新生兒溶血病檢測標準操作規(guī)程1.檢驗原理：本試驗為將排阻層析和抗人球蛋白試驗（Coombs試驗）相結合，即在微柱凝膠介質中，紅細胞抗原與相應的不完全抗體在抗人球蛋白的作用下發(fā)生凝集反應，形成紅細胞免疫復合物，在一定離心力下，該復合物不能通過凝膠間隙而浮于膠表面或懸于膠中；如無相應的不完全抗體結合，則不能形成紅細胞免疫復合物，在一定離心力下，分散的紅細胞可以通過凝膠間隙沉于微柱腔底部。2.主要組成部分：本品系在聚丙烯塑料透明卡片上的六支微柱型管中填充葡聚糖凝膠和抗人球蛋白（多抗），制成抗人球蛋白檢測卡，凝膠微管分為反應腔和凝膠分離柱兩部分。3.樣本要求：3.1紅細胞樣本：采集被檢對象靜脈血，用EDTA抗凝，配制成紅細胞懸液（直接抗人球蛋白試驗配制成紅細胞生理鹽水懸液，間接抗人球蛋白試驗配制成紅細胞低離子溶液懸液（只適用于交叉配血和不規(guī)則抗體篩檢）），紅細胞最終濃度0.5%-0.8%。3.2血清樣本：采集被檢對象靜脈血，放入含有兔腦粉或者其他促凝劑的試管中，10分鐘后離心，取上清；或者靜脈血采入無抗凝劑試管中，4℃放置12小時，或者37℃放置2小時后離心，200rpm10分鐘，取上清該上清不得有絮狀物或沉淀。血清標本必須充分去蛋白，否則標本中析出的或紅細胞懸液中殘余的纖維蛋白可阻礙紅細胞沉降，使非凝集細胞離心后在膠表面形成一條紅線，呈假陽性反應。4.檢驗方法4.1.準備工作1）微柱凝膠檢測卡的準備：觀察外觀，如有干膠、雜質、氣泡不可使用，之后將卡平衡至室溫（18－25℃），再用專用離心機離心5分鐘。2）標本采集：用EDTA抗凝管采集被檢對象臍帶血或靜脈血，制備成紅細胞標本和血漿標本。3）紅細胞懸液的制備：將被檢者紅細胞標本至少洗滌4次，取被檢者壓積紅細胞10微升，加入1毫升紅細胞稀釋液或生理鹽水，外觀應為均勻淡紅色，無絮狀物和血塊。4）血漿標本的處理：將被檢者血漿標本進行離心，采用3000r/min離心3min或3500r/min離心2min（不得有絮狀物或沉淀）。5）放散液制備：a.熱放散：充分洗滌紅細胞至少4次，取洗滌后的壓積紅細胞和等體積的6%牛人血白蛋白（或生理鹽水）混勻，置于56℃孵育10分鐘，其間不斷搖動，離心1000g，2－3分鐘，取上清即放散液。b.酸放散：取4體積的A液與1體積的B液混合均勻為AB液。將壓積紅細胞至少洗滌4次，與等量的AB液混合均勻，室溫孵育1min，3000rpm離心1—2min。立即將上清移到另一支干凈試管中，并加入紫紅色中和液調至肉色或水粉色（500微升上請加入中和液80－85微升），此時pH酸堿度近中性。3000rpm離心1—2min，取上清即放散液。4.2操作步驟4.2.1、新生兒ABO、RhD血型檢測卡（微柱凝膠）：①取新生兒紅細胞懸液50微升分別加入檢測卡中的1－6孔中。②使用專用離心機離心5分鐘（900rpm2分鐘，1500rpm3分鐘）。③取出檢測卡，肉眼判讀結果。4.2.2、抗人球蛋白檢測卡（新生兒溶血病胎（嬰）兒不完全抗體檢測）：①在第1、4孔分別加入A型紅細胞懸液各50微升；在第2、5孔分別加入B型紅細胞懸液各50微升；在第3、6孔分別加入0型紅細胞懸液各50微升；②1－3孔分別加入50微升新生兒血漿，4－6孔分別加入50微升新生兒紅細胞放散液。③將檢測卡置于37℃孵育器孵育15分鐘。④使用專用離心機離心5分鐘（900rpm2分鐘，1500rpm3分鐘），取出檢測卡，判讀結果。5.結果判定陽性結果：紅細胞抗原與相應抗體在微柱凝膠中形成的特異性抗原抗體復合物浮在凝膠表面或懸于膠中，表明被檢者血清中含有對應其抗原的抗體或紅細胞被致敏。陰性結果：紅細胞完全沉降到微柱管尖底部，表明血清中無相應抗原免疫的抗體或紅細胞沒有被致敏。反應強度：特異性紅細胞抗原抗體復合物完全位于膠表面，為強陽性反應；愈靠近膠底部顆粒愈小，反應愈弱。直抗試驗已出現(xiàn)凝集為陽性，游離和放散試驗均以檢出可以和新生兒紅細胞反應的抗體為陽性。6.檢驗方法的局限性：6.1上腔部分或封口處有氣泡或滴滴的卡，必須在使用前離心6.2濃度過高或過低的紅細胞懸液會引起異常結果。7.產品性能指標：抗人球蛋白抗體效價≧32。8、注意事項8.1應用抗人球蛋白微柱凝膠免疫試驗檢測病人紅細胞時，一定要用適量EDTA的試管采集血液標本，該標本不能放入4-10℃冰箱保存，以避免紅細胞在病人體外致敏所致假陽性反應。8.2紅細胞標本一定不能被細菌污染，否則出現(xiàn)假陽性反應。盡可能應用當日采集的新鮮血做本實驗。如不得不用過夜血或陳舊血，則必須首先用該標本做陰性對照試驗，以確定該標本是否可以做本試驗。8.3如在微柱凝膠中出現(xiàn)溶血現(xiàn)象，強烈提示為紅細胞抗原抗體強陽性反應，也不排除其他原因所致溶血，故對此標本一定認真分析，并向上級主管技術人員多報告并討論。8.4洗出盡量多紅細胞進行放散；注意放散的時間不宜多長，以防溶血；天冷時放散液注意保溫；吸出盡可能多的放散液；注意除去放散液中殘留的紅細胞；放散前紅細胞要充分洗滌，至少四次。8.5每日試驗前，先取出微柱凝膠卡放置至室溫。8.6檢測卡應放在2-25℃儲存，如若長期放在4℃冰箱，建議每1—2個月取出，用專用離心機離心一次，以防止干膠或產生氣泡。9.臨床意義9.1.直接抗人球蛋白試驗是用抗人球蛋白血清檢測不完全抗體或補體質敏的紅細胞，直接抗人球蛋白試驗陽性說明受檢新生兒紅細胞已被血型抗體物質致敏。9.2.游離試驗是檢測新生兒血清中不配合的血型抗體物質，是否致敏新生兒的紅細胞，要靠直接抗人球蛋白試驗和放散試驗來證實，因此該試驗陽性僅表明可能受害。值得注意的是，當新生兒血清中不配合的血型抗體物質含量偏低時，相應的致敏紅細胞上的抗體含量也極低，此時放散試驗由于其靈敏度的限制，放散試驗可能會出現(xiàn)假陰性。單一游離試驗陽性，應結合臨床癥狀加以判斷。9.3.放散試驗是用已知的紅細胞抗原，檢測從新生兒致敏紅細胞上釋放出的抗體，放散試驗陽