第三章細胞工程本文檔共155頁；當前第1頁；編輯于星期二\3點22分主要內容第一節概述第二節植物細胞工程第三節動物細胞工程第四節微生物細胞工程(發酵工程)本文檔共155頁；當前第2頁；編輯于星期二\3點22分第一節概述細胞工程概念2.細胞工程的發展3.細胞工程的基礎知識4.細胞工程的相關技術5.細胞工程的應用本文檔共155頁；當前第3頁；編輯于星期二\3點22分細胞工程（cellengineering）：在細胞水平上，采用類似工程設計的方法，運用精巧的細胞學技術，有計劃地改造遺傳結構，從而獲得特定的細胞及產物的有關理論和技術方法的學科。1.

細胞工程概念本文檔共155頁；當前第4頁；編輯于星期二\3點22分廣義的細胞工程

包括所有的生物組織、器官及細胞離體操作和培養技術狹義的細胞工程

指細胞融合和細胞培養技術。1.

細胞工程概念本文檔共155頁；當前第5頁；編輯于星期二\3點22分根據不同的研究層次，細胞工程分為染色體工程、染色體組工程、細胞質工程、和細胞融合工程1.

細胞工程概念本文檔共155頁；當前第6頁；編輯于星期二\3點22分染色體工程是按人們需要，添加，削減或替換生物染色體的技術，根據操作對象的不同，分為動物染色體工程和植物染色體工程。染色體組工程改變染色體組數的技術。如單倍體轉變為多倍體，三倍體西瓜本文檔共155頁；當前第7頁；編輯于星期二\3點22分細胞質工程又稱細胞拆合工程，是通過物理或化學方法將細胞質與細胞核分開，再進行不同細胞間核質重新組合，重新建成新細胞細胞融合工程是利用自然或人工的方法使兩個或幾個不同細胞融合為一個細胞的過程本文檔共155頁；當前第8頁；編輯于星期二\3點22分根據研究對象不同，細胞工程可分為動物細胞工程植物細胞工程微生物細胞工程本文檔共155頁；當前第9頁；編輯于星期二\3點22分2、細胞工程的發展本文檔共155頁；當前第10頁；編輯于星期二\3點22分細胞工程的發展植物細胞培養起源：20世紀初20世紀30年代，植物細胞培養研究取得突破1955年，激動素能促使培養細胞分裂20世紀60年代，建立植物原生質體培養和融合技術20世紀70年代，外源基因能夠植入植物細胞體內1983年，第一個轉基因植物培育成功20世紀90年代后，轉基因植物進入產業化本文檔共155頁；當前第11頁；編輯于星期二\3點22分動物細胞工程起源于疫苗的生產，1920-1950年，開發出病毒或細菌疫苗1951年開發能促使動物細胞體外培養技術50年代以后開始大規模培養動物細胞生產生物制品70年代基因基因重組和雜交瘤技術的研究1982年重組人胰島素研究成功，標志著細胞工程商業化的開始本文檔共155頁；當前第12頁；編輯于星期二\3點22分細胞工程的發展前景本文檔共155頁；當前第13頁；編輯于星期二\3點22分過程離體的植物器官、組織或細胞愈傷組織根、芽植物體外植體脫分化植物激素：細胞分裂素、生長素再分化植物組織培養植物組織培養條件：

含有全部營養成分的培養基、一定的溫度、空氣、無菌環境、適合的PH、適時光照等。本文檔共155頁；當前第14頁；編輯于星期二\3點22分本文檔共155頁；當前第15頁；編輯于星期二\3點22分本文檔共155頁；當前第16頁；編輯于星期二\3點22分植物細胞A植物細胞B原生質體A原生質體B原生質體融合正在融合的原生質體再生出細胞壁雜種細胞愈傷組織雜種植株去細胞壁纖維素酶果膠酶物理方法化學方法：離心振動電刺激聚乙二醇細胞分裂植物組織培養植物細胞融合酶解法人工誘導方法過程本文檔共155頁；當前第17頁；編輯于星期二\3點22分白菜甘藍白菜－甘藍本文檔共155頁；當前第18頁；編輯于星期二\3點22分細胞分化和全能性

多細胞生物體是由各種各樣形態和功能都不同的細胞群所組成。高等動、植物由受精卵細胞開始的胚胎發生過程隨著細胞分裂次數的增加而使得早期胚胎的細胞數量也增加許多。其中有些細胞在形態、結構和功能上逐漸發生了差異，這種細胞之間差異的發生過程就是細胞分化。個體發育的過程就是細胞分化的過程，個體的各種器官和組織都是通過細胞分化形成的。3.細胞工程的基礎知識本文檔共155頁；當前第19頁；編輯于星期二\3點22分爪蟾的細胞核移植實驗，證明細胞核的全能性本文檔共155頁；當前第20頁；編輯于星期二\3點22分4.

細胞工程的相關技術無菌操作技術細胞培養技術細胞融合技術細胞核移植胚胎移植染色體工程克隆本文檔共155頁；當前第21頁；編輯于星期二\3點22分無菌操作技術細胞工程的所有試驗都要求再無菌條件下進行，要求十分嚴格的無菌操作。1、無菌室；2、超凈工作臺；3、生物材料的消毒；4、試驗器械、器皿和藥品的滅菌。本文檔共155頁；當前第22頁；編輯于星期二\3點22分無菌操作室的滅菌與消毒緩沖間無菌室首次啟用的無菌室一般可采用福爾馬林熏蒸（5～6m2無菌室用KMnO450g，倒入100ml甲醛（用搪瓷盤），冒濃煙，24hr，氨水中和至無甲醛味），經常使用的無菌室在每次實驗前必須開啟紫外燈照射0.5至l小時，然后避光0.5至l小時后方可進入操作

本文檔共155頁；當前第23頁；編輯于星期二\3點22分無菌室上風口下風口本文檔共155頁；當前第24頁；編輯于星期二\3點22分緩沖間本文檔共155頁；當前第25頁；編輯于星期二\3點22分培養器材的消毒干熱滅菌法：玻璃器皿、金屬器具等的消毒方法，140～150℃，2～3小時；濕熱滅菌法：橡膠制品、無菌衣、帽和口罩以及除菌過濾器的清毒，高壓蒸汽滅菌115℃20—30分鐘；紫外線照射滅菌：多孔培養板的滅菌－30分鐘。抽濾除菌：培養基等（培養基通過0.22m過濾裝置－除菌）本文檔共155頁；當前第26頁；編輯于星期二\3點22分細胞培養技術

細胞培養是指動物、植物和微生物細胞在體外無菌條件的保存和生長。1、取材和除菌；2、配制培養基，對培養基進行滅菌；3、接種、培養和傳代。本文檔共155頁；當前第27頁；編輯于星期二\3點22分兩個或多個細胞相互接觸后，其細胞膜發生分子重排，導致細胞合并、染色體等遺傳物質重組的過程稱為細胞融合。細胞融合技術的主要過程：1、制備原生質體；2、誘導細胞融合；3、篩選雜合細胞。細胞融合技術本文檔共155頁；當前第28頁；編輯于星期二\3點22分細胞核移植：利用顯微操作技術將一個細胞的細胞核移植到另一個細胞中，或將兩個細胞的細胞核(或細胞質)進行交換，從而可能創造無性雜交生物新品種的一項技術。細胞核移植童魚——世界上第一條沒有父母的魚“鯽金核質雜交魚”本文檔共155頁；當前第29頁；編輯于星期二\3點22分也稱受精卵移植，是指把優良種畜的早期胚胎從供體母畜體內取出來，移到受體母畜的輸卵管或子宮，“借腹懷胎”繁殖后代的技術。它是首先應用于繁殖家畜而發展起來的一種生物工程。試管嬰兒胚胎移植本文檔共155頁；當前第30頁；編輯于星期二\3點22分克隆是指生物體通過細胞進行無性繁殖形成基因型完全相同的后代個體，簡稱“無性繁殖”。例：多莉、克隆猴治療性克隆

克隆技術本文檔共155頁；當前第31頁；編輯于星期二\3點22分多利

克隆猴本文檔共155頁；當前第32頁；編輯于星期二\3點22分277次乳腺細胞核移植實驗；獲得29個發育為8細胞的“胚”；13頭代孕母親；1996年7月5日，羊羔6LL3，被命名為“多莉”。本文檔共155頁；當前第33頁；編輯于星期二\3點22分預想的克隆人技術路線本文檔共155頁；當前第34頁；編輯于星期二\3點22分5.

細胞工程的應用通過細胞培養物獲得藥物和其他有用的物質如人參皂甙通過植物細胞和組織培養獲得快速繁殖的無性系植物產品，包括良種苗木、名貴花卉、稀有資源等如蘭花細胞融合產品如單克隆抗體、番茄薯“二層樓”從細胞培養中篩選合乎希望的突變細胞株、再生突變植株，可培育新品種生殖工程上的應用如借腹懷胎、試管嬰兒

本文檔共155頁；當前第35頁；編輯于星期二\3點22分本文檔共155頁；當前第36頁；編輯于星期二\3點22分美夢終究沒有成功!!番茄薯“二層樓”本文檔共155頁；當前第37頁；編輯于星期二\3點22分第二節植物細胞工程1.植物組織培養2.

植物細胞培養和次生代謝產物的生產3.單細胞分離技術4.植物體細胞雜交5.植物細胞原生質體制備與融合6.單倍體植物的誘發與利用7.人工種子本文檔共155頁；當前第38頁；編輯于星期二\3點22分1.

植物組織培養植物組織培養（概念）是在無菌和人為控制外因（營養成分、光、溫度、濕度）條件下，研究、培養植物組織器官，甚至進而從中分化、發育出整體植株的技術。植物細胞的全能性（理論基礎）

指具有完整細胞核的植物細胞，在一定條件下能不斷分裂和繁殖、發育成完整植株的潛在能力。本文檔共155頁；當前第39頁；編輯于星期二\3點22分1.

植物組織培養的相關概念脫分化

植物分化細胞進入細胞分裂周期，形成愈傷組織。再分化

脫分化的組織或細胞在一定的條件下可分化為各種不同組織的細胞類型。愈傷組織植物組織表面形成的一團無序生長的薄壁細胞團。外植體

能被誘發產生無性增殖系的器官或組織切段。本文檔共155頁；當前第40頁；編輯于星期二\3點22分初代培養最初建立的外植體的無菌培養階段繼代培養將已形成愈傷組織或已分化出根、莖、葉、花等的培養物重新切割，轉移到新的培養基上以進一步擴大培養試管苗通過組織培養所獲得的再生植株本文檔共155頁；當前第41頁；編輯于星期二\3點22分植物細胞工程的基礎技術無菌操作技術組織培養細胞培養花藥及花粉培養離體胚培養原生質體培養本文檔共155頁；當前第42頁；編輯于星期二\3點22分植物組織培養應用試管苗的快速繁殖無病毒植物的培育提取次生代謝產物人工種子的培育轉基因植物的生產本文檔共155頁；當前第43頁；編輯于星期二\3點22分植物組織培養的研究意義運用組織培養方法可以在人為的條件下研究細胞、組織或器官的繁殖、生長和分化，研究環境條件對植物生長發育的影響。在工廠化育苗技術上，組織培養是工廠化育苗的生產配方研究和無病毒種苗擴繁必須經歷的階段；細胞培養技術在中草藥方面的研究不僅可以探索藥用植物生理遺傳和成分生物合成等一系列理論問題，而且還可以為大規模細胞發酵生產藥物提供理論依據和技術參數；在轉基因植物種苗的研究與開發中，組織培養技術即是基本的研究手段，又是規模開發的基本生產形式。本文檔共155頁；當前第44頁；編輯于星期二\3點22分外植體愈傷組織新植株本文檔共155頁；當前第45頁；編輯于星期二\3點22分1.

植物組織培養進行植物組織培養，一般要經歷以下五個階段：1.預備階段；2.誘導去分化階段；3.繼代增殖階段；4.生根成芽階段；5.移栽成活階段。本文檔共155頁；當前第46頁；編輯于星期二\3點22分預備階段(1)選擇合適的外植體；外植體的部位、年齡及大小。(2)除去病原菌及雜菌；對外植體除菌的一般程序如下：外植體自來水多次漂洗消毒劑處理無菌水反復沖洗無菌濾紙吸干(3)配制適宜的培養基。本文檔共155頁；當前第47頁；編輯于星期二\3點22分培養基培養基的成分無機營養物，包括氮、磷、鉀、鈣、硫和鎂等大量元素以及一些微量元素如錳、鋅、銅、鐵、硼碳源，如糖類，2％~4%的蔗糖或葡萄糖是適宜的碳源。維生素，維生素B1(硫胺素)是必需的。本文檔共155頁；當前第48頁；編輯于星期二\3點22分培養基培養基的成分生長調節劑(植物激素)植物生長素，如IAA(吲哚乙酸)、IBA(吲哚-3-丁酸)、NAA(萘乙酸)、2,4-D(二氯苯氧乙酸)、2,4,5-T(三氯苯氧乙酸)。細胞分裂素，如BAP(芐氨基嘌呤)、6-BA(芐基腺嘌呤)、2-ip(異戊烯氨基嘌呤)、激動素(呋喃氨基嘌呤)。有機附加物，一般是蛋白質水解物、酵母提取物、麥芽提取物和椰汁。本文檔共155頁；當前第49頁；編輯于星期二\3點22分培養環境條件光照強度、光質、光周期溫度24-28度；最佳24-26度相對濕度容器相對濕度高達96%-100%；培養室70%-80%本文檔共155頁；當前第50頁；編輯于星期二\3點22分誘導去分化階段使各種細胞重新處于旺盛有絲分裂的分生狀態，培養基中應添加較高濃度的生長素，其結果形成愈傷組織。本文檔共155頁；當前第51頁；編輯于星期二\3點22分繼代增殖階段繼代培養及時分離愈傷組織成適當大小轉移到新配制的培養基上，促進愈傷組織生長增殖。本文檔共155頁；當前第52頁；編輯于星期二\3點22分生根成芽階段誘導胚狀體的形成。胚狀體：在組織培養中分化產生的具有芽端和根端類似合子胚的構造。該階段需細胞分裂素和光照。本文檔共155頁；當前第53頁；編輯于星期二\3點22分咖啡的愈傷組織咖啡的胚狀體本文檔共155頁；當前第54頁；編輯于星期二\3點22分移栽成活階段適度的光、溫、濕條件。可在人工氣候室中鍛煉一段時間。本文檔共155頁；當前第55頁；編輯于星期二\3點22分煉苗的原因試管苗由于是在無菌、有營養供給、適宜光照和溫度，近100%的相對濕度環境條件下生長從葉片上看，試管苗的角質層不發達，葉片通常沒有表皮毛，或僅有較少表皮毛，甚至葉片上出現了大量的水孔，而且，氣孔的數量、大小也往往超過普通苗

本文檔共155頁；當前第56頁；編輯于星期二\3點22分石斛組培苗煉苗本文檔共155頁；當前第57頁；編輯于星期二\3點22分組織培養的應用脫毒快速繁殖

快速繁衍珍稀瀕危植物、名優特新品種和脫毒苗。植物種質資源的保存、挽救瀕于滅絕的植物通過花藥和花粉培養獲得單倍體植株、縮短育種年限本文檔共155頁；當前第58頁；編輯于星期二\3點22分脫毒原因：大多數農作物，特別是通過無性繁殖的植物，受到一種或多種病毒的侵染，導致產量和品質下降。外植體：莖尖或頂端分生組織有時莖尖培養需要與熱處理或化學處理方法結合，才能起到有效的脫毒結果。脫毒苗：利用組織培養獲得的無病毒植株。本文檔共155頁；當前第59頁；編輯于星期二\3點22分草莓本文檔共155頁；當前第60頁；編輯于星期二\3點22分快速繁殖植物組培苗快速繁殖的四個階段無菌苗的建立組培苗的增殖生根移栽本文檔共155頁；當前第61頁；編輯于星期二\3點22分百合本文檔共155頁；當前第62頁；編輯于星期二\3點22分組培室本文檔共155頁；當前第63頁；編輯于星期二\3點22分大花蕙蘭本文檔共155頁；當前第64頁；編輯于星期二\3點22分種質資源的保存保存一個細胞就相當與保存一粒種子，但所占的空間僅為原來的幾萬分之一，而且在-193度的液氮中可以長時間保存，不像種子那樣需要年年更新或經常更新。

本文檔共155頁；當前第65頁；編輯于星期二\3點22分獲得單倍體植株、縮短育種年限通過花藥和花粉組織培養可以獲得單倍體植物，大大縮短了育種時間。使新品種的培育過程大大簡化本文檔共155頁；當前第66頁；編輯于星期二\3點22分2.

植物細胞培養和次生代謝產物的生產植物細胞培養的發展植物細胞培養系統植物細胞培養的應用本文檔共155頁；當前第67頁；編輯于星期二\3點22分植物細胞培養的發展1956年，Routier和Nickell提出工業化培養植物細胞以提取其天然產物。之后，用此方法生產了哈爾堿、人參皂角苷、維斯納精、紫杉醇等。目前，最大批量工業化培養細胞(煙草細胞)已達20噸。我國，培養紅豆杉細胞生產紫杉醇(抗腫瘤)本文檔共155頁；當前第68頁；編輯于星期二\3點22分植物細胞培養系統懸浮細胞培養系統適于大量快速地增殖細胞，但不利于次生物質的積累。固定化細胞培養系統細胞生長緩慢而次生物質含量高。本文檔共155頁；當前第69頁；編輯于星期二\3點22分懸浮細胞培養系統懸浮細胞的來源：愈傷組織需分散細胞，其方法：用果膠酶打破細胞間的連接增加生長激素的濃度，加快細胞分裂和生長速度起始培養把已建立的愈傷組織轉移到適當容器里的液體培養基中，然后置于搖床上不斷振蕩。本文檔共155頁；當前第70頁；編輯于星期二\3點22分進液管排液管進氣管出氣管封閉式植物細胞培養系統優點：結構簡單，易于操作缺點：次生代謝物積累較少本文檔共155頁；當前第71頁；編輯于星期二\3點22分固定化細胞培養系統固定化細胞方法：包埋、吸附載體：海藻酸鈣、K-角叉菜膠、瓊脂及瓊脂糖、聚丙烯酸凝膠、纖維膜、硅藻土、中空纖維、陶瓷等固定化細胞培養培養系統：平床培養系統、立柱培養系統本文檔共155頁；當前第72頁；編輯于星期二\3點22分平床培養系統優點：設備簡單，能更有效的合成次生代謝產物缺點：占地面積大，次生代謝產物累計不均勻，氧氣供應有限本文檔共155頁；當前第73頁；編輯于星期二\3點22分立柱培養系統優點：次生代謝產物的合成度增強，占地面積小本文檔共155頁；當前第74頁；編輯于星期二\3點22分固定化細胞培養系統優點：穩定反應槽內的細胞量，使反應活性穩定，能長期連續運行；能提高反應效率在生物反應器中固定化細胞的密度比懸浮培養密度增加2~4倍包埋細胞抵抗剪切的能力增強，可使用簡單的生物反應器本文檔共155頁；當前第75頁；編輯于星期二\3點22分固定化細胞培養系統固定化細胞培養使細胞與培養基隔離，下游加工胞內產物得到簡化，產物易于細胞分離。細胞生長和有效產物形成不偶聯，優化產物形成而不影響細胞生長。使培養液的粘度極大降低，避免了懸浮培養中出現的細胞結團和透氣差的問題。本文檔共155頁；當前第76頁；編輯于星期二\3點22分3.單細胞分離技術

機械法酶解法本文檔共155頁；當前第77頁；編輯于星期二\3點22分機械法葉片消毒－撕取也表皮暴露葉肉細胞－刮取細胞－培養葉片消毒－過濾、離心凈化細胞－培養本文檔共155頁；當前第78頁；編輯于星期二\3點22分酶解法果膠酶處理細胞，使細胞游離出來酶解液的滲透壓偏低，會造成原生質體在細胞內崩解本文檔共155頁；當前第79頁；編輯于星期二\3點22分本文檔共155頁；當前第80頁；編輯于星期二\3點22分4.植物體細胞雜交

用兩個來自不同植物的體細胞融合成一個雜種細胞，且把雜種細胞培育成新的植物體的方法稱為植物體細胞雜交本文檔共155頁；當前第81頁；編輯于星期二\3點22分植物細胞A植物細胞B原生質體A原生質體B原生質體融合正在融合的原生質體再生出細胞壁雜種細胞愈傷組織雜種植株去細胞壁纖維素酶果膠酶物理方法化學方法：離心振動電刺激聚乙二醇細胞分裂植物組織培養植物細胞融合酶解法人工誘導方法過程本文檔共155頁；當前第82頁；編輯于星期二\3點22分5.植物細胞原生質體制備與融合原生質體的制備原生質體的融合雜合體的鑒別與篩選本文檔共155頁；當前第83頁；編輯于星期二\3點22分原生質體的制備取材與除菌材料來源植物的各組織和器官主要來源：葉片、愈傷組織、懸浮培養細胞、莖尖、根尖、子葉、胚性組織細胞(花粉)除菌肥皂水－清水（3）－酒精（70％）－次氯酸鈉（3％）本文檔共155頁；當前第84頁；編輯于星期二\3點22分原生質體的制備酶解常用的酶：纖維素酶、果膠酶、崩潰酶、半纖維素酶、蝸牛酶需要在酶液中加入適量的滲透穩定劑，常用的滲透穩定劑是甘露醇和山梨醇等糖醇。

分離過濾、低速離心、比重漂浮本文檔共155頁；當前第85頁；編輯于星期二\3點22分原生質體的制備洗滌鑒定形態觀察臺盼藍、熒光素雙醋酸酯本文檔共155頁；當前第86頁；編輯于星期二\3點22分分離原生質體步驟本文檔共155頁；當前第87頁；編輯于星期二\3點22分本文檔共155頁；當前第88頁；編輯于星期二\3點22分熒光顯微鏡下的原生質體煙草本文檔共155頁；當前第89頁；編輯于星期二\3點22分原生質體的融合原生質體融合也稱體細胞雜交，就是使分離下來的不同親本的原生質體之間在人工控制的條件下，像性細胞受精作用那樣互相融合成一體。

常用的融合方法化學法誘導融合物理誘導融合本文檔共155頁；當前第90頁；編輯于星期二\3點22分化學法誘導融合聚乙二醇(PEG)結合高鈣高pH誘導融合法雙親原生質體滴加PEG滴加高鈣高pH溶液洗滌離心篩選，再生本文檔共155頁；當前第91頁；編輯于星期二\3點22分PEG介導本文檔共155頁；當前第92頁；編輯于星期二\3點22分物理誘導融合電融合電融合處理一般可分兩步進行，先給兩極交變電流，產生電泳效應，使原生質體沿著電場的方向排列成串珠狀，這時再給予瞬間的高強度電脈沖，使原生質體膜局部破損而導致融合。

本文檔共155頁；當前第93頁；編輯于星期二\3點22分電融合本文檔共155頁；當前第94頁；編輯于星期二\3點22分上圖：電流作用下原生質體排成列右上：兩個原生質體融合右下：三個原生質體融合本文檔共155頁；當前第95頁；編輯于星期二\3點22分雜合體的鑒別與篩選雜合細胞的顯微鑒別利用親本原生質體大小、顏色的差異互補篩選雜合細胞遺傳互補法：利用每一親本貢獻一個功能正常等位基因，糾正另一親本的缺陷，使雜種細胞表現正常功能如白化互補(aaBB×AAbb)本文檔共155頁；當前第96頁；編輯于星期二\3點22分雜合體的鑒別與篩選互補篩選雜合細胞生長互補法：利用原生質體對培養基成分要求與反應的差異性來選擇雜種細胞的方法抗性互補篩選法：利用親本原生質體對抗生素、除草劑及其他有毒物質的抗性差異來選擇雜種細胞代謝互補法本文檔共155頁；當前第97頁；編輯于星期二\3點22分親本細胞1親本細胞2同型融合細胞異核融合細胞未融合細胞含藥物A和B的培養基存活死亡死亡對藥物B敏感對藥物A敏感本文檔共155頁；當前第98頁；編輯于星期二\3點22分雜合體的鑒別與篩選利用細胞與分子生物學的方法鑒別雜合體根據融合處理后再生長出的植株的形態特征進行鑒別本文檔共155頁；當前第99頁；編輯于星期二\3點22分6.

單倍體植物的誘發與利用單倍體生物是指細胞中僅含一組染色體的個體。單倍體植物種質純，不受顯性等位基因的掩蓋與遮蔽效應影響，人們易于從中挑選出具有可用性狀的隱性突變體，其經濟意義十分顯著。自然發生途徑？本文檔共155頁；當前第100頁；編輯于星期二\3點22分6.

單倍體植物的誘發與利用實驗室誘導單倍體植株的途徑花藥培養花粉培養未授粉子房或胚珠的培養雜交法獲單倍體植株本文檔共155頁；當前第101頁；編輯于星期二\3點22分花藥培養

選取成熟度適中的花蕾或幼穗。花藥預處理：高滲，高溫或低溫。選擇適當的培養基和培養條件。本文檔共155頁；當前第102頁；編輯于星期二\3點22分花粉培養由于花藥培養時一些二倍體的花藥壁細胞也形成愈傷組織，從而增加了培育單倍體植株的難度。1974年Nitsch等首創用擠壓法分離花粉進行培養的方法，只得到約5%的花粉植株。1977年，Sunderland等提出了自然散開法收集花粉的方法，使花粉成株率有所提高，但與花藥培養相比仍低得多。本文檔共155頁；當前第103頁；編輯于星期二\3點22分未授粉子房或胚珠的培養

子房、胚珠中的成熟胚囊由6個單倍體細胞（包括一個卵細胞）和一個具兩個極核的中央細胞構成。1976年，SanNoeum首先從大麥未授粉子房培養獲單倍體植株。由于誘導出的植株大多是單倍體綠苗，因此這可能是一個發展方向。本文檔共155頁；當前第104頁；編輯于星期二\3點22分雜交法獲單倍體植株

雜交，特別是遠源雜交，雜種胚在胚胎發育過程中往往會將一方親本的染色體逐步排出，最終將得到僅含一方染色體的單倍體植物。1970年Kasha利用該原理將球莖大麥與普通大麥雜交，培育出了普通大麥的單倍體胚和植株。由本方法得出的單倍體胚長成的植株都是綠苗，這是本法的突出優點。本文檔共155頁；當前第105頁；編輯于星期二\3點22分單倍體培養物的加倍在誘發單倍體植株的各階段（愈傷組織、幼胚及小苗），都可用0.2%—0.4%秋水仙素處理24-48小時，然后按常規途徑培養，即可獲得染色體加倍的能正常開花、結果的二倍體植株。本文檔共155頁；當前第106頁；編輯于星期二\3點22分7.

人工種子的研制人工種子即人為制造的種子，它是一種含有植物胚狀體或芽、營養成分、激素以及其他成分的人工膠囊。本文檔共155頁；當前第107頁；編輯于星期二\3點22分人工種子的構成及特點人工胚乳胚狀體人工種皮本文檔共155頁；當前第108頁；編輯于星期二\3點22分人工種子的構成及特點人工種子具有以下突出的優點：不受環境因素制約，可以進行工廠化生產；經無性繁育產生，有利于保存優良性狀；與試管苗相比，成本更低，適合機械化耕種；可根據需要在人工胚乳中添加營養物、農藥等。本文檔共155頁；當前第109頁；編輯于星期二\3點22分人工種子的制備胚狀體的制備及其同步生長人工胚乳的制備配制包埋劑及包埋本文檔共155頁；當前第110頁；編輯于星期二\3點22分胚狀體的制備及其同步生長誘導胚狀體同步化生長的措施：低溫法抑制劑法：DNA合成抑制劑分離法通氣法：氮氣、乙烯滲透壓法自然干燥4-7天本文檔共155頁；當前第111頁；編輯于星期二\3點22分人工胚乳的制備常用的人工胚乳：MS(SH、White)培養基+馬鈴薯淀粉水解物0.5×SH培養基+麥芽糖本文檔共155頁；當前第112頁；編輯于星期二\3點22分配制包埋劑及包埋海藻酸鈉中添加營養成分CaCl2溶液中形成人工種皮約10分鐘，使之固化無菌水沖洗后即可播種本文檔共155頁；當前第113頁；編輯于星期二\3點22分人工種子的貯存與萌發人工種子的貯存與萌發使迄今尚未攻克的難關。一般要將人工種子保存在低溫（4-7℃）、干燥（<67%相對濕度）條件下。費用昂貴。本文檔共155頁；當前第114頁；編輯于星期二\3點22分挪威云杉的人工種子本文檔共155頁；當前第115頁；編輯于星期二\3點22分桉樹的人工種子（發芽中）本文檔共155頁；當前第116頁；編輯于星期二\3點22分第三節動物細胞工程1.

細胞組織培養2.

動物細胞融合3.

單克隆抗體技術4.

細胞拆合5.干細胞工程本文檔共155頁；當前第117頁；編輯于星期二\3點22分動物細胞工程理論基礎胚胎干細胞與全息胚學說-細胞全能性動物細胞工程與植物細胞工程的比較目的，技術手段，理論基礎，誘導手段等本文檔共155頁；當前第118頁；編輯于星期二\3點22分本文檔共155頁；當前第119頁；編輯于星期二\3點22分動物細胞工程技術手段一、動物細胞大規模培養技術1、培養條件：35-37度2、培養方式：貼壁培養、懸浮培養、固定化培養3、抗凋亡技術本文檔共155頁；當前第120頁；編輯于星期二\3點22分細胞培養法組織培養法培養物的傳代培養物的長期保存1.細胞組織培養本文檔共155頁；當前第121頁；編輯于星期二\3點22分大多數動物細胞具有貼壁生長的特性，其大規模培養方法有：微導管培養法微載體培養法葡聚糖聚合物微膠囊培養法褐藻酸鈉細胞培養法本文檔共155頁；當前第122頁；編輯于星期二\3點22分組織培養法將小白鼠斷頸處死，然后用75%酒精或1‰新潔爾滅浸泡消毒，迅速進入無菌室。

本文檔共155頁；當前第123頁；編輯于星期二\3點22分將小白鼠置超凈工作臺上，打開腹腔

本文檔共155頁；當前第124頁；編輯于星期二\3點22分用眼科剪和鑷，將腎外膜剪破，并將其剝向腎門，去腎外膜及脂肪，本文檔共155頁；當前第125頁；編輯于星期二\3點22分剪碎組織本文檔共155頁；當前第126頁；編輯于星期二\3點22分接種組織塊本文檔共155頁；當前第127頁；編輯于星期二\3點22分移入培養箱中（注意貼有組織塊的一面朝上），靜止2～3小時，然后將細胞培養瓶輕輕翻轉，繼續靜止培養。本文檔共155頁；當前第128頁；編輯于星期二\3點22分24～48小時后若培養液變成黃色且混濁，表示已被污染；若培養液變成紫色，一般細胞生長不好，則培養液pH過高；若培養液顯為橙黃、橘紅且清澈，一般顯示細胞生長良好。在相差顯微鏡下觀察，若此時見細胞自組織邊緣長出。繼續培養3～5日，再換部分或全部培養液，待多數組織塊的生長暈相接，小心挑掉組織塊，繼續培養3～4天，細胞貼滿細胞培養瓶壁時便可進行傳代培養。觀察本文檔共155頁；當前第129頁；編輯于星期二\3點22分培養物的傳代懸浮培養的細胞：定期將其轉移到新鮮培養基中組織培養物：需剝離組織本文檔共155頁；當前第130頁；編輯于星期二\3點22分經典傳代法冷凍保存(液氮)5%-10%的二甲亞砜(DMSO)10%玻璃化保護劑(PVS2)培養物的長期保存本文檔共155頁；當前第131頁；編輯于星期二\3點22分2、動物細胞融合用自然或人工的方法使兩個或幾個不同細胞融合為一個細胞（含有原來2個細胞的染色體）的過程。親緣較遠的生物體之間是無法正常雜交的，但他們之間的體細胞卻往往能彼此融合，產生出雜種細胞本文檔共155頁；當前第132頁；編輯于星期二\3點22分細胞融合的意義1、克服植物遠緣雜交不親和性、2、擴大遺傳重組范圍、增加變異、創造新品種3、單克隆抗體的生產本文檔共155頁；當前第133頁；編輯于星期二\3點22分動物細胞融合有以下三條途徑：

病毒誘導融合化學誘導融合電激誘導融合本文檔共155頁；當前第134頁；編輯于星期二\3點22分常用的病毒：

副粘液病毒(副流感病毒如仙苔病毒)、天花病毒、皰疹病毒等促融機制：靠病毒表面含有神經氨酸酶一些突起的作用病毒誘導融合本文檔共155頁；當前第135頁；編輯于星期二\3點22分化學誘導融合常用的促融劑：

聚乙二醇(PEG)促融機制：PEG降低細胞表面的極性，導致脂雙層不穩定，引起細胞融合本文檔共155頁；當前第136頁；編輯于星期二\3點22分3.單克隆抗體技術基本原理單抗制備流程本文檔共155頁；當前第137頁；編輯于星期二\3點22分淋巴細胞雜交瘤技術：是將可以分泌單一抗體的淋巴細胞與可以無限增殖的骨髓瘤細胞融合，獲得兼具兩種細胞特性的雜交細胞。這種細胞可以大量增殖并產生純一的抗體，即單克隆抗體。這一技術被譽為免疫學上的一次重大革命。單克隆抗體：由單一克隆的B淋巴細胞產生的抗單一抗原的高度特異性抗體，具有專一性強、質地均一、反應靈敏、可大規模生產等特點基本原理本文檔共155頁；當前第138頁；編輯于星期二\3點22分基本原理通過融合兩種細胞而同時保持兩者的主要特征。兩種細胞：骨髓瘤細胞特征：再培養條件下無限分裂、增殖；次黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖轉移酶(HGPRT)缺失脾淋巴細胞(經抗原免疫)特征：分泌抗體功能和能夠在選擇培養基上生長融合后，形成同時具備抗體分泌功能和保持細胞永生性兩種特征的細胞克隆本文檔共155頁；當前第139頁；編輯于星期二\3點22分單抗制備流程本文檔共155頁；當前第140頁；編輯于星期二\3點22分本文檔共155頁；當前第141頁；編輯于星期二\3點22分4.細胞拆合從不同的細胞中分離出細胞器及其成分，在體外將它們重新組裝成具有生物活性的細胞或細胞其的過程稱為細胞拆合。包括核移植和染色體轉移等。本文檔共155頁；當前第142頁；編輯于星期二\3點22分

核移植進行核移植研究的目的：異種核質關系研究；中間性狀魚細胞核遺傳全能性的研究。胚胎早期細胞、體細胞本文檔共155頁；當前第143頁；編輯于星期二\3點22分爪蟾的細胞核移植實驗，證明細胞核的全能性本文檔共155頁；當前第144頁；編輯于星期二\3點22分動物克隆可以分為三個階段：同種胚胎細胞克隆動物同種體細胞克隆動物異種體細胞克隆動物本文檔共155頁；當前第145頁；編輯于星期二\3點22分同種胚胎細胞克隆動物1981年Illmenses率先報告用小鼠幼胚細胞核克隆出正常小