過程分子生物學(xué)第1頁，課件共80頁，創(chuàng)作于2023年2月分子生物學(xué)是生命科學(xué)的主導(dǎo)性學(xué)科基因的表達(dá)與調(diào)控是分子生物學(xué)的主題思想過程分子生物學(xué)是分子生物學(xué)理論發(fā)展的高級階段1953-1983基礎(chǔ)分子生物學(xué)階段20世紀(jì)50年代

DNA雙螺旋模型的建立20世紀(jì)60年代

遺傳密碼的破譯20世紀(jì)70年代

DNA重組技術(shù)的誕生1983-？過程分子生物學(xué)階段20世紀(jì)80年代

動植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)的問世20世紀(jì)90年代

人類基因組計(jì)劃的實(shí)施21世紀(jì)00年代

RNA干擾現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)第2頁，課件共80頁，創(chuàng)作于2023年2月過程分子生物學(xué)5

2

3

4

1

6

基因表達(dá)的調(diào)控機(jī)制細(xì)胞通訊的分子機(jī)制免疫多樣性的分子識別胚胎發(fā)育的基因表達(dá)譜腫瘤發(fā)生的分子機(jī)制基因組學(xué)與系統(tǒng)生物學(xué)第3頁，課件共80頁，創(chuàng)作于2023年2月基因表達(dá)的調(diào)控機(jī)制B

C

D

A

E

F

原核生物基因表達(dá)的啟動開關(guān)真核生物多轉(zhuǎn)錄因子的協(xié)同作用原核生物的RNA結(jié)構(gòu)調(diào)控真核生物的RNA剪切調(diào)控原核生物反義RNA的調(diào)控真核生物sRNA介導(dǎo)的RNA干擾G

真核生物應(yīng)答元件的轉(zhuǎn)錄調(diào)控第4頁，課件共80頁，創(chuàng)作于2023年2月1A

原核生物基因表達(dá)的啟動開關(guān)通過對100多個大腸桿菌啟動子的序列分析，結(jié)果表明：大多數(shù)具有普通生理生化功能的基因所屬的啟動子，具有統(tǒng)一的特征序列。a大腸桿菌啟動子的多樣性TTGACAAACTGTTATAATATATTA16-10bp5-9bp結(jié)構(gòu)基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)-35區(qū)T82T84G78A65C54A45-10區(qū)T80A95T45A60A50T96啟動子一個典型的大腸桿菌啟動子通常包括下列四個結(jié)構(gòu)要素：

第5頁，課件共80頁，創(chuàng)作于2023年2月1A

原核生物基因表達(dá)的啟動開關(guān)絕大多數(shù)原核生物的RNA聚合酶均由五個亞基組成：a2bb’s（全酶），其中a2bb’稱為（核心酶）。各種原核細(xì)菌的a、b、b’亞基呈高度的同源性，唯獨(dú)s因子差別較大。RNA聚合酶核心酶對DNA鏈具有非特異性的親和力（堿性蛋白與酸性DNA之間的靜電引力），但s因子增強(qiáng)了RNA聚合酶與啟動子區(qū)域的特異性結(jié)合。s因子幫助RNAa大腸桿菌啟動子的多樣性聚合酶識別啟動子，同時(shí)啟動轉(zhuǎn)錄。第6頁，課件共80頁，創(chuàng)作于2023年2月大腸桿菌啟動子與s因子的對應(yīng)關(guān)系rpoD普通生理生化TTGACATATAATrpoH熱休克CCCTTGAACCCGATNTrpoN氮源攝取代謝CTGGNATTGCAfliA鞭毛生成CTAAAGCCGATAA基因分子量-35區(qū)序列70,00032,00054,00028,000性質(zhì)間隔區(qū)16-18bp13-15bp6bp15bp-10區(qū)序列第7頁，課件共80頁，創(chuàng)作于2023年2月1A

原核生物基因表達(dá)的啟動開關(guān)枯草桿菌中存在著大約十類不同的啟動子，其中有些隸屬于正常的生理代謝基因，有些則隸屬于噬菌體感染、孢子生成、次級代謝過程中的相關(guān)基因。

b枯草桿菌啟動子的多樣性第8頁，課件共80頁，創(chuàng)作于2023年2月在SPO1噬菌體感染過程中的RNA聚合酶及其s因子SPO1噬菌體感染枯草桿菌后，早期基因表達(dá)；4-5分鐘后，中期基因表達(dá)，早期基因關(guān)閉；8-12分鐘后，晚期基因表達(dá)，中期基因關(guān)閉。早期基因的啟動子由s43識別啟動，這是枯草桿菌細(xì)胞內(nèi)具有廣泛生理生化功能的s因子，與大腸桿菌中的s70同源，組成a2bb‘s43型RNA聚合酶，轉(zhuǎn)錄中期基因表達(dá)所需的s因子編碼基因gp28。中期基因的啟動子由sgp28識別啟動，它與枯草桿菌的核心酶構(gòu)成a2bb‘sgp28型RNA聚合酶全酶，負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)錄晚期基因表達(dá)所需的s因子編碼基因gp33和gp34。晚期基因的啟動子由sgp33和sgp34識別啟動，分別構(gòu)成RNA聚合酶全酶a2bb‘sgp33和a2bb‘sgp34。第9頁，課件共80頁，創(chuàng)作于2023年2月SPO1噬菌體基因表達(dá)的級聯(lián)調(diào)控模式通過更換不同的s因子，識別并作用于不同基因的啟動子，最終導(dǎo)致這些基因有次序地級聯(lián)表達(dá)。前一基因編碼后一基因表達(dá)所需的s因子。第10頁，課件共80頁，創(chuàng)作于2023年2月枯草桿菌的孢子生成過程枯草桿菌在對數(shù)生長階段結(jié)束后，培養(yǎng)基中營養(yǎng)物質(zhì)耗盡，這時(shí)便啟動孢子生成過程：先是DNA復(fù)制，隔膜形成，孢衣合成，母體裂解，孢子釋放。最后在細(xì)胞內(nèi)約40%的mRNA是孢子生專一性的。第11頁，課件共80頁，創(chuàng)作于2023年2月枯草桿菌孢子形成過程中的RNA聚合酶及其s因子當(dāng)環(huán)境壓力（例如營養(yǎng)成份枯竭）時(shí)，枯草桿菌細(xì)胞內(nèi)發(fā)生一連串的磷酸基團(tuán)傳遞反應(yīng)，最終導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子SpoOA的磷酸化。磷酸化了的SpoOA同時(shí)啟動兩種不同操縱子的轉(zhuǎn)錄，分別表達(dá)出sproE和sF。sF一方面啟動sG的表達(dá)，另一方面又激活SpoIIR，后者再激活隔膜結(jié)合型蛋白SpoIIGA，活化了的SpoIIGA將母體細(xì)胞中表達(dá)的sproE裂解為有活性的sE；而在前孢區(qū)域內(nèi)產(chǎn)生的sE均被前孢特有的蛋白酶摧毀殆盡。母體細(xì)胞中sE的活性是激活前孢區(qū)域sG所必需的（通過SpoIIA和一種未知蛋白因子）；而sG的活性又能產(chǎn)生一種信號，跨隔膜激活母體細(xì)胞中的sK。即：sF

→sE

→sG

→sK

。第12頁，課件共80頁，創(chuàng)作于2023年2月枯草桿菌孢子子交叉激活形成過程中兩種途徑的s因sFsEsGsK激活表達(dá)前孢區(qū)母細(xì)胞SpoOASpoOAs43s43sFsproEsEsGsK隔膜第13頁，課件共80頁，創(chuàng)作于2023年2月1A

原核生物基因表達(dá)的啟動開關(guān)鏈霉菌啟動子的結(jié)構(gòu)具有很大的離散性，通過對100多個啟動子序列的比較，可將鏈霉菌啟動子分成三大類：

c鏈霉菌啟動子的多樣性具有典型原核生物啟動子-10區(qū)和-35區(qū)特征的啟動子，僅占21%

具有典型原核生物啟動子-10區(qū)而無保守的-35區(qū)的啟動子既無典型原核生物啟動子-10區(qū)又無保守的-35區(qū)的啟動子第14頁，課件共80頁，創(chuàng)作于2023年2月1A

原核生物基因表達(dá)的啟動開關(guān)天藍(lán)色鏈霉菌（Streptomycescoelicolor）的全基因組中存在多達(dá)65種不同的s因c鏈霉菌啟動子的多樣性s66（hrdB）鏈霉菌最重要的s因子，hrdB-突變是致死性的。hrdB基因全程表達(dá)，稱為看家基因。sWhiG（whiG）鏈霉菌次級代謝基因轉(zhuǎn)錄所需的s因子。sF鏈霉菌孢子生成基因轉(zhuǎn)錄所需的s因子。sBldN（bldN）鏈霉菌氣生菌絲發(fā)育基因轉(zhuǎn)錄所需的s因子。sR（sigR）鏈霉菌響應(yīng)氧化壓力基因轉(zhuǎn)錄所需的s因子。sE（sigE）鏈霉菌感應(yīng)細(xì)胞膜完整性功能所需的s因子。子，其中已被鑒定的有：第15頁，課件共80頁，創(chuàng)作于2023年2月1B

真核生物多轉(zhuǎn)錄因子的協(xié)同作用真核生物尤其是高等真核生物（哺乳動物）由于其細(xì)胞的高度分化，決定了基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制的復(fù)雜性。與原核生物不同，哺乳動物細(xì)胞內(nèi)共有三大類RNA聚合酶系統(tǒng)，它們均由多轉(zhuǎn)錄因子構(gòu)成，識別三大類真核生物的啟動子，分別承擔(dān)rRNA、mRNA、tRNA的轉(zhuǎn)錄。所有三種RNA聚合酶均由8-14個亞基組成，500kD，但它們并不能單獨(dú)啟動基因的轉(zhuǎn)錄。第16頁，課件共80頁，創(chuàng)作于2023年2月1B真核生物多轉(zhuǎn)錄因子的協(xié)同作用啟動子由兩部分元件構(gòu)成。aRNA聚合酶I啟動轉(zhuǎn)錄的程序

RNA聚合酶I

定位于核仁，負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)錄rRNA編碼基因。RNA聚合酶I只作用于一種類型的啟動子，這類第17頁，課件共80頁，創(chuàng)作于2023年2月高等真核生物I型啟動子的結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)基因I

型啟動子轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游控制序列（UCE）核心啟動子GC豐富區(qū)GC豐富區(qū)增強(qiáng)啟動效果啟動基因轉(zhuǎn)錄CTCCGAGTCGNNNNNNNTGGGCCGCCGG人類的這兩個重復(fù)序列具有85%的同原性第18頁，課件共80頁，創(chuàng)作于2023年2月I型啟動子介導(dǎo)rRNA基因轉(zhuǎn)錄的啟動過程RNA聚合酶I在I型啟動子處的定位需要兩種轉(zhuǎn)錄因子并經(jīng)歷三個階段：UBF1（UCE結(jié)合因子）裝配因子SL1（四聚體蛋白復(fù)合物）定位因子其中之一為TBP第19頁，課件共80頁，創(chuàng)作于2023年2月1B

真核生物多轉(zhuǎn)錄因子的協(xié)同作用

RNA聚合酶II

定位于核內(nèi)，負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)錄mRNA的前體分子hnRNA。RNA聚合酶II及其作用的II型啟動子是真核生物細(xì)胞中最廣泛最典型最重要的轉(zhuǎn)錄啟動元件。bRNA聚合酶II啟動轉(zhuǎn)錄的程序第20頁，課件共80頁，創(chuàng)作于2023年2月高等真核生物II型啟動子的結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)基因II

型啟動子轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)啟動子附加區(qū)TATABOX轉(zhuǎn)錄的啟動效率轉(zhuǎn)錄因子和RNApolII識別位點(diǎn)轉(zhuǎn)錄的時(shí)空特異性啟動基因轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)錄起始子Inr第21頁，課件共80頁，創(chuàng)作于2023年2月高等真核生物II型啟動子的結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)基因II

型啟動子轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)啟動子附加區(qū)TATABOXInrOCTBOXATTTGCAT單向性O(shè)ct因子激活GCBOXGGGCGG雙向性SP1因子激活CAATBOXGGCCAATCT雙向性CTF/NF1因子激活上述附加區(qū)元件并不一定同時(shí)存在，而且在間隔、排列順序、拷貝數(shù)上均有很大的可變性。第22頁，課件共80頁，創(chuàng)作于2023年2月高等真核生物II型啟動子的結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)基因II

型啟動子轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)啟動子附加區(qū)TATABOXInrTATABOX

位于-25區(qū)，普遍存在于所有的真核生物細(xì)胞中，由八對堿基組成，兩側(cè)為GC堿基對。少數(shù)不含TATABOX

特征結(jié)構(gòu)的啟動子成為TATA-less啟動子。第23頁，課件共80頁，創(chuàng)作于2023年2月RNA聚合酶II與轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物裝配因子TFIIABEFHJRNA聚合酶II本身由十個以上的亞基組成，這些亞基具有類似于原核細(xì)菌RNA聚合酶中的a、b、b’

亞基功能，但同樣不能識別啟動子。對啟動子的專一性識別由一系列的轉(zhuǎn)錄因子負(fù)責(zé)。這些轉(zhuǎn)因子分為兩大類：裝配因子和定位因子。定位因子聚合酶IITBPTAFa2bb’s因子真核生物：原核生物：第24頁，課件共80頁，創(chuàng)作于2023年2月II型啟動子介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)錄啟動過程各種轉(zhuǎn)錄因子和RNA聚合酶II依次結(jié)合在DNA及其蛋白質(zhì)復(fù)合物上，每種蛋白因子的結(jié)合均使DNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物的空間構(gòu)象發(fā)生一次改變，而這種構(gòu)象變化又是下一輪的蛋白因子加入所必需的第25頁，課件共80頁，創(chuàng)作于2023年2月RNA聚合酶II在近啟動子處暫停介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄延伸調(diào)控機(jī)制以RNA聚合酶II為核心的轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物在II型啟動子處裝配完畢后，轉(zhuǎn)錄啟動。但隨后的轉(zhuǎn)錄進(jìn)程并非像人們想象的那么一帆風(fēng)順。事實(shí)上在很多果蠅和哺乳動物的基因中，剛剛啟動轉(zhuǎn)錄的RNA聚合酶II會在轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)下游20-50個堿基處停頓下來。一些蛋白因子促進(jìn)RNA聚合酶II快速進(jìn)入停頓位點(diǎn)，而NELF（負(fù)延伸因子）和DSIF因子則起到穩(wěn)定處于停頓狀態(tài)的聚合酶II的作用。快速進(jìn)入停頓位點(diǎn)慢速逃離停頓位點(diǎn)第26頁，課件共80頁，創(chuàng)作于2023年2月RNA聚合酶II在近啟動子處暫停介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄延伸調(diào)控機(jī)制RNA聚合酶II從停頓位點(diǎn)逃離的先決條件是一些能促進(jìn)其逃離的蛋白因子的出現(xiàn)。這些因子將正轉(zhuǎn)錄延伸因子b（P-TEFb）招募至RNA聚合酶II處，并使NELF磷酸化。被磷酸化的NELF從RNA聚合酶II上解離，后者得以逃離，轉(zhuǎn)錄加速；反之轉(zhuǎn)錄將緩慢進(jìn)行。Science

319，1791，2008第27頁，課件共80頁，創(chuàng)作于2023年2月1B

真核生物多轉(zhuǎn)錄因子的協(xié)同作用

RNA聚合酶III

定位于核內(nèi)，負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)錄tRNA和小分子核內(nèi)RNA（snRNA）。相應(yīng)的III型啟動子有兩種類型：tRNA編碼基因所屬的啟動子稱為內(nèi)源型啟動子；snRNA編碼基因所屬的啟動子稱為外源型啟動子；cRNA聚合酶III轉(zhuǎn)錄啟動的程序第28頁，課件共80頁，創(chuàng)作于2023年2月高等真核生物III型啟動子的結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)基因III

型內(nèi)源型啟動子轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)BOXABOXCBOXABOXBPSEOCTPolIII結(jié)合區(qū)III

型外源型啟動子轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)結(jié)構(gòu)基因第29頁，課件共80頁，創(chuàng)作于2023年2月III型啟動子介導(dǎo)的tRNA/snRNA基因轉(zhuǎn)錄啟動過程TFIIIB由TBP和另外兩種蛋白因子組成，其功能相當(dāng)于定位因子；TFIIIC和TFIIIF屬于裝配因子。boxAboxCboxAboxB轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)（1型）轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)（2型）TFIIIATFIIICTFIIIATFIIICTFIIICTFIIIATFIIICTFIIICTFIIIBTFIIIBRNAPolIIIRNAPolIIITFIIIBTFIIIB第30頁，課件共80頁，創(chuàng)作于2023年2月1B

真核生物多轉(zhuǎn)錄因子的協(xié)同作用由此可見，TBP是所有三種類型的RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)所必需的。在含有TATABOX的啟動子中，TBP特異性地結(jié)合在DNA的相應(yīng)區(qū)域；在TATAless

型啟動子中，TBP與其它蛋白因子協(xié)同作用，結(jié)合在DNA的特定區(qū)域內(nèi)。第31頁，課件共80頁，創(chuàng)作于2023年2月1C

原核生物的RNA結(jié)構(gòu)調(diào)控RNA的結(jié)構(gòu)調(diào)控是一種轉(zhuǎn)錄啟動后的基因表達(dá)調(diào)控方式，其主要形式表現(xiàn)為轉(zhuǎn)錄的終止與抗終止作用。

aRNA轉(zhuǎn)錄的終止作用原核細(xì)菌擁有兩種機(jī)制終止RNA聚合酶的轉(zhuǎn)錄，它們分別稱為順式終止和反式終止。第32頁，課件共80頁，創(chuàng)作于2023年2月介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄順式終止的內(nèi)源性終止子內(nèi)源性終止子結(jié)構(gòu)的組成為富含GC堿基的發(fā)夾結(jié)構(gòu)以及下游的寡聚U鏈（通常是6個U）。它們由DNA上的終止子序列編碼，出現(xiàn)在轉(zhuǎn)5’

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AUCGCAUAUUACGCGCGGCAUAUAUCGAGGCUAUACUCGGCGCGUAAGGUAAUGURNA聚合酶UUUUUU

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3’

錄中的RNA結(jié)構(gòu)中。真核生物的轉(zhuǎn)錄終止機(jī)制也與順式終止相似。第33頁，課件共80頁，創(chuàng)作于2023年2月介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄反式終止的Rho因子依賴性終止子基因轉(zhuǎn)錄的反式終止多見于噬菌體中。終止位點(diǎn)為CUU中的某個堿基，其上游50-90bp的序列中無莖環(huán)發(fā)夾結(jié)構(gòu)，但堿基組成特殊：C

41%，G14%，A25%，U20%。在這種Rho（r）因子專一性識別的終止子結(jié)構(gòu)內(nèi)，若缺失若干個C，甚至一個C，便會導(dǎo)致不能終止的RNA聚合酶Rho因子識別結(jié)合區(qū)5’

AUCGCUACCUCAUAUCCGCACCUCCUCAAACGCUACCUCGACCAGAAAGGCGUCUCUU

3’

現(xiàn)象發(fā)生。第34頁，課件共80頁，創(chuàng)作于2023年2月反式終止的機(jī)制

Rho因子呈六聚體，具有ATPase活性。當(dāng)RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄出富含C的Rho因子識別位點(diǎn)時(shí)，Rho因子便與轉(zhuǎn)錄出的RNA鏈結(jié)合；

Rho因子沿RNA鏈向RNA聚合酶方向移動，由于其移動速度快于RNA聚合酶，因此當(dāng)RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄出終止位點(diǎn)CUU時(shí)，Rho因子正好趕上；Rho因子水解ATP釋放能量，拆開DNA-RNA雜合鏈，轉(zhuǎn)錄遂終止。但若在Rho因子與RNA聚合酶之間存在著核糖體，則Rho因子不能終止轉(zhuǎn)錄第35頁，課件共80頁，創(chuàng)作于2023年2月1C

原核生物的RNA結(jié)構(gòu)調(diào)控bRNA轉(zhuǎn)錄的抗終止作用在某些特殊條件下，由RNA聚合酶引導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄并不能在終止子處順利終止，這種現(xiàn)象稱為“轉(zhuǎn)錄過頭”，其發(fā)生RNA的結(jié)構(gòu)調(diào)控是一種轉(zhuǎn)錄啟動后的基因表達(dá)調(diào)控方式，其主要形式表現(xiàn)為轉(zhuǎn)錄的終止與抗終止作用。

機(jī)制是細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)錄抗終止作用。第36頁，課件共80頁，創(chuàng)作于2023年2月細(xì)菌衰減子依賴性的轉(zhuǎn)錄抗終止作用UGGUGGCGCACUUCC5’

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另一個則位于正常的基因編碼區(qū)下游。細(xì)胞內(nèi)條件的變化，可使基因的轉(zhuǎn)錄在兩個順式終止子結(jié)構(gòu)的某一個處終止。這種結(jié)構(gòu)稱某些細(xì)菌的結(jié)構(gòu)基因含有兩個順式終止子，其中一個位于基因上游的編碼區(qū)內(nèi)，為衰減子。相互轉(zhuǎn)換第37頁，課件共80頁，創(chuàng)作于2023年2月細(xì)菌衰減子的轉(zhuǎn)錄抗終止機(jī)制大腸桿菌的色氨酸操縱子中含有一個衰減子結(jié)構(gòu)。在基因的5’端編碼區(qū)有兩個連續(xù)排列的色氨酸密碼子。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)色氨酸匱乏時(shí)核糖體在色氨酸密碼子處暫停翻譯，衰減子的2鏈和3鏈形成雙鏈結(jié)構(gòu)，第一個終止子結(jié)構(gòu)不能形成，轉(zhuǎn)錄繼續(xù)進(jìn)行；當(dāng)細(xì)胞內(nèi)色氨酸充足時(shí)，翻譯不在色氨酸密碼子處停止，結(jié)果產(chǎn)生終止子結(jié)構(gòu)，轉(zhuǎn)錄遂終止。第38頁，課件共80頁，創(chuàng)作于2023年2月噬菌體抗終止因子依賴性的轉(zhuǎn)錄抗終止作用大腸桿菌l噬菌體早早期基因和早期基因的表達(dá)產(chǎn)物往往是晚期基因表達(dá)的調(diào)控因子。早早期基因表達(dá)產(chǎn)物的調(diào)控機(jī)制有兩種：一是作為s因子識別早期基因和晚期基因啟動子，啟動表達(dá)這兩組基因；二是作為轉(zhuǎn)錄抗終止因子，使宿主細(xì)胞的RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄過頭，導(dǎo)致早期基因和晚期基因的表達(dá)。這兩種方式均為正調(diào)控作用。第39頁，課件共80頁，創(chuàng)作于2023年2月噬菌體抗終止因子的作用大腸桿菌l噬菌體感染大腸桿菌后，在PL啟動子的介導(dǎo)下表達(dá)出抗終止因子N蛋白，它以一種獨(dú)特的方式使阻止Rho因子的轉(zhuǎn)錄終止作用，使早早期基因轉(zhuǎn)錄過頭并轉(zhuǎn)錄出早期基因的mRNA

N蛋白的半衰期只有五分鐘，它決定了早期基因表達(dá)周期的長短。tL1tR1PLPRNcro左向轉(zhuǎn)錄單位右向轉(zhuǎn)錄單位抗終止因子NtL1tR1第40頁，課件共80頁，創(chuàng)作于2023年2月抗終止因子的工作原理大腸桿菌l噬菌體的抗終止因子N特異性識別早早期基因內(nèi)部的nut位點(diǎn)，并且在RNA聚合酶到達(dá)這里時(shí)與之結(jié)合，形成復(fù)合物。這種復(fù)合物能有效抑制Rho因子的結(jié)合作用，從而干擾Rho因子介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄終止效應(yīng)，導(dǎo)致早早期基因的轉(zhuǎn)錄過頭

Q因子以類似的機(jī)制使得早期基因轉(zhuǎn)錄過頭。啟動子終止子RNA聚合酶nut位點(diǎn)r因子NusB/S10NusANCGCTCTTANNNNNNNNNAGCCCTGAAPuAAGGGCAGCGAGAATNNNNNNNNNTCGGGACTTPyTTCCCGT第41頁，課件共80頁，創(chuàng)作于2023年2月1D

真核生物的RNA剪切調(diào)控真核生物大多數(shù)的分裂基因（即含有內(nèi)含子的基因）在轉(zhuǎn)錄后必須切除內(nèi)含子序列。正常剪切時(shí)，外顯子的序列和個數(shù)是恒定不變的；但有些基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物會出現(xiàn)剪切多樣性，即一種基因轉(zhuǎn)錄物產(chǎn)生多種不同的mRNA，其中包括外顯子的取代、加入、缺失。甚至在某些細(xì)胞內(nèi)，這些由于剪切多樣性而產(chǎn)生的不同蛋白質(zhì)會同時(shí)出現(xiàn)，并且均為細(xì)胞正常生物功能所必需。第42頁，課件共80頁，創(chuàng)作于2023年2月GUAGGUAGGUAGGUAGGUAGGUAG正常剪切模式異常剪切模式第43頁，課件共80頁，創(chuàng)作于2023年2月1D

真核生物的RNA剪切調(diào)控a腺病毒E1A-RNA剪切中的外顯子缺失腺病毒在宿主細(xì)胞內(nèi)能利用一個基因同時(shí)合成三種不同大小的蛋白質(zhì)，其機(jī)理涉及到病毒RNA剪切過程中的外顯子缺失。E1A基因1234外顯子289aa243aa55aa第44頁，課件共80頁，創(chuàng)作于2023年2月1D

真核生物的RNA剪切調(diào)控bSV40病毒大小抗原與剪切多樣性的關(guān)系

SV40病毒基因組含有三個外顯子和一個內(nèi)含子。在表達(dá)小

t抗原蛋白時(shí)，轉(zhuǎn)錄物進(jìn)行正常剪切，只有內(nèi)含子被切除，E1-E2-E3外顯子連成一個成熟的mRNA分子，但E2的末端含有一個終止密碼子，因此在翻譯時(shí)，只翻譯由E1和E2編碼的小抗原在表達(dá)T

大抗原蛋白時(shí)，內(nèi)含子和E2外顯子均被切除，成熟的mRNA中只有E1和E3，但翻譯出的抗原蛋白分子反而大于t抗原。在不同的動物感染細(xì)胞中，存在著不同比例的t/T抗原蛋白，表出不同的性狀。第45頁，課件共80頁，創(chuàng)作于2023年2月RNA多樣性剪切模式產(chǎn)生SV40的t/T抗原GUAGGU抗原蛋白編碼基因t抗原成熟mRNAt抗原多肽鏈GUAGGU抗原蛋白編碼基因T抗原成熟mRNAT抗原多肽鏈E1E2E3E1E2E3第46頁，課件共80頁，創(chuàng)作于2023年2月1D

真核生物的RNA剪切調(diào)控c黑腹果蠅性別決定與剪切多樣性的關(guān)系黑腹果蠅的性別決定過程由三個性別特異性的RNA剪切程序支配，涉及到三個與性別決定有關(guān)的基因：sxltradsx第47頁，課件共80頁，創(chuàng)作于2023年2月sxl基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的多樣性剪切導(dǎo)致雌性細(xì)胞產(chǎn)生Sxl蛋白

sxl基因的外顯子（E3）內(nèi)含有一個終止密碼子，它阻止功能Sxl蛋白質(zhì)的合成。這個外顯子在雄性細(xì)胞的mRNA中存在，但在雌性細(xì)胞中，被剪切多樣性剔除，其結(jié)果是只有雌性細(xì)胞產(chǎn)生Sxl蛋白質(zhì)。Sxl蛋白具有高比例的堿性氨基酸，相似于其它的RNA結(jié)合蛋白，是tra基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物多樣性剪切的調(diào)控因子。

第48頁，課件共80頁，創(chuàng)作于2023年2月tra基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的多樣性剪切導(dǎo)致雌性細(xì)胞產(chǎn)生Tra蛋白

tra基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的異樣性剪切由Sxl蛋白控制，表達(dá)出的Tra蛋白又調(diào)控tra2基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的異常剪切，形成Tra2蛋白。tra和tra2兩基因的tra基因雄性細(xì)胞無功能蛋白雌性細(xì)胞有功能蛋白E1E2E4E3Tra200aa產(chǎn)物均含有剪切所必需的Arg-Ser

RNA結(jié)合區(qū)。第49頁，課件共80頁，創(chuàng)作于2023年2月dsx基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的多樣性剪切導(dǎo)致細(xì)胞產(chǎn)生Dsx兩性蛋白dsx

是一個兩性基因，Tra2蛋白促進(jìn)其正常剪切，表達(dá)出雌性發(fā)育控制蛋白因子；在Tra2蛋白不存在的細(xì)胞中，dsx發(fā)生異常剪切，表dsx基因雌性特異性蛋白雄性特異性蛋白E1E5E4E2E3E6達(dá)出雄性發(fā)育控制蛋白因子。第50頁，課件共80頁，創(chuàng)作于2023年2月黑腹果蠅性別決定的總程序第51頁，課件共80頁，創(chuàng)作于2023年2月1E

原核生物反義RNA的調(diào)控反義RNA是指能與mRNA、DNA片段、RNA引物互補(bǔ)的RNA分子。通過與RNA引物、基因DNA片段、mRNA鏈的互補(bǔ)配對，分別抑制基因的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、翻譯過程。原核生物的反義RNA由反義基因編碼，其本身的轉(zhuǎn)錄可為蛋白因子啟動轉(zhuǎn)錄而正調(diào)控；亦可由蛋白因子降解反義RNA而負(fù)調(diào)控。反義RNA在原核生物中廣泛存在，是一種較為普遍的基因表達(dá)調(diào)控方式。目前，根據(jù)反義RNA原理設(shè)計(jì)的各類反義核酸，在實(shí)驗(yàn)生物學(xué)領(lǐng)域已被廣泛用于基因表達(dá)的特異性阻遏劑；在醫(yī)學(xué)藥學(xué)領(lǐng)域也被用來治療惡性腫瘤及病毒感染等疾病，即反義技術(shù)。第52頁，課件共80頁，創(chuàng)作于2023年2月1E

原核生物反義RNA的調(diào)控a反義RNA抑制DNA復(fù)制

直接抑制機(jī)理：反義RNA直接與DNA的復(fù)制起始位點(diǎn)結(jié)合，阻

間接抑制機(jī)理：反義RNA與RNA引物結(jié)合，使之不能與DNA復(fù)制模板互補(bǔ)，從而間接影響DNA的復(fù)制。如大腸桿菌ColE1質(zhì)粒的復(fù)礙復(fù)制起始蛋白的識別與結(jié)合，導(dǎo)致DNA復(fù)制不能啟動。制、金黃色葡萄球pT181質(zhì)粒的復(fù)制均采用這種機(jī)制。第53頁，課件共80頁，創(chuàng)作于2023年2月控制復(fù)制引物與模板的結(jié)合oriE.coliColE1

plasmid復(fù)制方向rop（+）RopRNAIIRNAI3’5’5’3’反義RNA間接抑制ColEI質(zhì)粒的復(fù)制啟動引物型RNA調(diào)控型RNA第54頁，課件共80頁，創(chuàng)作于2023年2月1E

原核生物反義RNA的調(diào)控b反義RNA抑制基因轉(zhuǎn)錄反義RNA可與mRNA5‘端互補(bǔ)從而阻止mRNA的進(jìn)一步轉(zhuǎn)錄。例如：大腸桿菌中的ticRNA（轉(zhuǎn)錄抑制互補(bǔ)性RNA）可與cAMP受體蛋白的5’端mRNA區(qū)域互補(bǔ)結(jié)合，形成特殊的空間結(jié)構(gòu)而使其轉(zhuǎn)錄停止。第55頁，課件共80頁，創(chuàng)作于2023年2月1E

原核生物反義RNA的調(diào)控c反義RNA抑制mRNA翻譯反義RNA主要的調(diào)控功能表現(xiàn)在翻譯水平上。原核生物的研究已經(jīng)確定，反義RNA抑制翻譯有下列三種作用方式：與mRNA的5’端非編碼區(qū)（5’-UTR）結(jié)合，阻礙其在核糖體上的準(zhǔn)確定位；與mRNA的5’端編碼區(qū)（主要是起始密碼子AUG）結(jié)合，抑制翻譯的起始；與mRNA全編碼區(qū)結(jié)合，抑制其翻譯模板的功能。第56頁，課件共80頁，創(chuàng)作于2023年2月大腸桿菌利用反義基大腸桿菌的ompC和ompF基因編碼外膜蛋白，OmpC使胞內(nèi)滲透壓提高；OmpF使胞內(nèi)滲透壓降低。當(dāng)環(huán)境滲透壓增加時(shí)，膜蛋白EnvE激活胞內(nèi)的OmpR蛋白，后者誘導(dǎo)ompC和micF兩個基因轉(zhuǎn)錄。micF轉(zhuǎn)錄物是ompF-mRNA的反義RNA，它能滅活ompF-mRNA，從而降低胞內(nèi)OmpF的濃度。因調(diào)節(jié)細(xì)胞的滲透壓UUUUUUCUUUAUCCC-CAUUUGUCUGUAAGUCUUUACUUACUGCAUUAUUUAUUACUGACGGGCAGUGG-CAGGUG-UCAUAAAAUGAGGUAAUAAAUAAUGAUUGACAGAACUUAACACAAAUUAAGCGCCGUGUAAUCGGCGCUUUUCAGAGG：SD序列AAUG：起始密碼子EnvZOmpRmicFompFompFmRNAmicFRNA第57頁，課件共80頁，創(chuàng)作于2023年2月大腸桿菌利用反義基大腸桿菌的R1質(zhì)粒上含有hok和sok基因。hok編碼由52個氨基酸組成的穩(wěn)定的毒素蛋白，能使細(xì)胞膜去極化而殺死細(xì)胞。Sok編碼hok的反義RNA。當(dāng)細(xì)胞分裂時(shí)，如果子細(xì)胞沒有分配到R1質(zhì)粒，HoK蛋白就會殺死子細(xì)因維持質(zhì)粒的穩(wěn)定性細(xì)胞，因?yàn)橛H本細(xì)胞中Sok轉(zhuǎn)錄出來的反義RNA不穩(wěn)定而被降解；如果子細(xì)胞分配到R1質(zhì)粒，則Sok基因就能源源不斷地為子細(xì)胞提供反義RNA，以阻斷半衰期較長的hokmRNA翻譯出HoK毒素蛋白，細(xì)胞得以存活。該hok/sok系統(tǒng)保證了細(xì)菌品系的穩(wěn)定性第58頁，課件共80頁，創(chuàng)作于2023年2月1E

原核生物反義RNA的調(diào)控d反義技術(shù)在實(shí)驗(yàn)生物學(xué)和醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用策略受反義RNA特異性阻斷基因表達(dá)的原理啟發(fā)，人們利用生物合成甚至化學(xué)合成的方法，制備了一系列針對特定病變基因（如癌基因）或病原體基因的反義試劑或反義藥物，一方面期望通過這些特異性的基因表達(dá)阻斷試劑，體內(nèi)探查特定基因的功能（即所謂的loss-of-function戰(zhàn)略）；另一方面也希望能利用這些反義藥物對付日趨嚴(yán)重的基因分子疾病和病毒感染疾病。第59頁，課件共80頁，創(chuàng)作于2023年2月由靶基因的反向表達(dá)體內(nèi)生成相應(yīng)的反義RNA將靶基因的編碼序列反向接在轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的下游，轉(zhuǎn)錄出來的RNA即為靶基因5’3’5’3’5’3’5’3’啟動子終止子targetGENEtargetGENEmRNAantisenseRNA會降解RNA。這種戰(zhàn)略缺點(diǎn)在于：反義RNA分子量大，容易引起體內(nèi)免疫攻擊另外，核酸酶也的反義RNA。第60頁，課件共80頁，創(chuàng)作于2023年2月人工設(shè)計(jì)合成修飾型的小分子反義RNA鎖核酸LNA肽核酸PNA核糖核酸RNA第61頁，課件共80頁，創(chuàng)作于2023年2月人工設(shè)計(jì)合成修飾型的小分子反義RNARNASNA第62頁，課件共80頁，創(chuàng)作于2023年2月反義嗎啉寡聚核苷酸anti-MOoligoRNA靶分子人工設(shè)計(jì)合成修飾型的小分子反義RNA第63頁，課件共80頁，創(chuàng)作于2023年2月1F

真核生物sRNA介導(dǎo)的RNA干擾RNA分子在遺傳信息從DNA到蛋白質(zhì)的傳遞過程中扮演著重要的角色，但幾十年來有關(guān)RNA的消息只能聽到微弱的聲音。近年來一連串的發(fā)現(xiàn)表明，一類被稱為小分子RNA（small

RNAs）的物質(zhì)操縱著很多生命過程。它們能改變基因的表達(dá)水平甚至關(guān)閉基因、編輯基因組、哄騙細(xì)胞形成特定的組織。因此該領(lǐng)域的研究成果被《Science》雜志連續(xù)兩年（2001-2002）評為年度十大科學(xué)成就之一。第64頁，課件共80頁，創(chuàng)作于2023年2月1F

真核生物sRNA介導(dǎo)的RNA干擾aRNA干擾作用的發(fā)現(xiàn)1995年，康奈爾大學(xué)的SuGuo在用人工合成的反義RNA阻斷線蟲基因表達(dá)的實(shí)驗(yàn)中偶然發(fā)現(xiàn)，反義RNA和正義RNA都能阻斷靶基因的表達(dá)，他對這個結(jié)果百思不得其解。直到1998年，美國卡內(nèi)基研究所的AndrewFire用確鑿的實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，在正義RNA阻斷基因表達(dá)的實(shí)驗(yàn)中，真正起作用的是小分子的雙鏈RNA，它們是體外轉(zhuǎn)錄正義RNA時(shí)生成的。上述雙鏈RNA對基因表達(dá)的阻斷作用稱為RNA干擾（RNAi）。隨后大量的研究發(fā)現(xiàn)，RNAi現(xiàn)象廣泛存在于線蟲、果蠅、斑馬魚、真菌、植物等生物體內(nèi)，它們借助于RNAi抵御病毒的感染，阻斷轉(zhuǎn)座子的轉(zhuǎn)座作用，以維持其基因組的相對穩(wěn)定性。第65頁，課件共80頁，創(chuàng)作于2023年2月1F

真核生物sRNA介導(dǎo)的RNA干擾aRNA干擾作用的發(fā)現(xiàn)RNA干擾與先前所說的轉(zhuǎn)錄后基因沉默、轉(zhuǎn)基因沉默等術(shù)語都是一回事，但常與基因表達(dá)的反義抑制相混淆。反義抑制過程并不涉及mRNA的催化降解，只是單鏈反義RNA物理上與mRNA結(jié)合并阻斷其翻譯。AndrewFire和CraigMello因他們關(guān)于線蟲RNA干擾的研究（1998）而分享2006年的諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎。第66頁，課件共80頁，創(chuàng)作于2023年2月bRNA干擾的作用機(jī)理

外源性的雙鏈RNA，不管來自病毒RNA基因組的感染還是人工的導(dǎo)入，均在細(xì)胞質(zhì)中被Dicer酶裁剪成20-25bp的短小雙鏈片段，即smallinterferingRNA（siRNA），其3’端含有兩個凸出的堿基，負(fù)責(zé)siRNA的遷移和對靶序列的識別。在RISC復(fù)合物的協(xié)助下，雙鏈siRNA拆成單鏈，然后再與具有互補(bǔ)序列的靶mRNA分子結(jié)合，形成局部雙鏈。后者或遭RNase的降解，或直接阻斷靶mRNA的翻譯。第67頁，課件共80頁，創(chuàng)作于2023年2月1F

真核生物sRNA介導(dǎo)的RNA干擾c細(xì)胞內(nèi)固有的miRNA前已述及，siRNA是由體外來源的雙鏈RNA經(jīng)細(xì)胞內(nèi)的Dicer酶加工的sRNA被命名為：microRNA（miRNA）。進(jìn)一步的探索發(fā)現(xiàn)：在動物、植物、真菌的細(xì)胞核內(nèi)，從結(jié)構(gòu)致密的異染色質(zhì)中心粒區(qū)域的DNA重復(fù)序列上會轉(zhuǎn)錄出一些特殊的RNA前體大分子，它們同樣在類似蛋白因子的作用下，形成長度為21-23個堿基的單鏈sRNA分子，并發(fā)揮特殊的生物學(xué)功能。這種細(xì)胞內(nèi)編碼的固有而成的。那么細(xì)胞內(nèi)是否也存在著固有的RNA類似物呢？第68頁，課件共80頁，創(chuàng)作于2023年2月miRNA的形成首先從異染色質(zhì)中心粒區(qū)域的DNA重復(fù)序列上轉(zhuǎn)錄出大分子的非編碼型RNA前體（pri-miRNA），后者在核內(nèi)被微加工器復(fù)合物（由RNaseIII組成）先切成大約70個核苷酸的莖環(huán)結(jié)構(gòu)（pre-miRNA），然后再被運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞質(zhì)中由Dicer進(jìn)一步裁剪，形成成熟的miRNA分子，最后再由幾種因子裝配而成。第69頁，課件共80頁，創(chuàng)作于2023年2月Science319,1787,2008miRNA的生物功能異染色質(zhì)裝配外成性修飾轉(zhuǎn)錄調(diào)控轉(zhuǎn)錄物剪切調(diào)控轉(zhuǎn)錄物穩(wěn)定調(diào)控翻譯調(diào)控結(jié)構(gòu)域構(gòu)成第70頁，課件共80頁，創(chuàng)作于2023年2月1F

真核生物sRNA介導(dǎo)的RNA干擾dRNA干擾原理的應(yīng)用如果將外源的雙鏈RNA導(dǎo)入細(xì)胞中，則雙鏈RNA分子一方面在Dicer的作用下裂解成siRNA；另一方面在以RNA為模板的RNA聚合酶RdRP的作用下自身擴(kuò)增，其擴(kuò)增產(chǎn)物再被Dicer裂解成siRNA。后者解鏈并與RISC復(fù)合物一起作用于靶mRNA上，一方面使其降解，另一方面又以siRNA作為引物，mRNA為模板，在RdRP催化下合成出mRNA的互補(bǔ)鏈，結(jié)果mRNA也變成了雙鏈RNA