均勻設(shè)計法優(yōu)化咪唑立賓發(fā)酵培養(yǎng)基配方【摘要】本文采用均勻設(shè)計試驗方法對咪唑立賓的發(fā)酵培養(yǎng)基配方進行優(yōu)化，考察淀粉、麩質(zhì)粉、黃豆餅粉和葡萄糖對其發(fā)酵效價和菌體生長量的影響，得到了四個因素的優(yōu)化配比(淀粉%，麩質(zhì)粉%，黃豆餅粉%，葡萄糖%)，發(fā)酵效價比對照培養(yǎng)基提高約%。

【關(guān)鍵詞】咪唑立賓；均勻設(shè)計法；發(fā)酵培養(yǎng)基；優(yōu)化

ABSTRACTUniformdesignmethodwasusedtooptimizethefermentationmediumofmizoribine.Theeffectsofstarch,corngluten,soybeanmealandglucoseontitersandpackedmycelialvolumeofmizoribinewerestudied.Theoptimummediumcontains%starch,%corngluten,%soybeanmealand%glucose.Undertheoptimumcondition,thetitersofmizoribinewas%higherthanthatinthecontrolmedium.

KEYWORDSMizoribine;Uniformdesign;Fermentationmedium;Optimization

咪唑立賓(mizoribine，MZR)是1971年由日本科學(xué)家從Eupenicillumbrefeldianum的培養(yǎng)液中分離得到的一種咪唑類核苷，其化學(xué)名為5羥基1βD呋喃糖基1H咪唑4羧酰胺，屬新型免疫抑制劑之一［1，2］，臨床上主要用于腎臟移植術(shù)后排異反應(yīng)的預(yù)防，治療狼瘡性腎炎、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、腎病綜合征及系統(tǒng)性紅斑狼瘡等［3～5］。由于從土壤中篩選得到的其野生型產(chǎn)生菌的發(fā)酵效價比較低，不具備產(chǎn)業(yè)化的能力，所以近年來對其產(chǎn)生菌的選育和培養(yǎng)基優(yōu)化的研究工作一直在進行。

均勻設(shè)計法已經(jīng)廣泛應(yīng)用于科研和生產(chǎn)的各個方面［6，7］，它在多因素、多水平的試驗設(shè)計場合比正交試驗設(shè)計具有更大的優(yōu)勢［8］。本文以均勻設(shè)計方法為基礎(chǔ)，對實驗室保存的一株咪唑立賓產(chǎn)生菌的發(fā)酵培養(yǎng)基配方進行優(yōu)化，得到了四個主要因素的最優(yōu)配比，優(yōu)化后配方的發(fā)酵效價比對照培養(yǎng)基提高%。

1材料和方法

菌種

正青霉MZ50(本實驗室編號)，實驗室保存。

培養(yǎng)基

斜面培養(yǎng)基PDA，瓊脂，蒸餾水配制。

種子培養(yǎng)基淀粉，葡萄糖，黃豆餅粉，酵母粉，氯化鈉，硫酸鎂，碳酸鈣，。

發(fā)酵培養(yǎng)基(對照)淀粉，麩質(zhì)粉，黃豆餅粉，葡萄糖，pH自然。

搖瓶培養(yǎng)

單菌落轉(zhuǎn)接于斜面，待長出豐滿孢子后接種于種子培養(yǎng)基中，26℃下培養(yǎng)44～48h，然后以%的接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，26℃搖床培養(yǎng)4d，放瓶測定效價。測定方法

(1)菌體生長量(packedmycelialvolume，pmv，%)取發(fā)酵液10ml，3000r/min離心15min，下層菌絲體體積占發(fā)酵液體積的百分比即菌體生長量。

(2)發(fā)酵效價(u/ml)HPLC法。

實驗設(shè)計

設(shè)淀粉、麩質(zhì)粉、黃豆餅粉、葡萄糖四個因素分別為自變量X1、X2、X3和X4，相對發(fā)酵效價和菌體生長量分別為因變量Y1和Y2，各因素及水平列表1。根據(jù)均勻設(shè)計版軟件提供的模型，設(shè)計實驗。

2結(jié)果和分析

實驗結(jié)果

根據(jù)上述設(shè)計進行實驗，所得實驗結(jié)果列表2。

利用均勻設(shè)計軟件進行分析，采用最優(yōu)回歸子集法得到相對發(fā)酵效價(Y1)對4個因素淀粉(X1)、麩質(zhì)粉(X2)、黃豆餅粉(X3)、葡萄糖(X4)的回歸方程為

Y1=++

R2=

采用自選變量法分析得到菌體生長量(Y2)對麩質(zhì)粉(X2)和葡萄糖(X4)的回歸方程為

Y2=++

R2=

對回歸方程的各項參數(shù)進行方差分析，結(jié)果見表3和表4，得到的最優(yōu)解列表5。表1U6(64)實驗因素及其水平表2U6(64)實驗結(jié)果以上發(fā)酵效價為相對值，即設(shè)對照組的發(fā)酵效價為100，

發(fā)酵效價為三次平均值。表3Y1回歸方程的方差分析表4Y2回歸方程的方差分析表5最優(yōu)解由回歸方程的方差分析表可見，Y1回歸方程的F值大于(4，1)，Y2回歸方程的F值大于(3，2)，相關(guān)系數(shù)R2值和p值都很合理，說明方程擬合很好，方程有極其顯著的意義，圖1～4為各因素對發(fā)酵效價和菌體生長量的影響趨勢圖。

驗證實驗

對表5得到的綜合最優(yōu)解條件進行三批驗證實驗，測定發(fā)酵效價和菌體生長量，每批實驗取3個樣品平均值，結(jié)果見表6。

經(jīng)驗證，在表6所列的最優(yōu)發(fā)酵配方條件下，發(fā)酵效價相比對照平均提高約%，菌體生長量為46%，兩項指標均優(yōu)于設(shè)計實驗中各組配方。

分析

由發(fā)酵效價和菌體生長量的回歸方程可見，淀粉和黃豆餅粉對發(fā)酵效價起正交互作用，麩質(zhì)粉和黃豆餅粉對發(fā)酵效價起負交互作用；麩質(zhì)粉和葡萄糖對菌體生長量起負交互作用，但作用并不嚴重。根據(jù)軟件作圖可以更加直觀地看出，淀粉和黃豆餅粉對發(fā)酵效價表6驗證實驗結(jié)果產(chǎn)生正影響(圖1和圖3)，麩質(zhì)粉對發(fā)酵效價和菌體生長量產(chǎn)生負影響(圖2)，葡萄糖對發(fā)酵效價和菌體生長量影響復(fù)雜但有明顯的最優(yōu)值出現(xiàn)(圖4)。

由于咪唑立賓主要是胞外產(chǎn)物，在發(fā)酵效價可觀的情況下，發(fā)酵結(jié)束時菌體濃度越低越有利于后面的發(fā)酵液過濾和提取過程，即菌體濃度低而發(fā)酵效價高的配方是理想的選擇，所以因變量Y1(發(fā)酵效價)的權(quán)重取為1，因變量Y2(菌體生長量)的權(quán)重取為-1進行最優(yōu)解分析。綜合以上分析，由軟件計算得到的最優(yōu)解是可行的，即淀粉%，麩質(zhì)粉%，黃豆餅粉%，葡萄糖%。

3結(jié)論

采用均勻設(shè)計法對咪唑立賓的發(fā)酵培養(yǎng)基配方中的主要組分淀粉、麩質(zhì)粉、黃豆餅粉和葡萄糖的含量進行優(yōu)化，實驗結(jié)果表明，各因素對發(fā)酵效價和菌體生長量均有一定的影響，最后確定各因素的含量為淀粉%，麩質(zhì)粉%，黃豆餅粉%，葡萄糖%，經(jīng)多批實驗驗證發(fā)酵效價比對照平均提高%左右。

另外，對培養(yǎng)基配方進行優(yōu)化只是提高發(fā)酵效價的途徑之一，若要全面提高菌株的發(fā)酵能力，菌種的選育和發(fā)酵工藝的優(yōu)化也是很重要的研究方向。

【參考文獻】

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［6］王艷，周