色譜分析法導論一、色譜分析概論問題問題1：什么是色譜法？問題2：為什么色譜法能將混合物分開？問題3：色譜法的分類？問題4：各種色譜法的應用范圍？1、什么是色譜法？茨維特的實驗茨維特：俄國植物學家，主要從事植物色素的研究工作，在1906年發表的文章中，首次提出了色譜的概念。茨維特的實驗因此色譜法是一種分離方法。它的特點是：有兩相，一是固定相，一是流動相，兩相作相向運動。Chromatography將色譜法用于分析中，則稱為色譜分析。色譜分析是一種分離、分析法。2、色譜法分離原理當流動相中所攜帶的混合物流過固定相時，就會和固定相發生作用(力的作用)。由于混合物中各組分在性質和結構上有差異，與固定相發生作用的大小也有差異。因此在同一推動力作用下，不同組分在固定相中的滯留時間有長有短，從而按先后不同的次序從固定相中流出。3、色譜法的分類

按流動相狀態的不同，可分為氣相色譜法(GC)液相色譜法(LC)超臨界流體色譜(SFC)什么是氣相色譜法？以氣體為流動相的色譜法GasChromatogaphy，簡稱GC按固定相狀態的不同可分為：氣固色譜(GSC)氣液色譜(GLC)適合分離分析易汽化（在-190℃-500℃范圍內有0.2-10mmHg的蒸氣壓的）穩定、不易分解、不易反應的樣品，特別適合用于同系物、同分異構體的分離。什么是液相色譜法？以液體為流動相的色譜法LiquidChromatogaphy，簡稱LC適合分離分析高沸點、熱不穩定、離子型的樣品。應用舉例(HPLC)按固定相使用的形式可分為柱色譜（ColumnChromatography）將固定相裝在色譜柱內紙色譜（PaperChromatography）用濾紙做固定相或固定相載體的色譜薄層色譜（ThinLayChromatography）固定相均勻涂在玻璃板或塑料板上外標法——含單點校正缺點：每次分析必須準確稱量被測物和內標物，不適合于快速分析。2-2%，對小峰及不對稱峰的結果準確，是色譜發展趨勢。氫氣為15-25cm/s；由不等路徑造成的色譜峰擴展。將一定量的純物質作為內標物，加入到準確稱量的試樣中。柱徑：柱徑越小，固定相越難填充均勻。在此過程中，部分組分分子先離開固定相表面，發生分子超前，引起色譜峰擴展。但粒徑太小，不易填充均勻，A項又增大。溶質在液體中的擴散系數DL≈10-5cm2/sChromatography增大α是提高分離度最有效的手段。導出理論塔板數的計算公式，作為柱效的評價指標。導出理論塔板數的計算公式，作為柱效的評價指標。優點：應用簡便，不需要其他儀器。為色譜柱的填充提供理論指導氣體試樣一般進樣量為0.俄國植物學家，主要從事植物色素的研究工作，在1906年發表的文章中，首次提出了色譜的概念。由不等路徑造成的色譜峰擴展。毛細管柱A=0，H=B/u+Cu關于分配平衡分配系數K(distributioncoefficient)分配比k又稱為容量因子、容量比、分配容量，是指在一定溫度和壓力下，平衡狀態時組分在固定相中的量與在流動相中的量之比值。是衡量柱子對組分保留能力的重要參數。相比β

色譜柱內固定相和流動相體積之比

是柱型及結構的重要特征。

4.色譜相關術語關于色譜峰關于保留值關于分配平衡

關于色譜峰的術語峰峰高基線峰寬半峰寬峰面積標準偏差σ

色譜峰寬（區域寬度）峰底寬Wb在色譜峰兩邊的轉折點所畫的切線與基線相交的截距。標準偏差σ拐點間距離的一半0.607h半峰寬度峰高一半處的峰寬度

W

1/2=2.354σ峰底寬Wb=4σ拐點處峰寬Wσ=2σ

（4）色譜圖的信息a.色譜峰個數判斷試樣中所含組分的最少數

b.色譜保留值定性

c.色譜峰面積或峰高定量A=KCd.保留值與區域寬度評價柱分離效能依據

e.兩峰間距評價兩組分能否分離關于保留值的術語死時間(tM):無保留組分出峰時間保留時間(tR):從進樣開始到色譜峰最大值出現所需時間調整保留時間(t’R):死體積(VM):保留體積(VR):

調整保留體積(V’R):相對保留值ɑ：二、色譜分析法基本理論研究理論的目的解決色譜峰的分離問題三個色譜基本理論問題色譜熱力學問題——發展高選擇性色譜柱色譜動力學問題——發展高效能色譜柱分離條件的最優化問題——分離條件優化1、色譜動力學理論研究流出曲線展寬的本質及曲線形狀變化的影響因素塔板理論速率理論（1）塔板理論推導

塔板理論將色譜柱比作精餾塔，通過概率理論得到流出曲線方程：為標準偏差當t=tR時，C=Cmax，峰高正比于進樣量C0，是峰高定量的理論基礎。當n越大，柱效越大，Cmax/C0越大。即保留時間一定時，塔板數越多，峰越高。Cmax反比于tR，tR小，Cmax大，保留時間小的組分峰高且窄。tR大，Cmax小，保留時間大的組分峰低且寬。對色譜流出曲線方程的討論由不等路徑造成的色譜峰擴展。導出理論塔板數的計算公式，作為柱效的評價指標。缺點：每次分析必須準確稱量被測物和內標物，不適合于快速分析。分離度與容量因子有關，容量因子越大，分離越好。氫氣為15-25cm/s；速率理論是1956年荷蘭學者VanDeemter等提出，因此又稱作范第姆特方程。塔板高度H是一個抽象的物理量，它的色譜本質是什么？它與哪些參變量有關，又怎樣影響峰的擴張？對實驗的指導意義有限。柱效越高，該柱的分離能力越好。將固定相裝在色譜柱內峰高乘保留值法：適于狹窄峰，快速簡便，常用于工廠控制分析。按固定相狀態的不同可分為：不能解釋流速對理論塔板數的影響。柱色譜（ColumnChromatography）Wσ=2σ改變相比，即改變固定相的量和改變柱死體積，其中死體積對k/(k+1)的影響很大，使用死體積大的柱子，分離度將受到很大損失。常用的聯用方法有：GC-MS、GC-FTIR、LC-MS……柱徑：柱徑越小，固定相越難填充均勻。2-2%，對小峰及不對稱峰的結果準確，是色譜發展趨勢。2-2%，對小峰及不對稱峰的結果準確，是色譜發展趨勢。由流出曲線方程導出：柱效由流出曲線方程導出：H=L/nn是峰相對展寬的量度n是柱效的量度n是常數時，W與tR

成正比n越大，H越小，表明組分在柱中達到的分配平衡次數越多，對分離越有利，但還不能預言各組分有被分離的可能性。

塔板理論的貢獻塔板理論有助于我們形象的理解色譜的分離過程。導出色譜流出曲線方程，它符合高斯分布，與實驗現象相吻合。導出理論塔板數的計算公式，作為柱效的評價指標。塔板理論的局限塔板高度H是一個抽象的物理量，它的色譜本質是什么？它與哪些參變量有關，又怎樣影響峰的擴張？對實驗的指導意義有限。不能解釋流速對理論塔板數的影響。有些假設不合理，如沒有考慮縱向擴散對色譜分離的影響等。（2）速率理論概述速率理論是1956年荷蘭學者VanDeemter等提出，因此又稱作范第姆特方程。運用流體分子規律研究色譜過程中產生色譜峰擴展的因素，導出了理論塔板高度與流動相線速度的關系，揭示了影響塔板高度的動力學因素。

氣相色譜中速率方程的導出速率理論討論的是色譜峰展寬原因，即影響塔板數n的因素，也就是影響塔板高度H的因素。H=A+B/u+Cu渦流擴散項A=2λdp渦流擴散項均勻性因子粒徑渦流擴散項A

由不等路徑造成的色譜峰擴展。由于柱填料粒徑大小不同，粒度分布范圍不一致及填充的不均勻，形成寬窄、長短不同的路徑，因此流動相沿柱內各路徑形成紊亂的渦流運動，有些溶質分子沿較窄且直的路徑運行，以較快的速度通過色譜柱，發生分子超前，反之，有些分子發生滯后，從而使色譜峰產生擴散。

分子擴散項B/u項其中B=2γDg彎曲因子擴散系數分子擴散項由于分子的縱向擴散造成的色譜峰擴展。即由于試樣組分被載氣帶入色譜柱后，是以塞子的形式存在于色譜柱的很小一段空間中，由于在塞子前后存在濃度梯度，因此使運動著的分子產生縱向擴散，引起色譜峰擴展。

傳質阻力項由氣相傳質阻力和液相傳質阻力兩項組成氣相傳質阻力項Cgu試樣組分從氣相移動到固定相表面的過程中，由于質量交換過程需要一定時間（即傳質阻力）而使分子有滯留傾向。在此過程中，部分組分分子隨流動相向前運動，發生分子超前，引起色譜峰擴展。

容量因子液相傳質阻力項CLu試樣組分從固定相表面移動到固定相內部再回到表面的過程中，由于質量交換過程需要一定時間（即傳質阻力）而使分子有滯留傾向。在此過程中，部分組分分子先離開固定相表面，發生分子超前，引起色譜峰擴展。

液相擴散系數液膜厚度氣相色譜中的速率方程

速率方程給我們的什么啟示？為柱型的研究和發展提供理論依據為操作條件的選擇提供理論指導為色譜柱的填充提供理論指導（2）定量要解決的問題問題4：各種色譜法的應用范圍？速率方程給我們的什么啟示？俄國植物學家，主要從事植物色素的研究工作，在1906年發表的文章中，首次提出了色譜的概念。由于混合物中各組分在性質和結構上有差異，與固定相發生作用的大小也有差異。對柱型研究和發展的影響（2）溶質在液體中的擴散系數DL≈10-5cm2/sGolay1957年提出毛細管柱的概念（opentube）分離度與容量因子有關，容量因子越大，分離越好。但粒徑太小，不易填充均勻，A項又增大。速率理論是1956年荷蘭學者VanDeemter等提出，因此又稱作范第姆特方程。以氣體為流動相的色譜法標準偏差σ拐點間距離的一半0.氣相色譜操作條件的選擇混合物經色譜分離后，將各組分直接由接口導入其它儀器中進行定性。H↓，N↑，分離能力大大提高將固定相裝在色譜柱內N的影響，如何提高N？溶質在液體中的擴散系數DL≈10-5cm2/s分配比k又稱為容量因子、容量比、分配容量，是指在一定溫度和壓力下，平衡狀態時組分在固定相中的量與在流動相中的量之比值。對柱型研究和發展的影響（1）A=0?Golay1957年提出毛細管柱的概念（opentube）毛細管柱A=0，H=B/u+CuH↓，N↑，分離能力大大提高對柱型研究和發展的影響（2）B=0?溶質在液體中的擴散系數DL≈10-5cm2/s溶質在氣體中的擴散系數Dg≈10-1cm2/sDL《Dg當采用液體作流動相時

B→0液體作流動相時可用更細的固定相，A↓HPLC柱效比GC要高2~3個數量級操作條件對柱效的影響（1）H-u曲線載氣線速度（流速）的影響最佳流速：u=(B/C)1/2實用最佳流速：比最佳流速更快A與流速無關B/u：當流速小時，對H的大小起主導作用Cu：當流速大時，對H的大小起主導作用容量因子k的影響不同組分k不同，測出的柱效不同在氣相傳質阻力相中，k↑，Cg↑理論上說k越小柱效越高，實際不可取在液相傳質阻力相中，k↑，Cl先↑，后↓當k=1時，最大。希望k在一個合適的范圍內，通過改變柱溫、固定相、柱型參數等可實現。柱溫的影響間接影響、十分復雜對k影響，對擴散系數影響，從而對柱效產生影響，但影響情況難以判斷對色譜柱的填充提供理論指導（1）柱徑：柱徑越小，固定相越難填充均勻。柱長L：柱長增加，總塔板數增加，但分離時間將增加。固定相粒徑dp：根據速率方程，粒徑減小，A項減小，C項減小，柱效增加。但粒徑太小，不易填充均勻，A項又增大。對色譜柱的填充提供理論指導（2）液膜厚度df：從柱效角度考慮，液膜越薄，柱效越高（根據速率方程），但允許的進樣量減小。（1）幾個概念——選擇性系數α定義與相對保留值(ri,s)基本相同不同之處在于選擇性系數是兩個相鄰峰的調整保留值之比（后峰比前峰，α≥1），而不是被測物與標準物質的調整保留值之比（可小于1）它是評價固定液選擇性的指標。選擇性系數越大，該柱對此相鄰峰的分離越好。

幾個概念——有效塔板數N有效在氣相色譜中，通常用有效塔板數N有效和有效塔板高度H有效來評價柱子的分離效能，它扣除了死體積對分離的影響，更好地反映了柱子的實際分離效能。柱效越高，該柱的分離能力越好。對柱型研究和發展的影響（2）如白酒分析國標中采用此法。溶質在液體中的擴散系數DL≈10-5cm2/s其它氣化溫度與具體進樣方式有關。塔板理論有助于我們形象的理解色譜的分離過程。峰高乘半峰寬法：適于對稱峰分配比k又稱為容量因子、容量比、分配容量，是指在一定溫度和壓力下，平衡狀態時組分在固定相中的量與在流動相中的量之比值。因此，k的最佳范圍是1<k<10。其它氣化溫度與具體進樣方式有關。對色譜柱的填充提供理論指導（2）根據速率方程的啟示制備一根性能優良的色譜柱是十分重要的。色譜柱內固定相和流動相體積之比固定相粒徑dp：根據速率方程，粒徑減小，A項減小，C項減小，柱效增加。為操作條件的選擇提供理論指導但粒徑太小，不易填充均勻，A項又增大。液體作流動相時可用更細的固定相，A↓液體作流動相時可用更細的固定相，A↓標準偏差σ拐點間距離的一半0.具體的：對于填充柱，氮氣的實用最佳線速為10-15cm/s；當被測試樣中各組分的濃度變化范圍不大時而用單點校正法。問題4：各種色譜法的應用范圍？將色譜法用于分析中，則稱為色譜分析。幾個概念——分離度RR越大，說明兩組分分離得越好。由于該定義綜合了色譜動力學和熱力學因素，可作為色譜柱的總分離效能指標。(2)色譜分離基本方程（Purnell方程）

公式推導（3）色譜分離基本方程的啟示要改善物質對的分離（提高R），即提高兩相鄰物質的分離度，可以采取以下措施：提高柱效N提高選擇性系數α增大容量因子kN的影響，如何提高N？分離度R與理論塔板數N的平方根成正比關系，增加塔板數，有利于提高分離度。增加柱長可增加N，改善分離，但分析時間將大大延長，峰產生擴展。減小塔板高度H：根據速率方程的啟示制備一根性能優良的色譜柱是十分重要的。根據速率方程選擇合適的色譜條件同樣有效。K的影響，如何改變k？分離度與容量因子有關，容量因子越大，分離越好。k135791113∞k/k+10.500.750.830.880.900.920.931.00但當容量因子大于10，k/(k+1)的改變不大，而分析時間將大大延長。因此，k的最佳范圍是1<k<10。改變容量因子的方法有：改變柱溫改變相比，即改變固定相的量和改變柱死體積，其中死體積對k/(k+1)的影響很大，使用死體積大的柱子，分離度將受到很大損失。在高效液相色譜中改變流動相的配比是最簡便、最有效的方法α的影響，如何改變α？αN有效R=1.0R=1.51.001.0051.011.021.051.101.251.502.00∞650000163000420007100190040014065∞145000036700094000160004400900320145相對保留值（選擇性因子）α越大，分離效果越好。增大α是提高分離度最有效的手段。改變柱溫也可改變α。在氣相色譜中，增大α最有效的手段是改變固定相，選擇合適的固定相種類是解決分離問題的關鍵在高效液相色譜中，流動相的種類和配比是改善分離最簡便有效的方法。（4）分離度究竟要多大？一般來說R應大于1.5。具體工作中應根據樣品要求和定量方法來確定。例如：含量50%的組分，要使峰高定量誤差小于1%，需達到R1/2=1.28，而采用峰面積定量R1/2需1.00。含量1%的組分，要使峰高定量誤差小于1%，需達到R1/2=1.83，而采用峰面積定量R1/2需2.37。3.氣相色譜操作條件的選擇流速柱溫氣化溫度檢測器溫度進樣量載氣種類固定相種類理論上說k越小柱效越高，實際不可取柱色譜（ColumnChromatography）死時間(tM):無保留組分出峰時間柱徑：柱徑越小，固定相越難填充均勻。柱效越高，該柱的分離能力越好。對柱型研究和發展的影響（2）由于分子的縱向擴散造成的色譜峰擴展。固定相粒徑dp：根據速率方程，粒徑減小，A項減小，C項減小，柱效增加。只與固定相和柱溫有關。氫氣為15-25cm/s；色譜法是一種分離方法。保留值與區域寬度評價柱分離效能依據Golay1957年提出毛細管柱的概念（opentube）增大α是提高分離度最有效的手段。導出色譜流出曲線方程，它符合高斯分布，與實驗現象相吻合。試樣組分從氣相移動到固定相表面的過程中，由于質量交換過程需要一定時間（即傳質阻力）而使分子有滯留傾向。外標法——含單點校正導出理論塔板數的計算公式，作為柱效的評價指標。內標法——含內標標準曲線法對色譜柱的填充提供理論指導（1）tR大，Cmax小，保留時間大的組分峰低且寬。Chromatography流速u（Fc）根據速率方程，可計算求出最佳流速，此時柱效最高。在實際工作中，為縮短分析時間，往往使流速稍高于最佳流速。具體的：對于填充柱，氮氣的實用最佳線速為10-15cm/s；氫氣為15-25cm/s；氦氣介于兩者之間。若填充柱內徑為4mm，則體積流速為氮氣30-40ml/min，氫氣40-60ml/min。柱溫Tc直接影響分析效能和分析速度。每一種固定液都有它的最高使用溫度，柱溫不可超過這一溫度，否則固定液揮發流失。柱溫太高，組分揮發度靠攏，不利于分離。但柱溫太低，被測組分的擴散速度下降，分配不能快速達到平衡，影響峰型，柱效下降，并使分析時間大大延長。柱溫選擇的原則是，在保證難分離物質有良好分離的前提下（分離度滿足要求），盡可能采取較高柱溫，以縮短分析時間，保證峰型對稱。汽化溫度一般進樣方法下，汽化溫度比柱溫高30-70℃。進樣量大時高一些好，保證瞬間汽化。保證不可超過試樣的分解溫度。其它氣化溫度與具體進樣方式有關。檢測器溫度一般大于或等于柱溫，具體與檢測器種類有關。進樣量液體試樣一般進樣量0.1-5μl。氣體試樣一般進樣量為0.1-10ml。具體視柱類型，固定液含量（不能超過柱容量）、進樣方式、檢測器的靈敏度和線性范圍等確定。流動相（載氣）種類流動相的種類要視檢測器種類確定。常用的有氫氣（熱導用）、氮氣（氫火焰用）、氦氣（均可用，但價格較高）。氫氣和氦氣適合于快速分析。氮氣做載氣峰型較好，柱效較高。三、色譜定性與定量方法1.色譜定性分析(1)利用保留值及其規律定性各物質在一定的色譜條件下均有確定不變的保留值，因此保留值可作為定性指標。利用純物對照定性利用文獻值對照定性純物質對照定性實現方法利用保留時間和保留體積定性

用相對保留值定性

用已知物增加峰高法定性

應用范圍：適用于簡單混合物，對該樣品已有了解并具有純物質的情況。優點：應用簡便，不需要其他儀器。缺點：定性結果的可信度不高。提高可信度的方法：雙柱、雙體系定性文獻值對照定性分析（GC）實現方法測定相對保留值ri,s測定保留指數I

優點：無需純物質；保留指數具有較好的重現性和精密度；只與固定相和柱溫有關。缺點：對結構復雜的物質，缺乏數據。

適用范圍：適用于簡單混合物，無需純物質。(2)與其它儀器或化學方法聯合定性離線聯用方式化學法儀器法在線聯用方式化學法儀器法色譜柱內固定相和流動相體積之比但粒徑太小，不易填充均勻，A項又增大。但當容量因子大于10，k/(k+1)的改變不大，而分析時間將大大延長。即由于試樣組分被載氣帶入色譜柱后，是以塞子的形式存在于色譜柱的很小一段空間中，由于在塞子前后存在濃度梯度，因此使運動著的分子產生縱向擴散，引起色譜峰擴展。對色譜柱的填充提供理論指導（2）溶質在液體中的擴散系數DL≈10-5cm2/s為柱型的研究和發展提供理論依據即由于試樣組分被載氣帶入色譜柱后，是以塞子的形式存在于色譜柱的很小一段空間中，由于在塞子前后存在濃度梯度，因此使運動著的分子產生縱向擴散，引起色譜峰擴展。如白酒分析國標中采用此法。溶質在氣體中的擴散系數Dg≈10-1cm2/s缺點：對該法的苛刻要求限制了它的使用。保留值與區域寬度評價柱分離效能依據在液相傳質阻力相中，k↑，Cl先↑，后↓當k=1時，最大。氣體試樣一般進樣量為0.適合分離分析易汽化（在-190℃-500℃范圍內有0.峰高乘峰底寬度法：適于矮寬峰其它氣化溫度與具體進樣方式有關。分離度與容量因子有關，容量因子越大，分離越好。直接影響分析效能和分析速度。保留指數具有較好的重現性和精密度；離線聯用方式收集方法：GC中一般采用液氮冷阱冷卻后收集應用范圍：無標準物時，可對較為復雜的混合物進行定性分析缺點：麻煩在線聯用方式用化學方法輔助定性柱前反應：在色譜柱前裝上預處理柱，帶有某些官能團的化合物在預柱中發生物理化學變化，其色譜峰會消失或移動，與反應前色譜圖比較，可初步判斷試樣中含那些官能團。柱后反應：在色譜柱后裝上Ｔ型毛細管分流器，將各組分導入官能團試劑反應管，利用官能團反應對組分進行定性。與其它儀器聯用定性

混合物經色譜分離后，將各組分直接由接口導入其它儀器中進行定性。常用的聯用方法有：GC-MS、GC-FTIR、LC-MS……其它儀器相當于色譜儀的檢測器。使用范圍：復雜樣品的定性。優點：不需要標準物，定性結果可信度高，操作方便。缺點：需要特殊儀器或設備。GC-MS2色譜定量分析(1)色譜定量基礎色譜定量分析是基于被測物質的量與峰面積成正比。在一定色譜條件下有：（2）定量要解決的問題峰面積的測量和計算校正因子的測量與計算色譜定量方法及其應用峰面積的測量與計算積分儀或色譜工作站簡便、速度快，精度高，可達0.2-2%，對小峰及不對稱峰的結果準確，是色譜發展趨勢。手動測量與計算峰高乘半峰寬法：適于對稱峰峰高乘峰底寬度法：適于矮寬峰峰高乘平均峰寬法：適于不對稱峰峰高乘保留值法：適于狹窄峰，快速簡便，常用于工廠控制分析。校正因子的測量與計算相對校正因子由于絕對校正因子與儀器的靈敏度有關，又由于靈敏度與實驗條件相關，且每一檢測器的靈敏度都是不同的，它不容易測量準確，亦無通用性，所以實際工作中使用相對校正因子。相對校正因子的表達式質量校正因子摩爾校正因子相對響應值被測組分的質量標準物質量分子量相對校正因子的測量理論上相對校正因子與試樣、標準物質、檢測器類型、載氣類型有關，與其它色譜條件無關。無純物質時或對結果準確度要求不高時，相對校正因子可通過查表得。

既無純物，手冊上又無數據時，可用一些計算方法估算這些物質的相對校正因子。定量方法校正歸一化法——含歸一化內標法——含內標標準曲線法外標法——含單點校正校正歸一化法推導：應用范圍：