馬度米星銨對克氏原螯蝦鰓組織結構和抗氧化系統的影響

劉曉曉、騰培、倪涵、等。馬度米星銨對克氏原刺的毒性[j]。動物和獸醫，2018，50（5）：46-50。LiuXX,TengP,NiH,etal.Effectofmaduramycinammoniumonthegilltissueofcrayfish[J].AnimalHusbandry&VeterinaryMedicine,2018,50(5):46-50.隨著畜牧業的高度集約化發展,抗生素在保障畜牧業發展、改善人民生活質量方面發揮著不可替代的作用。然而,隨著抗生素越來越廣泛的使用,其暴露在環境中的機率也逐漸增大。近年來,抗生素所帶來的環境污染和生態毒性引起了國內外極大的關注馬度米星銨又稱馬杜霉素,是從馬杜拉放線菌的發酵產物中分離得到的一種新型聚醚類離子載體抗生素。馬度米星銨是目前藥效最強的聚醚類離子載體抗生素,具有抗球蟲譜廣、活性高、價格合適和球蟲不易產生耐藥性等優點,被廣泛添加在動物飼料中克氏原螯蝦俗稱小龍蝦,因其肉質鮮美、營養豐富等特征,深受消費者的喜愛,是中國目前重要的經濟水產養殖對象本研究以克氏原螯蝦為模式動物,在急性毒性試驗的基礎上進行亞慢性毒性試驗,研究不同濃度馬度米星銨對克氏原螯蝦鰓組織結構和抗氧化酶活性的影響,為評價馬度米星銨在環境中的風險提供一定依據。1材料和方法1.1純度及規格馬度米星銨,由浙江匯能生物股份有限公司提供,純度91.9%以上,批號:1701004。溶劑為95%的乙醇,國藥集團化學試劑有限公司生產,批號:20130207。1.2試驗養殖過程試驗所用克氏原螯蝦由江蘇省淡水研究所提供,體重(23.03±2.12)g,置于含有適量水的聚乙烯塑料箱內(60cm×40cm×30cm),馴養1周后用于試驗。每天投喂顆粒飼料2次,按照體重的1%足量投喂。2d換水1次,不間斷供氧。養殖用水為經3d曝氣、pH為7.0~7.4的脫氯自來水。養殖期間水溫(20±2)℃,水中溶氧6.0mg·L1.3試驗設計急性毒性試驗參照魏華等根據急性毒性試驗結果,設定低、中、高3個劑量組(0.7、3.5和7.0mg·L1.4組織勻漿蛋白測定鰓組織樣品在4℃下解凍,用剪刀剪碎,稱重,放入勻漿管中,以1∶9的重量體積比(W/V),加入預冷的0.86%生理鹽水,勻漿機勻漿,4℃下2500r/min離心10min后立即取上清液。鰓組織勻漿液蛋白含量的測定采用考馬斯亮藍法,考馬斯亮藍蛋白試劑盒購自南京建成生物工程研究所。鰓組織中超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)活性和丙二醛(MDA)含量(以每毫克蛋白計)的測定均采用南京建成生物工程研究所的試劑盒,按照說明書操作步驟進行。1.5漁船組織疾病的切開術常規石蠟切片,固定液固定、常規梯度酒精脫水、石蠟包埋,制成5~6μm切片,HE染色,顯微鏡下觀察。1.6數據分析采用改良寇氏(Karber)法2結果與分析2.1馬度米星銨對克氏原螯蝦幼蝦感染的影響試驗期間,空白對照組與溶劑對照組克氏原螯蝦活力良好,均未發生死亡。劑量組克氏原螯蝦在接觸試液初期出現暫時性興奮,表現為異常活躍,快速游動。隨后2個高劑量組克氏原螯蝦口吐白色黏性分泌物,出現死亡。隨著中毒時間的延長,克氏原螯蝦出現仰頭呼吸、活力下降、側游、行動遲緩和翻轉后無力翻身等中毒癥狀。如表1所示,隨馬度米星銨濃度的增加,克氏原螯蝦死亡率越大;相同濃度條件下,染毒時間越長,克氏原螯蝦死亡率越高。以改良Karber方程對試驗結果進行統計分析,得出96h的LC2.2馬度米星銨對克氏原螯蝦各組織中cat活力的影響克氏原螯蝦暴露在含不同濃度馬度米星銨水體中,鰓組織SOD活性變化如圖1所示,與空白對照組相比,7d時呈劑量依賴性,隨馬度米星銨濃度的增加,SOD活性逐漸下降。低劑量組SOD活力呈時間依賴性,隨時間延長而逐漸降低,28d時酶活力極顯著低于空白對照組(P<0.01);中劑量組14d時SOD活力極顯著降低(P<0.01),28d時活力回升,與空白對照組相比差異不顯著(P>0.05);馬度米星銨暴露7d后,高劑量組SOD活性呈現極顯著降低(P<0.01),28d時恢復至略低于空白對照組(P>0.05)。結果表明,整個暴露過程中,低劑量組鰓組織SOD活性逐漸被抑制,中、高劑量組SOD活性隨時間延長先下降后上升。暴露在不同劑量馬度米星銨中克氏原螯蝦鰓組織CAT活性變化如圖2所示,與空白對照組相比,呈現先升高后降低的趨勢。暴露7d時各劑量組與空白對照組相比酶活力升高,14d時各劑量組與空白對照組相比表現為抑制,但差異均不顯著(P>0.05)。暴露28d時,劑量組表現為明顯抑制,與空白對照組相比,低、中劑量組酶活力極顯著降低(P<0.01),高劑量組顯著降低(P<0.05)。結果表明,經馬度米星銨暴露7d后,各劑量組CAT活力雖然有一定的變化(輕微誘導),但是與對照組相比差異不顯著;暴露28d后CAT活力表現下降,顯著低于對照組的CAT水平,說明在28d后克氏原螯蝦CAT活力受到抑制。不同濃度馬度米星銨對克氏原螯蝦鰓組織MDA含量變化如圖3所示,與空白對照組相比,中、高劑量組暴露7d時MDA含量上升,但差異均不顯著(P>0.05),之后隨時間的延長逐漸被抑制。28d時,與空白對照組相比,中劑量組MDA含量顯著下降(P<0.05),高劑量組極顯著下降(P<0.01)。而28d內低劑量組與空白對照組相比差異不顯著(P>0.05)。結果表明,整個馬度米星銨暴露過程中,低劑量組對克氏原螯蝦鰓組織氧化作用與空白對照組比差異不顯著;中、高劑量組在7d時對克氏原螯蝦鰓組織產生輕微氧化作用,但在較長時間(28d)作用下則減輕了機體的脂質過氧化作用。2.3管腔微血管腔結構由圖4A可見,空白對照組鰓葉結構完整,鰓膜平整光滑,有規則。內部呼吸上皮細胞整齊有序的排列在微血管腔外,微血管腔內有血細胞。與空白對照組相比,低劑量組(圖4B)少量呼吸上皮細胞從鰓膜上脫落進入微血腔,細胞核濃縮或成碎片化,微血管腔結構不完整;中劑量組(圖4C)大部分呼吸上皮細胞脫落溶解,微血管腔結構幾乎完全消失,局部鰓膜結構模糊;高劑量組(圖4D)呼吸上皮細胞幾乎完全壞死并從鰓膜上脫落,鰓膜結構受損,不光滑,看不到正常的鰓結構。3討論3.1馬度米星銨對克氏原蝦的快速毒性作用根據魚類急性毒性分級標準,本試驗得到的馬度米星銨對克氏原螯蝦96hLC3.2重度環境脅迫對生物sod活性的影響在正常生理情況下,機體中的活性氧與抗氧化系統處于一種動態平衡的狀態。只有受到脅迫時,機體產生大量活性氧自由基,超出抗氧化系統的清除能力,對機體造成氧化損傷。SOD和CAT是機體抗氧化體統中的關鍵酶,能夠減輕O研究表明,當生物體受到輕度逆境脅迫時,SOD活性往往升高;而當受到重度環境脅迫時,SOD活性通常降低,使生物體內積累過量的活性氧,從而導致生物體的損傷。本試驗結果顯示鰓組織SOD活性隨藥物劑量的增加而逐漸被抑制,表明馬度米星銨的暴露濃度已經超出克氏原螯蝦機體所能承受的范圍,造成了機體的氧化損傷,與王瑞龍等本試驗MDA含量低劑量組與空白對照組相比沒有顯著差異,中、高劑量組7d時MDA含量有所上升后逐漸下降,暴露28d后MDA含量顯著低于空白對照組。表明暴露7d時鰓組織可能處于脂質過氧化狀態,隨暴露時間的延長(14d),逐漸被機體抗氧化系統清除,減輕了機體的脂質過氧化作用。此外根據研究表明3.3低劑量依賴試驗本研究結果顯示,脅迫28d后,鰓組織損傷程度呈現藥物劑量依賴性,即藥物濃度越高,損傷越嚴重。低劑量組便能觀察到明顯的病理變化;中劑量組可見微血管腔結構已經完全消失,大部分呼吸上皮細胞脫落、壞死;高劑量組呼吸上皮細胞幾乎完全脫