第四章中藥制劑的含量測定第一頁，共一百一十四頁，編輯于2023年，星期五第一節含量測定的目的與意義

在我國藥品質量標準中，[鑒別]、[檢查]和[含量測定]項目是判定中藥制劑質量優劣的標準。中藥制劑的鑒別是研究某種原料藥或成分的存在與否，從而判定藥物的真偽，而含量測定項目是研究某種成分的含量高低是否符合規定來判定藥物的優劣。中藥制劑的含量測定是質量控制中的一項重要指標。通過測定制劑中有效成分、毒性成分或某些指標性成分的含量來衡量其制劑工藝的穩定性和中藥材的質量優劣，以保證中藥制劑的質量，達到臨床用藥安全、有效和中藥制劑進入國際市場的需要。

第二頁，共一百一十四頁，編輯于2023年，星期五第二節含量測定樣品的處理

中藥制劑樣品的基質和成分組成十分復雜，而且樣品中被測成分往往含量較低，因此需要對樣品進行各種處理，使其符合所選定分析方法的要求。樣品處理的主要作用有：

將被測成分有效地從樣品中釋放出來，并制成便于分析測定的穩定試樣。

除去雜質、純化樣品，以提高分析方法的重現性和準確度。

富集濃縮或進行衍生化，以測定低含量被測成分。衍生化不僅可提高檢測器的靈敏度，還可以提高方法的選擇性。

使試樣的形式及所用溶劑符合分析測定的要求。

第三頁，共一百一十四頁，編輯于2023年，星期五第二節含量測定樣品的處理

一、樣品的粉碎樣品的粉碎有兩個目的：是保證含量測定所取樣品均勻而有代表性，提高測定結果的精密度和準確度；是使樣品中的被測組分能更快地完全提取出來。粉碎時注意事項：不要粉碎得過細。樣品粉碎得過細，在樣品提取時，會造成過濾困難，因此可視實際情況進行粉碎過篩。避免污染樣品。在粉碎樣品時，要盡量避免由于設備的磨損或不干凈等原因而玷污樣品，防止粉塵飛散或揮發性成分的損失。過篩時，通不過篩孔的部分顆粒決不能丟棄，必須反復粉碎或碾磨，讓其全部通過篩孔。第四頁，共一百一十四頁，編輯于2023年，星期五第二節含量測定樣品的處理

二、樣品的提取對于中藥材和固體制劑樣品，在粉碎后，取粉末適量精密稱定，首先用溶劑進行提取，使被測組分和某些共存組分從中溶解出來（前者必須完全溶出），與濾渣分離后，再對被測組分進行含量測定。下面介紹幾種常見的提取方法：冷浸法回流提取法連續回流提取法超聲提取法超臨界流體提取法第五頁，共一百一十四頁，編輯于2023年，星期五第二節含量測定樣品的處理

（一）冷浸法按所需準確度要求稱取一定量樣品置于帶塞容器內，搖勻后放置，浸泡提取，溶劑用量為樣品重量的10～50倍，并稱重。浸泡時間12～24小時，浸泡期間應注意經常振搖，浸泡后再稱重，補足溶劑充分搖勻，浸泡后的溶液，可取部分測定，也可全部測定。部分測定法（即等量法）是將浸泡后的溶液，用適宜濾器過濾，精密量取一定量體積的濾液，與一定重量的樣品相當，進行測定。此法不適宜揮發性較大的提取溶劑。全部測定法（即總量測定法）是將浸泡后的溶液濾過，濾渣充分用溶劑洗滌至提取完全，合并濾液及洗液，濃縮或蒸干得殘留物用另一溶劑溶解，定量轉入容量瓶，稀釋至刻度，搖勻，進行測定。此法可克服部分測定法的缺陷，且提取時溶劑用量不必精密加入。第六頁，共一百一十四頁，編輯于2023年，星期五（一）冷浸法另外全部測定法中提取液的濃縮蒸干，可根據具體情況采用下列方法：常壓或減壓蒸發，后者具有溫度低、速度快，適于對熱不穩定樣品之優點；自然揮散或氮氣流下吹干。適于小體積樣品和揮發性溶劑，氮氣流能防止氧化；冷凍干燥（常為水溶液），更適于熱不穩定的樣品。冷浸法的優點是操作簡單，適于熱不穩定的樣品，且提取雜質少。其缺點是費時、費溶劑。第二節含量測定樣品的處理

第七頁，共一百一十四頁，編輯于2023年，星期五（二）回流提取法它是將冷浸法中的帶塞容器換成回流裝置，用單一溶劑或混合溶劑于水浴上加熱回流提取，其余操作方法同冷浸法。優點：1、提取效率高于冷浸法；2、且可縮短提取時間，每次提取時間為0.5～2小時，直至提取完全為止。缺點：1、提取雜質較多；2、該法對熱不穩定或具有揮發性的成分不宜使用。第二節含量測定樣品的處理

第八頁，共一百一十四頁，編輯于2023年，星期五第二節含量測定樣品的處理

（三）連續回流提取法樣品置索氏提取器中，利用遇熱可以揮發的溶劑進行反復提取（相當于總是在使用新鮮溶劑提取），一般提取數小時方可完全。優點：1）無需過濾，提取完全后取下虹吸回流管，就可回收溶劑，再用適宜溶劑溶解，定容，進行測定。2）提取效率高，所需溶劑少，提取雜質少，操作簡便。缺點：受熱易分解的成分不宜使用。第九頁，共一百一十四頁，編輯于2023年，星期五第二節含量測定樣品的處理

（四）超聲提取法

樣品置適當的容器中，加入提取溶劑，放入超聲振蕩器中進行提取。一般樣品30分鐘內即可完成，最多不超過1小時。優點：超聲提取能使樣品粉末更好地分散于溶劑中提高提取效率和提取速度。（超聲的助溶作用）缺點：促使化學反應發生（如氧化還原反應、大分子化合物的降解和解聚合作用等）。

對于由浸膏制成的固體制劑，用上述方法提取時，通常是精密稱取適量藥粉于量瓶中，定量加適當溶劑提取后，以干燥濾紙過濾，棄去濾液，取續濾液（防止濾紙吸附或污染被測組分），按部分測定法測定。第十頁，共一百一十四頁，編輯于2023年，星期五第二節含量測定樣品的處理

（五）超臨界流體提取法（Supercritical-fluidextraction,SFE）它是以超臨界流體（常用CO2）作提取溶劑，有效、快速提取固體或半固體中的被測成分的樣品預處理新技術。超臨界流體（SF）是指高于臨界壓力（Pc）和臨界溫度（Tc）時所形成的單一相態，它既不是液體，又不是氣體，而具如下特性：對樣品組分溶解能力強。超臨界流體（SF）的密度與液體的相近（如CO2超臨界流體的密度為0.3～0.9g/cm3），而其具有與液體相似的溶劑作用；2)有利于樣品中的被測成分擴散進入SF中。SF的粘度與氣體相近，比液體的略低2個數量級，擴散系數卻比液體的高1個數量級以上，使其具有良好的傳質性能；第十一頁，共一百一十四頁，編輯于2023年，星期五3)

SF能使提取效率和提取速度大大提高。SF的表面張力幾乎為零，而較容易滲透進樣品基質空隙中，有利于SF與樣品的充分接觸；4)同一種SF在不同溫度和壓力下可以提取極性或分子大小都不相同的化學成分。SF的密度、粘度和擴散系數等都與溫度、壓力和流體組成有關。溫度和壓力稍高于臨界點時，SF的壓縮系數最大，壓力的微小變化將導致較大的密度變化，而控制密度就可控制SF對溶質的溶解能力，目前也常用升壓力（即升密度）提取法進行分步提取。最常用的SF是CO2，它的性質穩定，使用安全，價格低廉，臨界點低（Tc=31℃和Pc=7.4MPa），易于操作。

第二節含量測定樣品的處理

第十二頁，共一百一十四頁，編輯于2023年，星期五第十三頁，共一百一十四頁，編輯于2023年，星期五第二節含量測定樣品的處理

SFE具有優點：速度快萃取效率高、方法準確度高、選擇性較高、節省溶劑、易于自動化，可避免使用易燃，有毒的有機溶劑，能與色譜和光譜等分析儀器直接聯用的特點。SFE不僅常用于熱不穩定成分或揮發性成分的萃取，而且也越來越多地用于熱穩定性成分的萃取。缺點：對設備要求高。第十四頁，共一百一十四頁，編輯于2023年，星期五第二節含量測定樣品的處理

三、樣品的分離凈化（一）沉淀法原理：它是基于某些試劑與被測成分或雜質生成沉淀，分離沉淀或保留溶液以得到精制的方法。這種方法須注意：1）過量的試劑若干擾被測組分的測定，則應設法除去；2）大量雜質以沉淀形式除去時，被測成分應不因產生共沉淀而損失；3）被測組分生成沉淀時，其沉淀經分離后可重新溶解或直接用重量法測定。第十五頁，共一百一十四頁，編輯于2023年，星期五第二節含量測定樣品的處理

（二）蒸餾法原理：利用某些被測成分具有揮發性，可采用蒸餾法，收集餾出液進行含量測定，或某些成分經蒸餾分解生成揮發性成分，利用分解產物（要求結構明確）進行測定。目前以水蒸氣蒸餾法應用較多。1）它可分為共水蒸餾法（即直接加熱法）、通水蒸汽蒸餾法和水上蒸餾法。如中藥制劑中的揮發油，某些小分子生物堿（麻黃堿、於堿、檳榔堿）及丹皮酚等，都可用蒸餾法提取和分離凈化。2）為了使揮發性成分更完全地蒸餾出來，有時也可用鹽析作用，即在蒸餾液中加入一定量的無機鹽，常用NaCl、NaSO4、MgSO4等。第十六頁，共一百一十四頁，編輯于2023年，星期五第二節含量測定樣品的處理

（三）液一液萃取法（LLE）

常用的兩種LLE方法是有機溶劑直接萃取法和離子對萃取法。⒈直接萃取法原理：利用試樣中被測成分與干擾成分在有機溶劑（萃取劑）中的溶解度不同，通過多次萃取來達到分離凈化的目的。多次萃取雖然有利于提高萃取回收率和結果的準確度，但多次溶液轉移等操作又會帶來誤差。有時對于組分復雜，含量低的樣品，由于樣品數量多，多次萃取費時等原因，只要每次測得的回收率重現性好，常在可接受的回收率前提下可采用單次提取。直接萃取法常用的溶劑有氯仿，二氯甲烷，乙酸乙酯和乙醚等。可根據被測組分疏水性的相對強弱來選擇極性適當的溶劑，既保證被測組成的充分萃取，又有很好的選擇性。對于弱酸性成分應調節水相的pH≤Ka-2。而弱堿性成分應調節水相的pH≥PKa+2（此處為其共軛酸的pKa），以使弱酸、弱堿性成分主要以非離子化的游離酸、或堿形式存在，而提高萃取率。在提取過程中也常利用中性鹽的鹽析作用，如水相用NaCl飽和，使被測組分進入有機相而提高提取率。

第十七頁，共一百一十四頁，編輯于2023年，星期五第二節含量測定樣品的處理

⒉離子對萃取法：其原理是在適當的pH介質中，某些有機酸（堿）性物質形成的離子與帶相反電荷的離子（也稱離子對試劑）定量地結合成為弱極性的離子對，而易溶于有機溶劑，使之萃取分離。它最適合于高度電離的有機酸、堿化合物的萃取（不能用直接法萃取），在中藥制劑分析中主要用于生物堿（B）的分析，其離子對試劑常為酸性染料（In-）如溴麝香草酚藍（BTB）和溴甲酚綠（BCG）等，在水相中的定量反應為BH+（水相）+In_(水相)BH+·In-（水相）BH+·In-（有機相）形成的離子對BH+·In-常用成氫鍵能力強的氯仿或二氯甲烷提取。由上反應可知要求水相中生物堿和酸性染料均有較高的離子化程度，因此必須注意水相的pH和離子對試劑的選擇。通常生物堿與BTB形成1∶1的離子對，最好在pH5.2～6.4提取，而二元堿形成1∶2離子對，最好在pH3.0～5.8提取（二元堿的堿性弱，需要在較低的pH下離子化后形成離子對）。若氯仿層中的微量水份引起渾濁，可通過加入少許乙醇或久置分層變得澄清，也可分離有機相后加入脫水劑（常用無水Na2SO4）或經濾紙濾過除去微量水份，另外液一液萃取時應盡量避免發生乳化現象。第十八頁，共一百一十四頁，編輯于2023年，星期五第二節含量測定樣品的處理

（四）色譜法

吸附色譜、分配色譜、離子交換色譜和凝膠色譜皆可作為中藥制劑分析中的凈化分離方法，其操作方式有柱色譜，薄層色譜和紙色譜。其中經典微柱色譜，也稱固相萃取或液—固萃取（LSE）具有設備簡單，使用方便，快速，凈化效率較高而最常用，將在此做一簡介。LSE通常是指樣品溶液加到裝有合適固定相（凈化劑）的長5`～15cm，內徑0.5～1cm的色譜柱中，將被測成分保留于柱上，洗去雜質后，再洗脫被測成分進行測定，或者是使雜質強烈保留于柱上，直接洗脫被測成分進行測定。用這種選擇性好而柱效較低的方法進行樣品的凈化分離，尤其適用于一類總成分的含量測定，也可將色譜柱流出的樣品進一步用GC、HPLC、TCL分離后測定。LSE的常用凈化劑（填料）有氧化鋁、氧化鎂、硅藻土、硅膠、活性炭、大孔樹脂離子交換樹脂、鍵合相硅膠C8、C18、聚酰胺等。視其性質可分為親脂型、親水型和離子交換型填料。第十九頁，共一百一十四頁，編輯于2023年，星期五固相萃取操作一般有四步：活化--除去柱子內的雜質并創造一定的溶劑環境。上樣--將樣品用一定的溶劑溶解，轉移入柱并使組分保留在柱上。淋洗----除去不需要的組分。洗脫---用小體積的溶劑將組分淋洗下來并收集。第二十頁，共一百一十四頁，編輯于2023年，星期五第二節含量測定樣品的處理

⒈硅膠、氧化鋁等：

它們是傳統的吸附劑，多以0.07～0.15mm(200～100目)的顆粒1～5g用于樣品的凈化處理，其作用機制為溶質在吸附劑表面的極性吸附作用。通常是當溶于有機溶劑的樣品加到柱上時非極性或低極性的雜質先被洗出色譜柱，再用適當極性的溶劑洗脫被測成分，而強極性的雜質仍保留在柱上。氧化鋁能將黃酮類吸附在柱上，用于生物堿、苷類等的測定。例如用ＵＶ法（吸收系數法）硅膠適合于分離中性或酸性化合物，強烈保留堿性化合物。若把樣品提取液加到柱上，依次用極性由小到大的溶劑洗脫，則可以將雜質和被測成分分離。另外，硅膠也和下面所述的硅藻土等一樣，還可作親水型填料使用，常見的商品硅膠柱為Sep-pakSilica，通常以甲醇、水處理后上樣。第二十一頁，共一百一十四頁，編輯于2023年，星期五⒉鍵合相硅膠：十八烷基鍵合相硅膠（簡稱C18或ODS）是常用的固體萃取劑，其次有烷基、苯基、氰基鍵合相硅膠，可用來分開脂溶性和水溶性雜質或成分。也常用于萃取，純化水基質體液中憎水性藥物。該類LSE的一般操作程序為：1)柱的活化。用2ml甲醇沖洗以潤濕鍵合相和除去雜質，再用0.5毫升水洗去柱中的甲醇。2)上樣。3)清洗。用2～5ml的水清洗以除去弱保留的親水成分，如無機鹽、氨基酸、親水的蛋白質、糖以及中等保留成分的極性化合物、低肽等。4)洗脫。用2～5ml甲醇或甲醇-水洗脫大分子的肽、甾體、較親脂的藥物等強保留的待測組分。第二節含量測定樣品的處理

第二十二頁，共一百一十四頁，編輯于2023年，星期五⒊大孔樹脂：它可分為極性和非極性型極性丙烯酰胺聚合物;非極性苯乙烯和二乙烯苯的共聚物.其吸附性質與烷基鍵合相硅膠相似，通過疏水作用對非極性水溶性成份有吸附力。例如在測定復方歸芪劑中的黃芪甲苷時，用大孔樹脂除去水溶性的多糖雜質，再用30%乙醇洗脫黃芪甲苷。大孔樹脂的主要特點是表面積極大，傳質速率較高和具有不同的極性及適于吸附較大分子。樹脂在使用前需要前處理：用甲醇、乙醇、丙酮等有機溶劑除去雜質，有時還需用酸、堿清洗。該填料用量常為1～2g，有時也用100～150mg來萃取血、尿中藥物，操作程序類似ODS填料。第二節含量測定樣品的處理

第二十三頁，共一百一十四頁，編輯于2023年，星期五第二節含量測定樣品的處理

⒋聚酰胺：它是常用的有機吸附劑，主要通過與溶質形成氫鍵而產生吸附作用。常用于含酚、酸、醌類藥物樣品液的凈化分離，如測定黃酮時，用樣品的乙醇提取液上柱，水洗去部分雜質，以95%乙醇洗脫總黃酮后測定。

第二十四頁，共一百一十四頁，編輯于2023年，星期五第二節含量測定樣品的處理

⒌硅藻土、纖維素：

它們為常用的親水型填料，其原理為分配作用。填料作為支持劑，多以水基質液作為固定相，與水不混溶的有機溶劑為流動相，較親脂的成分從固定相轉移到流動相，而被洗脫，達到萃取的目的。其萃取率較高（一般大于80%），無濃集作用，萃取液較純凈，但洗脫劑用量較大（一般大于5ml）硅藻土柱則用干柱直接上樣，柱可再生。常見牌號為Extretut。纖維素柱的使用與硅藻土柱相似。第二十五頁，共一百一十四頁，編輯于2023年，星期五⒍離子交換樹脂：憎水基質的離子交換樹脂兼有離子交換劑及大孔樹脂的一些性質，所以對于在水中溶解度不大的藥物、洗脫劑中需含一定量的有機溶劑。離子交換樹脂柱可用于除去樣品中的離子，防止組分分解，更常用于萃取樣品液中可離解化合物。第二節含量測定樣品的處理

第二十六頁，共一百一十四頁，編輯于2023年，星期五第二節含量測定樣品的處理

此外，近年來發展起來的固相微萃取(Solid-Phasemicroextraction,SPME)和液相微萃取(Liquid-Phasemicroextraction,LPME)技術有良好的應用前景。SPME是一種無溶劑的萃取技術，取樣方式有直接取樣和頂空取樣。第二十七頁，共一百一十四頁，編輯于2023年，星期五（五）消化法

對樣品進行有機破壞，常用于中藥制劑中重金屬的檢查。常用的破壞方法有濕法消化和干法消化法。⒈濕法消化：根據所用試劑不同，下面介紹三種常見的消化方法。（1）硝酸—高氯酸法該法破壞能力強，反應較激烈，故進行破壞時，必須嚴密注意切勿將容器中的溶液蒸干，以免發生爆炸。本法適用于血，尿、組織等生物樣品和含動植物藥制劑的破壞，經破壞后所得無機金屬離子均為高價態，本法對含氮雜環類有機物破壞不夠完全。（2）硝酸—硫酸法該法適用于大多數有機物質的破壞，無機金屬離子均氧化成高價態，與硫酸形成不溶性硫酸鹽的金屬離子的測定，不宜采有此法。第二節含量測定樣品的處理

第二十八頁，共一百一十四頁，編輯于2023年，星期五第二節含量測定樣品的處理

（3）硫酸—硫酸鹽法本法所用硫酸鹽為硫酸鉀或無水硫酸納，加入硫酸鹽的目的是為了提高硫酸的沸點，以使樣品破壞加速完全。同時防止硫酸在加熱過程中過早地分解為SO3而損失。經本法破壞所得金屬離子，多為低價態。本法常用于含砷或銻的有機樣品的破壞，破壞后得到三價砷或銻。濕法消化所用的儀器，一般為硅玻璃或硼玻璃制成的凱氏瓶（直火加熱）或聚四氟乙烯消化罐（烘箱中加熱）。所用試劑應為優級純，水應為去離子水或高純水，同時必須按相同條件進行空白實驗校正。操作時應在通風櫥內進行。

第二十九頁，共一百一十四頁，編輯于2023年，星期五第二節含量測定樣品的處理

⒉干法消化

本法是將有機物灼燒灰化以達分解的目的，將適量樣品置于瓷坩鍋、鎳坩鍋或鉑坩堝中，常加無水Na2CO3或輕質MgO等以助灰化，混勻后，先小火加熱，使樣品完全炭化，然后放入高溫爐中灼燒，使其灰化完全即可。本法不適用于含易揮發性金屬（如汞、砷等，）有機樣品的破壞。應用本法時要注意以下幾個問題：1）加熱灼燒時，控制溫度在420℃以下，以免某些被測金屬化合物的揮發。2）灰化完全與否，直接影響測定結果的準確度。如欲檢查灰化是否完全，可將灰分放冷后，加入稍過量的稀HCl-水（1:3）或硝酸-水（1:3）溶液，振搖。若呈色或有不溶有機物，可于水浴上將溶液蒸干，并用小火炭化后，再行灼燒。3）經本法破壞后，所得灰分往往不易溶解，但此時切勿棄去。第三十頁，共一百一十四頁，編輯于2023年，星期五第三節常用定量分析方法

分類重量分析和滴定分析。化學分析法所用儀器簡單，結果準確。主要用于測定制劑中含量較高的一些成分及含礦物藥制劑中的無機成分，如總生物堿類、總酸類、總皂苷及礦物藥制劑等。化學分析法有一定的局限性，其靈敏度低，操作繁瑣、耗時長，專屬性不高，對于微量成分準確性不理想。第三十一頁，共一百一十四頁，編輯于2023年，星期五第三節常用定量分析方法（一）重量分析法重量法可分為揮發法、萃取法和沉淀法。1、揮發法可測定具有揮發性或能定量轉化為揮發性物質的組分含量。如：①供試品的干燥失重測定；②水分測定均屬揮發法；③中藥制劑分析中灰分及熾灼殘渣的測定等。2、萃取法是根據被測組分在互不相溶的兩相中溶解度的不同，達到分離的目的。如①冰硼散中冰片的含量測定；②地奧心血康膠囊中甾體總皂苷含量測定；③昆明山海棠片中總生物堿的含量測定；④甘草浸膏中甘草酸的含量測定即采用萃取法。3、沉淀法是將被測組分定量轉化為難溶化合物，測定其含量的方法，適用于制劑中純度較高的成分。如①西瓜霜潤喉片中西瓜霜的含量測定；②苦參片中苦參總堿的含量測定；③復方元胡注射液總堿的測定。第三十二頁，共一百一十四頁，編輯于2023年，星期五第三節常用定量分析方法（二）滴定分析法滴定分析法分為酸堿滴定法、沉淀滴定法、配位滴定法和氧化還原滴定法。1、酸堿滴定法適用于測定中藥制劑中所含有的生物堿、有機酸、內酯類等酸、堿組分的含量。①直接滴定：對于K·C≥10-8的酸、堿組分，可在水溶液中直接滴定。如：止喘靈注射液中總生物堿的含量測定、顛茄酊中生物堿的含量測定。②間接滴定或非水滴定法：如大山楂丸中總酸性物質的含量測定、草烏注射液中生物堿的含量測定等。2、沉淀滴定法主要用于生物堿、生物堿的氫鹵酸鹽及含鹵素的其他有機成分的含量測定。第三十三頁，共一百一十四頁，編輯于2023年，星期五第三節常用定量分析方法3、配位滴定法包括EDTA法和硫氰酸銨法，在中藥制劑分析中，用以測定鞣質、生物堿及含Ca2+、Mg2+、Fe3+、Hg2+等礦物類制劑的含量。如①萬氏牛黃清心丸等的含量測定就采用硫氰酸銨法；②牛黃解毒片中石膏的含量測定。4、氧化還原滴定法適用于測定具有氧化還原性的物質，如含酚類、糖類及礦物藥Fe、As等成分的中藥制劑。如①磁朱丸中全鐵的含量測定采用鈰量法；②牛黃解毒片中雄黃的含量測定；③丹皮酚注射液中丹皮酚的含量測。第三十四頁，共一百一十四頁，編輯于2023年，星期五第三節常用定量分析方法二、可見一紫外分光光度法該法是中藥及其制劑含量測定的一種常用方法,具有靈敏度高，精度好和操作簡便等優點。該法要求被測成分本身或其顯色產物對可見—紫外光具有選擇性吸收。按測定波長數目不同分為單波長光譜法和多波長光譜法。

第三十五頁，共一百一十四頁，編輯于2023年，星期五紫外分光光度計工作原理紫外吸收光譜圖第三十六頁，共一百一十四頁，編輯于2023年，星期五第三節常用定量分析方法（一）單波長光譜法

分類方法特點吸收系數法測定所配供試品溶液在規定波長的吸收度，根據被測成分的吸收系數（E1%1cm）計算其含量①對儀器要求高，使用該法時，應注意儀器波長、空白吸收的校正，吸收度準確度的檢定和雜散光的檢查②無需對照品，方法簡便對照品比較法在同樣條件下配制對照品溶液和供試溶液，且使前者中所含被測成分的量應為后者中被測成分的量的100%±10%，用規定波測定二者的吸收度，則可計算出供試品中被測成分的濃度或含量對儀器要求較高標準曲線法配制一系列不同濃度的對照品溶液（常為5個），在相同條件下分別測定吸收度，繪制A-C曲線，或求出其回歸直線方程（相關系數r≥0.999），即得標準曲線。在相同條件下，測定供試品溶液的吸收度，就可求得供試品中被測成分的濃度或含量。①本法對儀器的精度要求不高，有時標準曲線不通過原點，只要重現性好也可使用②該法在比色法中最常用第三十七頁，共一百一十四頁，編輯于2023年，星期五第三節常用定量分析方法（二）多波長光譜法（計算分光光度法）

供試品溶液中若有多種（兩種或兩種以上）組分共存，其紫外光譜彼此發生不同程度的重疊時，則可通過測定多種波長處的吸收度，根據吸收度的加和性，采用適當的數學處理方式進行多組分的同時測定，或者用其排除共存組分干擾，測定其中的某個組分。這就屬于多波長光譜法的范疇。

第三十八頁，共一百一十四頁，編輯于2023年，星期五第三節常用定量分析方法測定步驟①UV光譜測定：它是指分別測定被測組分和干擾組分溶液的UV光譜于同一坐標系中（即重迭掃描）。被測組分的光譜通常用純化學對照品配制成適當濃度的溶液進行測定。對于干擾組分化學結構已知者，也可用純化學對照品測定其UV光譜，而對于干擾成分的組成尚不清楚者，通常用陰性樣品代替干擾成分來測定UV光譜。陰性樣品分為缺含被測成分藥材（即缺味）陰性樣品和缺被測成分陰性樣品。②波長選擇：它是指根據各種測定方法的原理選擇一組合適的波長。使得既能消除共存組分的干擾，又能使被測組分的測定靈敏度高（即回歸直線方程的斜率大）和測定誤差小。第三十九頁，共一百一十四頁，編輯于2023年，星期五2．測定步驟③標準曲線繪制：通常按樣品測定條件，用標準品配制5～7種不同濃度的溶液（必要時可加入干擾組分），分別測定各所選波長處的吸收度，然后計算其回歸直線方程（要求其相關系數r≧0.999）。④樣品測定：配制被測組分濃度處于標準曲線線性范圍內的樣品溶液（平行3～5份），測定各所選波長處的吸光度。按回歸直線方程和稀釋度計算樣品中被測組分的濃度或含量。第三節常用定量分析方法第四十頁，共一百一十四頁，編輯于2023年，星期五第三節常用定量分析方法計算分光光度法的特點：在測定組成已知的復雜樣品時，可省去或簡化樣品預處理步驟；中藥制劑分析中，干擾組分或陰性空白樣品的變動性大，使得其方法的適應性差，而只適應于同樣品或內控應用；當測定的吸收度處在吸收曲線的陡峭部位時，波長的微小變動可能對測定結果造成顯著的偶然誤差；在實際工作中，由于測試條件的變化及儀器與性能的限制，多波長法常用標準曲線法進行樣品的測定。第四十一頁，共一百一十四頁，編輯于2023年，星期五第三節常用定量分析方法三、薄層掃描法

薄層掃描法是以薄層色譜法為基礎發展起來的薄層色譜組分原位分析方法及薄層色譜的記錄方法，又稱薄層色譜掃描法（TLCS），相應儀器稱為薄層掃描儀（ThinLayerChromatogramScanner）。薄層掃描法是用一定波長的光照射在薄層板上，對薄層色譜中吸收紫外光或可見光的斑點，或經激發后能發射出熒光的斑點進行掃描，將掃描得到的圖譜及積分數據用于藥品的鑒別、雜質檢查或含量測定。第四十二頁，共一百一十四頁，編輯于2023年，星期五第三節常用定量分析方法（一）基本原理

薄層掃描法是指薄層色譜斑點的色譜掃描，薄層色譜掃描是指固定波長，斑點移動，測定A-l(吸光度-波長曲線)或F-l曲線(在固定發射波長下的熒光強度F隨展開距離L的變化所測定的F-L曲線)

。根據薄層掃描的測定方式分為薄層吸收掃描法和薄層熒光掃描法二種方法。第四十三頁，共一百一十四頁，編輯于2023年，星期五

三、儀器及其工作原理

1.薄層掃描儀中國藥典采用雙波長薄層掃描儀。常用的有島津CS-930型和CAMAG-Ⅱ型等。2.掃描儀工作原理第四十四頁，共一百一十四頁，編輯于2023年，星期五第三節常用定量分析方法1、薄層吸收掃描法基本原理：Kubelka-Munk理論及曲線。由于薄層板存在明顯的散射現象，斑點中物質的濃度與吸光度的關系需用Kubelka-Munk理論及曲線來描述。Kubelka-Munk理論以斑點的相對反射率和相對透光率計算薄層色譜斑點的吸光度，說明了固定相的散射參數SX對斑點中物質的濃度與吸光度間關系的影響，獲得不同散射參數SX時斑點的A-KX理論曲線，即Kubelka-Munk曲線。光源：鎢燈和氘燈；靈敏度：在200-800nm波長范圍內選擇合適波長進行測定，其靈敏度可達ng級；適用范圍：適用于在可見、紫外區有吸收的物質，及通過色譜前或色譜后衍生成上述化合物的樣品組分。第四十五頁，共一百一十四頁，編輯于2023年，星期五2、薄層熒光掃描法基本原理：F=2.3K’I。ECL或F=KC光源：氙燈或汞燈。靈敏度：最低可測到10-50pg(1pg=10^-12g)。適用范圍：適合于本身具有熒光或經過適當處理后可產生熒光的物質的測定。

Kubelka-Munk理論不適用于薄層熒光掃描，無需進行曲線校直。用薄層熒光掃描進行定量分析時，用斑點熒光強度的積分值（色譜峰峰面積）與斑點中組分的含量代替上式中F與C進行運算。第三節常用定量分析方法第四十六頁，共一百一十四頁，編輯于2023年，星期五（二）薄層色譜的規范化操作1、儀器與材料①薄層板；②涂布器；③點樣器材；④展開箱（層析缸）⑤顯色與檢測儀器2、操作方法①薄層板的制備；②點樣；③展開；④檢測；第三節常用定量分析方法第四十七頁，共一百一十四頁，編輯于2023年，星期五第三節常用定量分析方法（三）定量分析方法1、方法學考察新建薄層掃描定量方法必須進行方法考察，以說明新建方法的可靠性，考察的內容有工作曲線、定量結果的精密度及準確度、統計檢驗等內容。第四十八頁，共一百一十四頁，編輯于2023年，星期五（1）工作曲線

①檢查所選擇的散射參數SX值是否適宜。SX值適宜則工作曲線被校直為直線，否則，調整SX值再校正，直至在一定點樣量范圍內工作曲線成直線為止。②考察工作曲線是否過原點，以便確定采用一點法或二點法定量。③確定點樣量的線性范圍。既使采用曲線校直，也只是在一定點樣量范圍內工作曲線為直線，因此需確定點樣量的上、下限。為降低定量誤差，最好調整點樣量，使供試品與對照品的峰面積相接近。為了克服薄層板間差異，外標法及內標法均應采用隨行標準法，即標準溶液與供試品溶液交叉點在同一塊薄層板上。第三節常用定量分析方法第四十九頁，共一百一十四頁，編輯于2023年，星期五第三節常用定量分析方法（2）精密度考察

取同一供試品溶液，在同一塊薄層板上以相同點樣量平行點5點以上，展開后測定其峰面積，求算相對標準差（RSD），作為衡量定量分析結果精密度的指標。RSD應小于4%。

式中：為n次測量的平均值，S為標準差。第五十頁，共一百一十四頁，編輯于2023年，星期五第三節常用定量分析方法（3）準確度考察回收率是衡量定量方法準確度的指標，常用加樣回收率（R）來衡量，其值應在95-105%之間，測量數據一般為5-6個。將加入純品的試樣溶液、供試品溶液及標準溶液點于同一塊薄層板上，展開后進行薄層掃描，測定各斑點的峰面積，計算各溶液中組分的量，計算回收率（R）。第五十一頁，共一百一十四頁，編輯于2023年，星期五（4）統計檢驗統計檢驗是檢驗兩種方法、兩臺儀器或兩個人測量的兩組實驗數據的精密度或準確度（偶然誤差或系統誤差）間是否存在顯著性差異，說明新建定量方法可否代替舊方法或優于舊方法。統計檢驗包括F檢驗與t檢驗。

F檢驗即精密度差別檢驗，用以檢驗兩組數據的精密度或偶然誤差是否存在顯著性差異，一般為單側檢驗。

t檢驗即準確度差別檢驗，用以檢驗兩組測量數據的平均值或系統誤差是否存在顯著性差異。若t檢驗證明兩種方法測得的均值不存在顯著性差異時，則新方法可以代替舊方法，t檢驗一般為雙側檢驗。t檢驗與F檢驗的具體方法參見分析化學的有關論著，此從略。第三節常用定量分析方法第五十二頁，共一百一十四頁，編輯于2023年，星期五第三節常用定量分析方法2、定量方法常用的定量方法有外標法、內標法、追加法（疊加法）及回歸曲線定量法。（1）外標法外標法是薄層色譜掃描最常用的定量方法，方法簡便，但點樣必須準確。①外標一點法工作曲線通過原點（截距為零）時可用外標一點法定量。只需點一種濃度的標準品溶液，與供試液同板展開，對比，測定組分含量，其計算公式為：C=F1·A式中：C為組分的重量或濃度，A為測得該組分的峰面積，F1為直線的斜率或比例常數。第五十三頁，共一百一十四頁，編輯于2023年，星期五②外標二點法工作曲線不通過原點時，只能用外標二點法定量，至少需點二種不同濃度的標準溶液（或一種濃度兩種點樣量），才能決定一直線,其計算公式為：C=F1A+F2式中：C、A同前，F1為直線的斜率或比例常數，F2為縱坐標的截距，F1和F2值由儀器自動算出。

外標一點法、二點法只是指用一種或二種濃度的標準溶液對比定量，為減小誤差，同一薄板上供試品點樣不得少于4個，對照品每一濃度不得少于2個；并調整標淮溶液的濃度或供試品與標準溶液的點樣量，使其峰面積相接近；且點樣量必須準確，宜用定量毛細管點樣。第三節常用定量分析方法第五十四頁，共一百一十四頁，編輯于2023年，星期五

外標一點法的直線方程：C=FAF為斜率

外標兩點法的直線方程：

、

F1為斜率F2為截距第五十五頁，共一百一十四頁，編輯于2023年，星期五第三節常用定量分析方法（2）內標法內標法是選一個純物質作為內標物，并準確稱取一定量內標物加至供試液及標準液中，計算供試品溶液中某組分含量的定量方法。

內標物的選擇要求是：純度合乎要求，展開后不得有雜質斑點，否則內標斑點的峰面積將不能代表內標物的量。內標物須為樣品中所不含有的成分。內標物不與其它斑點相重疊，分離度合乎要求。為簡化計算，內標物在標準溶液及供試品溶液中的濃度應相等。第五十六頁，共一百一十四頁，編輯于2023年，星期五特點：1）在一定點樣量范圍內，內標法定量準確度與點樣量無關。2）不易找到適宜Rf值的純品內標物，且溶液配制等操作較麻煩。方法：1）內標一點法：當工作曲線通過原點時采用內標一點法。內標一點法公式：2）工作曲線不通過原點時必須采用內標二點法內標二點法公式：

式中：C、Cis分別為組分及內標物的濃度或重量，A、Ais分別為測得組分及內標物的峰面積，F1為直線的斜率或比例常數，F2為截距，F1和F2由儀器自動計算并內存，可直接給出樣品的濃度或重量。第三節常用定量分析方法第五十七頁，共一百一十四頁，編輯于2023年，星期五（3）回歸曲線定量法將不同濃度（或不同量）的標準溶液與供試液點在同一塊薄層板上，展開、掃描;由計算機對所測得的峰面積及相應點樣量進行線性或非線性回歸;直接由回歸方程或回歸曲線計算供試液含量的方法;CAMAG系列薄層掃描儀即采用此方法。第三節常用定量分析方法第五十八頁，共一百一十四頁，編輯于2023年，星期五第三節常用定量分析方法（四）影響薄層色譜分析的主要因素1、樣品的預處理及供試液的制備2、薄層色譜的點樣技術3、吸附劑的活性與相對濕度的影響4、溶劑蒸氣在薄層色譜中的作用5、溫度的影響第五十九頁，共一百一十四頁，編輯于2023年，星期五相對濕度（%）所需硫酸濃度（V/V）硫酸（ml）水（ml）326810042571005839.510065341007227.51008810.889控制相對濕度用的硫酸溶液第三節常用定量分析方法第六十頁，共一百一十四頁，編輯于2023年，星期五第三節常用定量分析方法四、氣相色譜法

氣相色譜法是以氣體為流動相的柱色譜分離分析方法。

特點：分離效能高、選擇性好、靈敏度高，樣品用量少及分析速度快等特點，兼具分離、分析的功能，適用于熱穩定性好的易揮發性或可轉化為易揮發性組分的分析。

適用范圍：適用于熱穩定性好的易揮發性或可轉化為易揮發性組分的分析。第六十一頁，共一百一十四頁，編輯于2023年，星期五第三節常用定量分析方法（一）基本原理

氣相色譜是根據汽化后的試樣被載氣帶入色譜柱，由于各組分在兩相間作用不同，在色譜柱中移動有快慢，經一定柱長后得到分離，依次被載氣帶入檢測器，將各組分濃度或質量變化轉換成電信號變化記錄成色譜圖，利用色譜峰保留值進行定性分析，利用峰面積或峰高進行定量分析的方法。第六十二頁，共一百一十四頁，編輯于2023年，星期五1、塔板理論

將色譜柱的柱效用理論塔板數n或理論塔板高度H衡量，取決于區域寬度（σ、W1/2、W），其計算公式為第三節常用定量分析方法n=

=5.54

=16

H=L/n適中：tR為組分的保留時間，σ、W1/2、W分別為組分的標準差、半峰寬和基線寬度。第六十三頁，共一百一十四頁，編輯于2023年，星期五若以調整保留時間tR’代替tR，則得到反映色譜柱實際柱效的有效理論塔板數neff。neff=

=5.54

=16

Heff=L/neff可見，當tR一定時，峰越窄，則H越小，n越大，柱效越高，分離性能越好。第三節常用定量分析方法第六十四頁，共一百一十四頁，編輯于2023年，星期五2、速率理論速率理論研究了色譜過程中各種動力學因素對柱效（峰展寬）的影響，提出了VanDeemeter方程式：H=A+B/u+CuA、B/u、Cu分別為渦流擴散項、分子擴散（縱向擴散）項、傳質阻抗項，從而解釋了板高隨載氣流速而改變，且有最佳流速（Hmin）的現象。速率方程式對于色譜分離條件的選擇具有指導意義，它可以說明色譜柱的填充均勻程度、載體粒度、載氣種類、柱溫和固定液膜厚度對柱效、峰擴張的影響。對于開口毛細管柱色譜，渦流擴散項A=0，故VanDeemeter方程式可簡化為H=B/u+Cu，其傳質阻抗小，柱長又遠遠大于填充柱，所以毛細管柱的柱效要比填充柱高得多，其理論塔板數達105-106。第三節常用定量分析方法第六十五頁，共一百一十四頁，編輯于2023年，星期五3、分離度的計算分離度是衡量分離效果的指標，以相鄰兩色譜峰峰尖距對峰寬均值的倍數表示，其定義式為：兩峰基本分離，R≥1.5兩峰完全分離。分離度的影響因素很多，可用基本分離方程式概括如下：a、b、c分別為柱效項，柱選擇性項和柱容量項。R==R=

abc第三節常用定量分析方法第六十六頁，共一百一十四頁，編輯于2023年，星期五4、系統適用性試驗按藥典標準，中藥制劑分析時，需按各品種項下要求對儀器進行適用性試驗，既用規定的對照品對儀器進行試驗和調整，以達到規定的要求；或規定分析狀態下色譜柱的最小理論板數、分離度、重復性和拖尾因子。（1）色譜柱的理論板數n在選定的條件下，注入供試品溶液或各品種項下規定的內標物質溶液，記錄色譜圖，量出供試品主成分或內標物質峰的保留時間tR和半峰寬Wh/2，按計算色譜柱的理論板數。若測得理論板數低于各品種項下規定的最小理論板數，應改變色譜柱的某些條件（如柱長、載體性能、柱填充等），使理論板數達到要求。（2）分離度R定量分析時，為便于準確測量，要求定量峰與其它峰或內標峰之間有較好的分離度，一般R≥1.5。第三節常用定量分析方法第六十七頁，共一百一十四頁，編輯于2023年，星期五第三節常用定量分析方法（3）重復性取各品種項下的對照溶液，連續進樣5次，除另有規定外，其峰面積測量值的相對標準偏差應不大于2.0%，也可按各品種校正因子測定項下，配制相當于80%、100%和120%的對照品溶液，加入規定量的內標溶液，配成3種不同濃度的溶液，分別進樣3次，計算平均校正因子，其相對平均偏差也應不大于2.0%。（4）拖尾因子T為保證測量精度，特別當采用峰高法測量時，應檢查待測峰的拖尾因子T是否符合各品種項下的規定，或不同濃度進樣的校正因子誤差是否符合要求。拖尾因子計算公式為：T=式中，W0.05h為0.05峰高處的峰寬，d1為峰極大至峰前沿之間的距離，除另有規定外，T應在0.95-1.05之間。第六十八頁，共一百一十四頁，編輯于2023年，星期五第三節常用定量分析方法（二）實驗條件的選擇在氣相色譜分析中，為達到滿意的分離效果，需依據VanDeemeter方程式和分離度方程式選擇合適的分離條件，主要有固定相、柱溫、載氣流速等條件的選擇。1、固定相的選擇1）氣—液色譜①固定液：按極性相似、化學官能團相似的相似性原則和主要差別選擇。②載體：一般為適宜粒度，經酸洗并硅烷化處理的硅藻土。2）氣—固色譜：固定相大多采用高分子多孔微球（GDX），用于分離水及含羥基（醇）化合物。第六十九頁，共一百一十四頁，編輯于2023年，星期五第三節常用定量分析方法2、柱溫的選擇選擇的基本原則：在使最難分離的組分有符合要求的分離度的前提下，盡可能采用較低柱溫，但以保留時間適宜及不拖尾為度。在實際工作中一般根據樣品的沸點來選擇柱溫，具體有如下幾點：高沸點的樣品（沸點300-400℃），采用1-5%低固定液配比，柱溫200-250℃。沸點為200-300℃的樣品，采用5-10%固定液配比，柱溫150-180℃。沸點為100-200℃的樣品，采用10-15%固定液配比，柱溫選各組分的平均沸點2/3左右。氣體等低沸點樣品，采用15-25%高固定液配比，柱溫選沸點左右，在室溫或50℃下進行分析。對于寬沸程樣品，需采用程序升溫方法進行分析。但需注意的是柱溫要低于固定液的最高使用溫度。第七十頁，共一百一十四頁，編輯于2023年，星期五3、載氣的選擇主要從對峰展寬（柱效）、柱壓降和檢測器靈敏度的影響三方面考慮。N2是最常用的載氣；載氣流速較低時，宜用N2；流速高時，宜用H2、He；較長色譜柱，宜用H2作載氣；熱導檢測器應選用H2、He；氫焰檢測器、電子捕獲檢測器，一般用N2；一般控制載氣流速高于其最佳流速。常用的載氣流速為20-80ml/min。第三節常用定量分析方法第七十一頁，共一百一十四頁，編輯于2023年，星期五第三節常用定量分析方法4、其他條件的選擇氣化室（進樣口）溫度：氣化溫度取決于樣品的揮發性、沸點范圍、穩定性及進樣量等因素。檢測室溫度檢測器溫度一般需高于柱溫，以免色譜柱的流出物在檢測器中冷凝而污染檢測器。通常可高于柱溫30℃左右或等于氣化室溫度。進樣量在檢測器靈敏度足夠的前提下，盡量減少進樣量，通常以塔板數下降10%作為最大允許進樣量。對于填充柱，氣體樣品為0.1-1μl，液體樣品為0.1-1μl，最大不超過4μl為宜。毛細管柱需用分流器分流進樣，分流后的進樣量為填充柱的1/10-1/100。此外，進樣速度要快，進樣時間要短，注意留針時間和室溫的影響，以準確控制進樣量，以利于分離。第七十二頁，共一百一十四頁，編輯于2023年，星期五第三節常用定量分析方法5、檢測器熱導檢測器（TCD）：通用型檢測器，應用廣泛，但靈敏度較低；氫焰離子化檢測器（FID）：應用最廣泛，適用于含碳有機物的測定，載氣多為N2。氮-磷檢測器（NPD）：專屬性檢測器，可用于中藥及其制劑中農藥殘留量的檢測。電子捕獲檢測器（ECD）：專屬性檢測器，適用于痕量電負性有機物—如含鹵素、硫、氧、硝基、羰基、氰基等化合物的分析。第七十三頁，共一百一十四頁，編輯于2023年，星期五第三節常用定量分析方法（三）定量分析方法氣相色譜常用的定量方法有內標法、外標法、歸一化法等。1、內標法特點：為最常用的定量方法優點：可抵消儀器穩定性差、進樣量不夠準確等原因所帶來的定量分析誤差；缺點：樣品的配制較麻煩，有些內標物不易尋找。關鍵：選擇合適的內標物。適用范圍：①適用于樣品的所有組分不能全部流出色譜柱；②檢測器不能對每個組分都產生信號；③只需測定樣品中某幾個組分含量時的情況。第七十四頁，共一百一十四頁，編輯于2023年，星期五第三節常用定量分析方法原理：選擇一內標物，將一定量的內標物加入到樣品中，根據試樣重量W和內標物重量Ws及待測組分和內標物的峰而積Ai、As，求出待測組分的含量。待測組分百分含量為：Ci%=式中fi、fs分別為被測組分和內標的重量校正因子。在中藥制劑分析時，校正因子經常不知，可采用藥典方法測定校正因子再用內標法，或采用內標對比法測定。第七十五頁，共一百一十四頁，編輯于2023年，星期五第三節常用定量分析方法（3）內標工作曲線法內標工作曲線法與外標法相同，只是在各種濃度的標準溶液中加入相同量的內標物，進樣，以標準物與內標物的峰面積比Ai/AS對Ci作工作曲線（或求回歸方程）樣品測定時也加入等量的內標物，根據樣品與內標物峰面積比AX/AS由工作曲線求得待測組分含量。第七十六頁，共一百一十四頁，編輯于2023年，星期五第三節常用定量分析方法2、外標法關鍵：①進樣量準確；②實驗條件恒定。分類：1）工作曲線法：用一系列濃度的對照品溶液確定工作曲線，在完全相同條件下，準確進樣等體積的樣品溶液，計算其含量；2）外標一點法：當工作曲線截距為零時，可采用外標一點法定量，第七十七頁，共一百一十四頁，編輯于2023年，星期五3、歸一化法關鍵：要求所有組分均要產生色譜峰。適用范圍：通常只能用于粗略考察供試品的雜質含量，一般宜用于微量雜質的含量檢查.①校正面積歸一化法測定各組分的含量。②面積歸一化法計算：第七十八頁，共一百一十四頁，編輯于2023年，星期五第三節常用定量分析方法高效液相色譜法（HPLC）是以經典液相色譜法為基礎，引入氣相色譜的理論和實驗方法。高壓輸送流動相，采用高效固定相及在線檢測等手段發展而來的分離分析方法，具有分離效能高、分析速度快及應用范圍廣等特點。

適用范圍：適用于極性、非極性化合物，離子型化合物和高分子化合物的分離分析。第七十九頁，共一百一十四頁，編輯于2023年，星期五第三節常用定量分析方法（一）HPLC的基本原理

HPLC與GC的主要差別是流動相的性質不同。1、塔板理論用于計算理論塔板數及理論塔板高度，衡量色譜柱的柱效。在系統適用性試驗中，其理論板數不得低于各品種項下規定的最小理論板數。H=L/n第八十頁，共一百一十四頁，編輯于2023年，星期五第三節常用定量分析方法2、速率理論在HPLC中流動相為液體。粘度大柱溫低，擴散系數Dm很小，因此縱向擴散項B/u可忽略不計，其速率方程式為：H=A+CuC=Cm+Csm+Cs式中Cm、Csm、Cs分別是組分在流動相、靜態流動相和固定相中的傳質阻抗系數。對于化學鍵合相色譜，“固定液”是被鍵合在載體表面的單分子層，Cs≈0，則C=Cm+Csm。在HPLC中，當流動相的線速度大于1cm/s時，可近似認為流動相的流速與板高成直線關系，為兼顧柱效與分析速度，一般都采用較低流速。內徑2-4.6mm的色譜柱，多采用1ml/min。第八十一頁，共一百一十四頁，編輯于2023年，星期五第三節常用定量分析方法（二）HPLC實驗條件的選擇1、色譜柱的選擇根據被分離物質的化學結構、極性和溶解度等因素進行選擇。①大多數藥物可用C18反相（ODS）柱加以分離測定；②也可選用正相分配色譜柱（氨基柱、氰基柱）或硅膠吸附色譜柱等；③解離藥物可用離子對色譜、離子抑制色譜或離子交換色譜分離測定；④脂溶性藥物異構體的分離測定可采用硅膠吸附色譜柱。第八十二頁，共一百一十四頁，編輯于2023年，星期五第三節常用定量分析方法2、流動相的選擇1）反相鍵合相色譜流動相常用溶劑適用范圍部分含水溶劑甲醇-水、乙腈-水系統用于分離中等極性、弱極性藥物非水溶劑乙腈-二氯甲烷、甲醇-四氫呋喃等用于分離疏水性物質緩沖溶液三乙胺磷酸鹽、磷酸鹽、醋酸鹽溶液用于可溶于水并具可解離特性的化合物反相鍵合相色譜常用流動相第八十三頁，共一百一十四頁，編輯于2023年，星期五第三節常用定量分析方法2）正相鍵合相色譜

①常采用飽和烷烴（如正已烷）中加入一種極性較大的溶劑作為極性調節劑（如異丙醚），通過調節極性調節劑的濃度改變溶劑強度；

②常采用二元以上的混合溶劑系統。第八十四頁，共一百一十四頁，編輯于2023年，星期五第三節常用定量分析方法3、洗脫方式

等度洗脫是在同一分析周期內流動相的組成保持恒定，使所有組分的k值都處于這個范圍內，適用于組分數較少、性質差別不大的樣品。

梯度洗脫是在一個分析周期內程序控制流動相的組成（如溶劑極性、離子強度和pH值等），適用于分析組分數多、性質相差較大的復雜混合物樣品，從而使所有組分都在適宜條件下獲得分離。第八十五頁，共一百一十四頁，編輯于2023年，星期五4、檢測器

檢測器特點最低檢測限適用范圍紫外檢測器（UV或UVD）分為:①可變波長型②二極管陣列檢測器①用于檢測有外吸收的物質;②靈敏度較高,噪音低,線性范圍寬,對流速和溫度波動不靈敏,可用于梯度洗脫.10-7-10-12g用于芳烴、稠環芳烴、芳香氨基酸、核酸、甾體激素、羰基和羧基化合物等熒光檢測器(FD)①用于能產生熒光或其衍生物能發熒光的物質;②靈敏度高于紫外檢測器1×10-10g/ml主要用于氨基酸、多環芳烴、維生素、甾體化合化物及酶等蒸發光散射檢測器(ELSD)①屬通用型檢測器,理論上可用于揮發性低于流動相的任何樣品組分;②檢測靈敏度較低,適用于流動相能揮發的色譜洗脫,不能用含緩沖鹽的流動相用于檢測糖、高分子子化合物、高級脂肪酸、磷脂、維生素、氨基酸、甘油三酯及甾體等幾十類化合物第八十六頁，共一百一十四頁，編輯于2023年，星期五4、檢測器

電化學檢測器(ECD)用于能氧化、還原的有機物質的檢測1×10-12g/ml適用生物胺、酚、羰基化合物、巰基化合物等示差折光檢測器(RID)①屬通用型檢測器,利用組分與流動相折射率之差進行檢測.②穩定性好,操作方便.③靈敏度低,受環境溫度、流動相組成等波動的影響大,不適合梯度洗脫10-8g/ml尤其適合于糖類的檢測化學發光檢測器(CLD)①高選擇性、高靈敏度的新型檢測器.②設備簡單,自身發光,無需光源,價格便宜Pg級(10-12)用于分析微量脂質、核酸、生物胺等第八十七頁，共一百一十四頁，編輯于2023年，星期五5、HPLC前處理（1）流動相的處理

①溶劑的純化選擇專供色譜分析用的“色譜純”溶劑，分析純或優級純溶劑在很多情況下也可滿足色譜分析的要求。由于不同的色譜柱和檢測方法對溶劑的要求不同，有時需進行除去紫外雜質、脫水、重蒸等純化操作。水一般采用石英系統二次蒸餾水。第三節常用定量分析方法第八十八頁，共一百一十四頁，編輯于2023年，星期五②流動相脫氣HPLC所用的流動相必須預先除去其中的空氣，習稱脫氣，一般在臨用前對流動相進行脫氣，常用的脫氣法有超聲波振蕩脫氣、惰性氣體（He）鼓泡吹掃脫氣、抽真空加熱法。③過濾過濾是為了防止不溶物堵塞流路和色譜柱入口處的微孔墊片，因此應預先除去流動相中的任何固體微粒。流動相最好在玻璃容器內蒸餾，而常用的方法是過濾，采用0.45μm以下微孔濾膜過濾。濾膜分有機溶劑專用和水溶液專用兩種。第三節常用定量分析方法第八十九頁，共一百一十四頁，編輯于2023年，星期五第三節常用定量分析方法（2）樣品的處理HPLC分析前需對樣品進行預處理，以便將待測物質有效地從樣品基質中釋放出來，使樣品的形式及所用溶劑符合HPLC的要求。①待測組分的提取根據樣品成分及組分性質選擇合適的提取方法和提取條件。②溶劑的揮發對于液體樣品或經處理后得到的樣品溶液，若待測物的濃度在定量限以上，且溶劑對HPLC系統沒有干擾，可以直接進樣分析。但很多情況下需除去溶劑，濃縮甚至干燥樣品，除去溶劑的方法有：自然揮散或在氮氣流下吹干，適用于小體積樣品和揮發性溶劑；減壓蒸發，適用于熱不穩定樣品；冷凍干燥，適用于受熱易分解破壞的樣品。③濾過樣品溶液進樣前，需用濾膜抽濾或針頭濾器過濾，以有效除去樣品溶液中的懸浮物或部分大分子雜質。第九十頁，共一百一十四頁，編輯于2023年，星期五第三節常用定量分析方法其中液-液分配色譜是中藥制劑分析中應用最廣泛的方法，根據固定相與流動相的極性差別，分為正相色譜和反相色譜兩類。正相色譜:流動相極性小于固定相極性的分配色譜法，主要用于極性物質的分離測定；反相色譜:流動相極性大于固定相極性的分配色譜法，主要用于非極性、中等極性物質的分離測定第九十一頁，共一百一十四頁，編輯于2023年，星期五第三節常用定量分析方法化學鍵合相是將固定液的官能團鍵合在載體上所形成的固定相。具有化學性能穩定，熱穩定性好，一般在pH2-8范圍的溶液中不變質，使用過程不流失，載樣量大，適于梯度洗脫等特點，已廣泛用于正相與反相色譜，離子抑制色譜，離子對色譜。藥典中HPLC法所采用的固定相均為化學鍵合相。以化學鍵合相為固定相的色譜法稱為化學鍵合相色譜法.現就中藥制劑分析中最常用的鍵合相色譜法作一介紹。第九十二頁，共一百一十四頁，編輯于2023年，星期五第三節常用定量分析方法（1）反相鍵合相色譜法反相鍵合相色譜法是現代液相色譜中應用最為廣泛的方法，占整個HPLC應用的80%左右。反相色譜法一般采用非極性鍵合相，十八烷基鍵合相（簡稱ODS或C18）是最常用的非極性固定相，對于各種類型的化合物都有較強的適應能力；流動相通常以水為基礎溶劑，再加入一定量能與水互溶的極性調整劑，常用的有甲醇-水、乙腈-水系統。極性調整劑的性質及其與水的混合比例對溶質的保留值和分離選擇性有顯著影響，流動相的極性增大，洗脫能力降低，溶質的k增大，tR增大；反之，k與tR減小。調整流動相的極性，可控制k值在所要求的范圍內（k=1-10），對于結構類似的組分，極性大的組分先出柱。第九十三頁，共一百一十四頁，編輯于2023年，星期五第三節常用定量分析方法（2）正相鍵合相色譜法正相鍵合相色譜法的應用不如反相色譜法普及，主要用于分離分析溶于有機溶劑的極性及中等極性的分子型物質。氰基（-CN）、氨基（-NH2）和二醇基（DIOL）鍵合相是正相色譜常用的極性鍵合相，流動相通常用烷烴（常用正已烷）加適量極性調整劑構成。

第九十四頁，共一百一十四頁，編輯于2023年，星期五第三節常用定量分析方法（3）離子對色譜法

直接將離子對試劑加入到流動相中，用以分離離子型或可離子化化合物的方法作為離子對色譜法（PIC或IPC），該法可分為正相離子對色譜法和反相離子對色譜法，但近年來廣泛應用的幾乎都是反相離子對色譜法，故本書只介紹反相離子對色譜法.①基本原理:以C18或C8鍵合相為固定相，用含離子對試劑的有機溶媒-水溶液為流動相，用以分離離子型或可離子化化合物.②適用范圍:適用于有機酸、堿、鹽的分離;用離子交換色譜法無法分離的離子和非離子混合物的分離;在中藥制劑分析廣泛用于生物堿、有機酸的分析。

③缺點:離子對試劑價格比較貴.④分離條件的選擇:離子對試劑的性質和濃度、流動相的pH值及流動相中所含有機溶劑的種類與比例等。第九十五頁，共一百一十四頁，編輯于2023年，星期五第三節常用定量分析方法i離子對試劑的選擇通常所選用離子對試劑的電荷應與試樣離子的電荷相反。離子對試劑主要應用對象1、季銨類（如四甲基、四丁基、十六烷基三甲基銨）強酸和弱酸（如磺酸染料、羧酸、磺胺類藥物、水溶性維生素）2、叔胺類（如三辛基胺）磺酸鹽等3、烷基磺酸鹽（如戊烷、已烷、庚烷、辛烷、十二烷基磺酸鹽）強堿和弱堿（如兒茶酚胺、罌粟堿、煙酰胺）4、高氯酸各種堿性物質（如有機胺、肽）5、烷基硫酸鹽（如辛烷、十二烷基硫酸鹽）應用對象同烷基磺酸鹽第九十六頁，共一百一十四頁，編輯于2023年，星期五第三節常用定量分析方法反相離子對色譜法中流動相pH值的選擇原則樣品類型流動相PH值說明1、強酸（pKa<2）如磺酸染料2-7.4在整個pH范圍內，樣品可離解，實際pH值的選擇取決于共存的其它組分類型。2、弱酸（pKa>2）如氨基酸、羧酸6-7.42-5樣品可離解，其k值取決于離子對的性質樣品的離解被抑制，其k值取決于未離解樣品的性質。3、強堿（pKa>8）如季銨類2-8同強酸4、弱堿（pKa<8）如兒茶酚胺6-7.42-5樣品的離解被抑制，其k值取決于未離解樣品的性質樣品可離解，其k值取決于離子對的性質。ii.流動相pH值的控制

第九十七頁，共一百一十四頁，編輯于2023年，星期五第三節常用定量分析方法iii.有機溶劑的選擇反相離子對色譜法中，甲醇-水、乙腈-水系統是最常用的流動相，流動相中所含有機溶劑的比例越高，組分的k值越小。一般而言，樣品組分的疏水性及離子對試劑的疏水性越強，所需有機溶劑的比例越高。第九十八頁，共一百一十四頁，編輯于2023年，星期五第三節常用定量分析方法（4）離子抑制色譜法原理:由于離子對試劑的價格較貴，對弱酸、弱堿的分離，往往采用離子抑制色譜法。通過向流動相加入少量弱酸（常用醋酸）、弱堿（常用氨水）或緩沖鹽（常用磷酸鹽及醋酸鹽），調節流動相的pH值，抑制樣品組分的解離，增加組分在固定相中的溶解度，改善峰形，達到分離有機弱酸、弱堿的目的，這種技術稱為離子抑制色譜法（ISC）。特點:該方法簡便、經濟實用、分離效果好，在許多場合可替代離子對色譜法，但重復性較差是其缺點。適用范圍:離子抑制色譜法通常用于反相色譜中，適用于3.0≤pKa≤7.0的弱酸、7.0≤pKa≤8.0的弱堿和兩性化合物的分離，以及它們與分子型化合物共存時的分離。第九十九頁，共一百一十四頁，編輯于2023年，星期五第三節常用定量分析方法離子抑制色譜法與離子對色譜法的區別：

①離子抑制色譜法是向流動相中加入抑制劑，調節pH值，抑制樣品組分的解離，使其以分子形式存在。而離子對色譜法是加入離子對試劑，并調節pH值使樣品組分盡可能呈解離狀態，使離子對試劑的反離子與樣品離子結合成中性離子對。②離子抑制色譜僅適用于弱堿、弱堿的分離，不適用于有機強酸、強堿的分離；而離子對色譜法對不同強度的酸、堿均適用。第一百頁，共一百一十四頁，編輯于2023年，星期五第三節常用定量分析方法（四）定量分析方法HPLC常用的定量方法有:外標法、內標法（內標對比法和內標標準曲線法）內加法。第一百零一頁，共一百一十四頁，編輯于2023年，星期五第三節常用定量分析方法六、原子吸收分光光度法

原子吸收分光光度法是基于從光源輻射出具有待測元素特征譜線的光，通過試樣蒸氣時被待測元素的基態原子所吸收，由輻射譜線被減弱的程度（即原子的吸光度）來測定試樣中該元素的含量。該法能測定幾乎全部金屬元素和一些半金屬元素，已廣泛應用于中藥制劑及中藥材中重金屬、毒害元素及微量元素的檢測。優點:靈敏度高、選擇性和重現性好、干擾較少、操作簡便快速、測定范圍廣等優點；

缺點:是標準工作曲線的線性范圍窄、測定不同元素一般需用不同光源燈且實驗條件要求嚴格。第一百零二頁，共一百一十四頁，編輯于2023年，星期五第三節常用定量分析方法(一)基本原理一個原子可具有多種能級狀態，在正常情況下原子是以其最低能態即基態形式存在的，當吸收適當頻率的輻射原子由基態躍遷到激發態，其中原子由基態躍遷到第一激發態時所產生的吸收線稱為共振線。由于各種元素原子的結構和外層電子排布不同，不同元素的原子從基態激發到第一激發態時吸收的能量不同，各種元素的共振線各有其特征性，稱為元素的特征譜線。對大多數元素來說，共振線是該元素所有譜線中最靈敏的譜線，通常選擇待測元素的共振線作為原子吸收定量的分析線。第一百零三頁，共一百一十四頁，編輯于2023年，星期五第三節常用定量分析方法（三）樣品的處理原子吸收光譜分析通常是溶液進樣，被測樣品需事先轉化為溶液樣品，預處理方法與通常的化學分析相同，要求試樣分解完全，在分解過程中應防止沾污和避免待測組分的損失，所用試劑及反應產物對后續測定應無干擾。分解試樣最常用的方法是用酸溶解和堿熔融，近年來微波溶樣法獲得了廣泛的應用。通常采用稀酸、濃酸或混合酸處理，酸不溶物質采用熔融法。無機試樣如礦物類藥物大都采用此類方法。有機試樣通常先進行消化處理，以除去有機物基體，消化后的殘留物再用合適的酸溶解。消化處理主要分干法消化和濕法消化兩種，被測元素若是易揮發的元素（如Hg、As、Cd、Pb、Sb、Se等），則不能采用干法消化，因為這些元素在消化過程中損失嚴重。第一百零四頁，共一百一十四頁，編輯于2023年，星期五第三節常用定量分析方法干法消化:在較高的溫度下，用氧來氧化樣品。準確稱取一定量的樣品，置于石英坩鍋或鉑坩鍋中，于80~150℃低溫加熱趕去大量有機物；然后放于高溫爐中，加熱至450~550℃進行灰化處理。冷卻后，再將灰分用HNO3、HCl或其它溶劑進行溶解。如有必要，可加