大腸桿菌感受態(tài)細胞制備第1頁，課件共13頁，創(chuàng)作于2023年2月一、實驗目的通過本實驗，掌握大腸桿菌感受態(tài)細胞的制備的方法和技術。第2頁，課件共13頁，創(chuàng)作于2023年2月二、實驗原理感受態(tài)細胞制備:所謂感受態(tài)是指受體細胞處于容易吸收外源DNA的一種生理狀態(tài)，可以通過物理與化學方法誘導形成，也可以自然形成，在基因工程技術中通常采用誘導的方法。用于轉化的受體菌細胞一般是限制-修飾系統(tǒng)（Restriction-Modification）缺陷的變異株，以防止對導入的外源DNA的切割，用符號R-M-表示。第3頁，課件共13頁，創(chuàng)作于2023年2月二、實驗原理其基本原理是：細菌處于0℃的CaCl2低滲溶液中，會膨脹成球形，細胞膜的通透性發(fā)生變化，轉化混合物中的質粒DNA形成抗DNase的羥基-鈣磷酸復合物黏附于細胞表面，經(jīng)過42℃短時間的熱激處理，促進細胞吸收DNA復合物，在豐富的培養(yǎng)基上生長數(shù)小時后，球狀細胞復原并分裂增殖，在選擇培養(yǎng)基上可獲得所需的轉化子。第4頁，課件共13頁，創(chuàng)作于2023年2月

三、實驗材料與設備1、用品與與儀器：超凈工作臺、恒溫培養(yǎng)箱、移液器、微型離心管等、臺式冷凍高速離心機、冰箱、制冰機等；1.5mL與0.5mLEppendorf管、tip頭、燒杯、量筒。

鑷子、試管三角瓶、玻璃涂棒、酒精燈、無菌牙簽、吸水紙，一次性塑料手套等；E.coliDH5α受體菌(R-M-)，pGEX-4T-2質粒(Ampr)。第5頁，課件共13頁，創(chuàng)作于2023年2月三、實驗材料與設備2、試劑：LB培養(yǎng)基:蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl10g/L，瓊脂粉15g/L（固體培養(yǎng)基），用10mol/L的NaOH調節(jié)pH為7.0，高壓滅菌；氨芐青霉素貯存液：濃度50-100mg／mL；含有抗菌素的LB平板培養(yǎng)基：將配置好的LB固體培養(yǎng)基高壓滅菌后，冷卻到60度左右，加入氨芐青霉素（終濃度為50μg／mL濃度50-100μg／mL）；第6頁，課件共13頁，創(chuàng)作于2023年2月超凈工作臺第7頁，課件共13頁，創(chuàng)作于2023年2月恒溫培養(yǎng)箱第8頁，課件共13頁，創(chuàng)作于2023年2月制冰機第9頁，課件共13頁，創(chuàng)作于2023年2月高速冷凍離心機和超速離心機等第10頁，課件共13頁，創(chuàng)作于2023年2月四、實驗操作1、從新活化的E.coliDH5α平板上挑取一單菌落，接種于3～5mlLB液體培養(yǎng)中，37℃振蕩培養(yǎng)至對數(shù)生長期(12h左右)；

2、將該菌懸液以1:100～1:50轉接于100mlLB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩擴大培養(yǎng)，當培養(yǎng)液開始出現(xiàn)混濁后，每隔20～30min測一次OD600，至OD600為0.3～0.5時停止培養(yǎng)，并轉裝到1.5mL離心管中；

3、培養(yǎng)物于冰上放置20min；

4、0～4℃，4000g離心10min，棄去上清液，加入1mL冰冷的0.1mo1／LCaCl2溶液，小心懸浮細胞,冰浴20分鐘；第11頁，課件共13頁，創(chuàng)作于2023年2月四、實驗操作

5、0～4℃，

4000g離心10min，倒凈上清培養(yǎng)液，再用1.0mL冰冷的0.1mo1／LCaCl2溶液輕輕懸浮細胞，冰浴20min；

6、0～4℃，

4000g離心10min，棄去上清液，加入100μL冰冷的0.1mo1／LCaCl2溶液，小心懸浮細胞，冰上放置片刻后，即制成了感受態(tài)細胞懸液；

7、制備好的感受態(tài)細胞懸液可直接用于轉化實驗，如果在4℃放置12～24h，其轉化效率可以增高4～6倍；也可加入占總體積15％左右高壓滅菌過的甘油，混勻后分裝于1.5ml離心管中，置