實驗四血清球蛋白的提純詳解演示文稿本文檔共21頁；當前第1頁；編輯于星期二\1點19分（優(yōu)選）實驗四血清球蛋白的提純本文檔共21頁；當前第2頁；編輯于星期二\1點19分請同學們清洗自己小組以下用品每個小組：層析柱（1支）比色板（2塊）玻璃棒（1支）離心管（1支）滴管（2支）燒杯（2個）試管（13支）注意實驗過程中每用一次清洗一次！本文檔共21頁；當前第3頁；編輯于星期二\1點19分問題1.血清蛋白質的分類？

清蛋白、α1球蛋白、α2球蛋白、β球蛋白、γ球蛋白2.分離純化蛋白質的方法？

電泳、透析及超濾、有機溶劑沉淀、鹽析、免疫沉淀、層析、超速離心法等3.鹽析？層析？透析？

加入中性鹽破壞蛋白質穩(wěn)定因素而使其沉淀（水化膜和電荷層）利用各組分理化性質不同而分離（本實驗是利用組分分子大小不同而分離）半透膜把大小分子分開4.本實驗鹽析所用硫酸銨飽和度是多少？

33%5.定性檢測蛋白質和銨根離子的方法？

縮二脲反應（紫紅色）或者與磺柳酸反應生成白色沉淀納氏試劑（黃色或棕色）本文檔共21頁；當前第4頁；編輯于星期二\1點19分一.實驗目的

1.掌握蛋白質分離純化方法；2.掌握鹽析、凝膠層析、透析法分離純化蛋白質的基本原理；3.熟悉離心機的操作；4.熟悉蛋白質、NH4+定性檢測的方法。本文檔共21頁；當前第5頁；編輯于星期二\1點19分分離純化蛋白質的方法沉淀法鹽析法有機溶劑沉淀法層析法電學法電泳法等電聚焦離子交換層析吸附層析凝膠過濾（分子篩）親和層析離心膜分離技術透析超濾本文檔共21頁；當前第6頁；編輯于星期二\1點19分二.實驗原理

本實驗是應用相同濃度的硫酸銨反復鹽析分離血清中的γ-球蛋白，再利用凝膠層析法除鹽，即可得到比較純的γ-球蛋白。

采用鹽析法分離清蛋白（主要是清蛋白），再用透析方法除去小分子物質。本文檔共21頁；當前第7頁；編輯于星期二\1點19分二.實驗原理（一）鹽析（salting-out）定義：加入大量中性鹽以破壞蛋白質的穩(wěn)定因素并使其從溶液中沉淀析出的現(xiàn)象。原理:破壞蛋白質兩個穩(wěn)定因素：水化膜和電荷層中性鹽：(NH4)2SO4、Na2SO4、NaCl等。優(yōu)點：蛋白質不變性，常用方法。本文檔共21頁；當前第8頁；編輯于星期二\1點19分二.實驗原理（二）透析（dialysis）定義：利用半透膜把大小分子分開。透析法是利用小分子物質在溶液中可通過半透膜，而大分子物質不能通過半透膜的性質，達到分離的方法。其利用半透膜原理，通過擴散、對流體內各種有害以及多余的代謝廢物和過多的電解質移出體外，達到凈化血液的目的，并且達到糾正水電解質及酸堿平衡的目的。臨床應用：血液透析

本文檔共21頁；當前第9頁；編輯于星期二\1點19分二.實驗原理（三）層析（chromatography）

層析技術是利用混合物中各組分物理化學性質（如吸附力、分子形狀和大小、分子極性、分子親和力、分配系數(shù)等）的差別，使各組分在支持物上集中分布在不同區(qū)域，借此將各組分分離。

按層析的原理不同可以分為：吸附層析、分配層析、離子交換層析、凝膠層析和親和層析。（教程P25）

凝膠是一類具有三維空間多孔網狀結構的物質（分子大小不同）

小分子進入凝膠顆粒的微孔中，流程長，下移速度慢；大分子不能進入凝膠顆粒的微孔中去，只能分布在顆粒的間隙中，所以流程短，向下移動速度快。本文檔共21頁；當前第10頁；編輯于星期二\1點19分二.實驗原理凝膠層析法（根據(jù)分子大小差異而分離）本文檔共21頁；當前第11頁；編輯于星期二\1點19分二.實驗原理（四）離心（centrifuge）

離心技術是利用離心力，依據(jù)物質的沉降系數(shù)、擴散系數(shù)和浮力密度差異而進行物質的分離、濃縮和分析的一種技術。本文檔共21頁；當前第12頁；編輯于星期二\1點19分二.實驗原理離心操作要領1、根據(jù)待離心的溶液性質及體積選擇合適的離心管。裝載液體時要按各種離心機操作說明進行。無蓋離心管不能裝的太滿。密封的或有蓋離心管常要求裝滿，以免離心管變形。2、檢查離心管套筒是否完好、套筒內有沒有軟膠墊或棉花。3、精確地平衡離心管及其內容物（配平）。4、平衡后的離心管和內容物（包括套筒）應對稱放置。5、啟動離心時離心速度由慢到快。本文檔共21頁；當前第13頁；編輯于星期二\1點19分二.實驗原理（五）檢測蛋白質、NH4+的方法①檢測蛋白質

縮二脲試劑：溶液顯紫紅色20％磺柳酸：有白色沉淀產生②檢測NH4+

納氏試劑：黃色或棕色本文檔共21頁；當前第14頁；編輯于星期二\1點19分三.實驗操作1、鹽析2、透析3、層析（脫鹽）4、檢測本文檔共21頁；當前第15頁；編輯于星期二\1點19分1、鹽析取離心管一支加入血清2ml加入2mlPBS，搖勻逐滴加入pH7.2飽和(NH4)2SO4

2ml,搖勻上清液（主要含清蛋白）傾入試管中靜置10分鐘，再離心（2000轉/分）10分鐘沉淀用1mlPBS攪拌溶解逐滴加飽和(NH4)2SO4

0.5ml,搖勻傾棄上清液（主要含α、β球蛋白）沉淀即為初步純化的γ－球蛋白透析脫鹽靜置10分鐘，再離心（2000轉/分）10分鐘用于配平用于配平樣品為豬血清本文檔共21頁；當前第16頁；編輯于星期二\1點19分2、透析清蛋白

換水①透析袋剛放入水中時,立即取袋外液體檢查有無NH4＋；②每隔4分鐘檢查一次，共3次，比較NH4＋透出的情況。①約0.5小時，檢查袋外液體的NH4＋情況；②取袋外液2滴，置于小試管中，然后滴加20％磺柳酸1~2滴，觀察有無沉淀產生。水

水

本文檔共21頁；當前第17頁；編輯于星期二\1點19分3、層析

12345678910②上樣γ－球蛋白，PBS10滴溶解

①裝柱

裝柱前用濾紙片堵住層析柱下口，防止下端玻紗堵塞葡聚糖凝膠G－25，柱高3/4~2/3柱長流速：每分鐘10滴左右

③加入洗脫劑PBS10ml④收集20滴換一支試管本文檔共21頁；當前第18頁；編輯于星期二\1點19分⑤

層析后洗脫液檢測每組兩塊比色板,洗凈備用。一塊在各孔滴加納氏試劑（檢測NH4+）,另一塊滴加縮二脲試劑（檢測蛋白質）。若發(fā)現(xiàn)有顯色反應此孔顯色劑棄用。檢測蛋白及銨根離子不用滴管,避免污染,直接用試管傾倒。用“-”表示無現(xiàn)象，用“+”,“++”,“+++”等表示顏色深淺。⑥

回收凝膠本文檔共21頁；當前第19頁；編輯于星期二\1點19分四.實驗結果(用+-號表示，不寫顏色)表1.層析后洗脫液的顯色結果表2.透析后的袋外溶液顯色結果試管編號12345678910縮二脲試劑檢測后現(xiàn)象納氏試劑檢測后現(xiàn)象檢測次數(shù)123456試劑納氏試劑納氏試劑納氏試劑納氏試劑納氏試劑20%磺柳酸現(xiàn)象檢測人：時間：檢測人：時間：本文檔共21頁；當前第20頁；編輯于星期二\1點19分五.注意事項１.正確