脂產量。其原因可能是有機溶劑提取法利用有機溶劑溶解油脂的時間較索氏抽提法的短,而索氏抽提法是利用有機溶劑反復萃取油脂的方法,萃取油脂比較徹底,因此采用索氏抽提法所得菌體油脂產量相對最高,油脂產率也相對最大,為44.0%。該方法缺點是操作比較耗時,但其提取過程中乙醚可以回收利用,可以減少油脂提取成本。而采用酸熱法破碎細胞后再經有機溶劑提取所得油脂產量僅次于索氏抽提法的,可見,采用適當的細胞破碎方法及油脂提取方法對油脂產量及油脂產率影響較大。3反復凍融法破碎細胞的產油結果在8種菌體破碎方法中,蝸牛酶法破碎JM-D酵母細胞的效果最好,利用蝸牛酶破碎細胞后再經先乙醚后石油醚提取所得油脂產率最大,最大值為46.2%;其次是反復凍融(100℃水浴解凍)法,油脂產率為43.4%。研磨法+酸熱法破碎細胞后油脂提取效果也比較好