實驗大腸桿菌的培養和分離emma詳解演示文稿本文檔共22頁；當前第1頁；編輯于星期日\13點6分優選實驗大腸桿菌的培養和分離emma本文檔共22頁；當前第2頁；編輯于星期日\13點6分大腸桿菌（E.coli）分布：人和哺乳動物腸道，此外還廣泛分布于水、污水、土壤、谷類、乳制品等當中。大腸桿菌在人體的_____中一般對人體無害，但任何大腸桿菌如果進入__________都會對人體產生危害。大腸桿菌是_______工程中被廣泛采用的工具。腸道泌尿系統基因革蘭氏______（填陰或陽）性菌陰代謝類型：異養，兼性厭氧型生長適宜溫度：質粒、EcoRⅠ限制酶、E.coli-DNA連接酶、受體細胞37℃左右本文檔共22頁；當前第3頁；編輯于星期日\13點6分實驗一大腸桿菌的培養和分離1.進行大腸桿菌的擴增，利用液體培養基進行細菌培養的操作2.進行大腸桿菌的分離,用固體平板培養基進行細菌的劃線培養3.說明大腸桿菌培養的條件和操作要求的原理實驗目的LB液體（固體）培養基本文檔共22頁；當前第4頁；編輯于星期日\13點6分一、配制培養基培養基：是由人工方法配制而成的，專供微生物生長繁殖使用的混合營養液。水、碳源、氮源、無機鹽、生長因子(生長因子即細菌生長必需，而自身不能合成的化合物,如維生素、某些氨基酸、嘌呤、嘧啶)1、成分區別于動物培養與植物培養：不加激素固體培養基與液體培養基的區別：瓊脂成分作用主要來源碳源主要作能源物質無機碳(CO2)或有機碳(糖類)氮源合成含N類化合物N2，NH3，銨，硝酸鹽尿素，牛肉膏，蛋白胨無機鹽調節滲透壓等水生長因子調節促生長維生素，AA，堿基等如NaCl本文檔共22頁；當前第5頁；編輯于星期日\13點6分一、配制培養基不同的微生物往往需要采用不同的培養基配方實例：“細菌喜葷，霉菌喜素”

細菌培養基要用蛋白胨和酵母提取物來配制，還要加入一定的氯化鈉，以維持一定的滲透壓；霉菌培養基一般用無機物配制或添加蔗糖的豆芽汁調節pH真菌：5～6細菌：6.5～7.5溶解計算稱量調pH分裝加塞，包扎滅菌2、過程勿沾到瓶口或者壁上，易污染，則作廢本文檔共22頁；當前第6頁；編輯于星期日\13點6分二、包器材封口膜通空氣不通細菌牛皮紙或報紙加蓋后幾個包在一起接種環包牛皮紙P20①分裝：注意不要使培養基沾在管口或瓶口上，因此在將培養基轉移到三角瓶或試管中時必須用__________。②加塞：試管用塑料蓋或________；三角瓶口用_______或_________封口,再用_________或報紙封口。③包扎：用________或報紙三角漏斗棉花塞封口膜6層紗布牛皮紙牛皮紙250ml裝50ml本文檔共22頁；當前第7頁；編輯于星期日\13點6分三、滅菌定義：以化學劑或物理方法消滅所有微生物（包括芽孢(休眠體)和孢子（真菌、放線菌生殖細胞））方法1：高壓蒸汽滅菌：100kPa、121℃下維持15min（培養基、無菌水、玻璃器皿等滅菌。P20），滅菌前排出鍋內冷空氣，因為空氣膨脹壓大于水蒸氣膨脹壓，達不到水蒸氣的溫度。滅菌鍋壓力與大氣壓相同時打開鍋蓋滅菌后，通常將實驗用具放進60～80℃的烘箱中烘干，除去滅菌時的水分，防止污染(P20)方法2：干熱滅菌：160-170℃下加熱1-2h。玻璃器皿等耐熱器具惡劣環境下本文檔共22頁；當前第8頁；編輯于星期日\13點6分四、超凈臺操作

無菌操作泛指在培養微生物的操作中，所有防止________污染（培養基和操作者）的方法。雜菌1、紫外消毒（針對空氣）：實驗用具放在超凈臺上，打開超凈臺的紫外燈和過濾風（人離開）30min左右，培養基冷卻至60℃，關閉紫外。2、酒精消毒：用鑷子取出酒精棉擦拭超凈臺桌面，并擦拭雙手。3、開始實驗_________必須無菌（滅菌）_________也必須要無菌（滅菌）_________時不帶入雜菌（滅菌、消毒各種器具培養基轉移菌種滅菌與消毒的區別本文檔共22頁；當前第9頁；編輯于星期日\13點6分滅菌與消毒的區別消毒：使用較溫和理化因素，僅殺死物體表面或內部的一部分對人體有害的微生物的過程。不能殺死芽孢和孢子。（對被消毒物體基本無害）滅菌：使用強烈的理化因素消滅物體內外所有微生物，包括芽孢和孢子。（細菌蛋白質變性達到滅菌目的）例題：請你判斷以下材料或用具是否需要消毒或滅菌。如果需要，請選擇合適的方法。（1）培養細菌用的培養基與培養皿（2）玻棒、試管、燒瓶和吸管（3）實驗操作者的雙手答：（1）、（2）需要滅菌；（3）需要消毒。無菌操作消毒滅菌①高壓蒸汽滅菌②干熱滅菌③灼燒滅菌①紫外線消毒法（使蛋白質變性，還能損傷②化學藥劑消毒法（酒精）③煮沸消毒法400~500℃70%DNA結構④巴氏消毒法本文檔共22頁；當前第10頁；編輯于星期日\13點6分四、超凈臺操作倒平板制斜面：冰箱4℃保存單菌落在酒精燈火焰旁，以右手無名指及小指夾持封口膜，右手其他三個手指拿著三角瓶；左手拿著培養皿，并打開上蓋的一邊，將三角瓶中培養基（10~20ml）倒在培養皿里，將其放于水平位置，輕輕晃動，使培養基鋪滿底部，凝固形成平面。倒置放置既可以使培養基表面的水分更好地揮發，又可以防止皿蓋上的水珠落入培養基，造成污染.試管斜面培養基密閉效果比平面的好很多,不容易進入雜菌，同時能用來做純細菌的長期保存。本文檔共22頁；當前第11頁；編輯于星期日\13點6分思考題：A、操作過程中避免帶入雜菌的方法有哪些？1、滅菌后的培養基、器具置于超凈臺上，并打開超凈臺的紫外燈和過濾風，滅菌30分鐘。2、用鑷子夾出灑精棉球擦拭桌面和實驗者雙手。3、整個操作在酒精燈火焰旁進行4、打開后或加塞前試管口、三角瓶口灼燒滅菌。B、培養基滅菌后，需要冷卻到60后才倒平板，你用什么辦法來估計培養基的溫度呢？可以用手觸摸盛有培養基的錐形瓶，感覺錐形瓶的溫度下降到剛剛不燙手時，就可以進行倒平板了。本文檔共22頁；當前第12頁；編輯于星期日\13點6分思考題C、在倒平板的過程中，如果不小心將培養基濺在皿蓋與皿底之間的部位，這個平板還能用來培養微生物嗎？為什么？空氣中的微生物可能在皿蓋與皿底之間的培養基上滋生，因此最好不要用這個平板培養微生物。D、如何檢查培養基是否受雜菌的污染？將未接種的培養基放在恒溫箱中培養，若無菌落產生則未受雜菌污染。本文檔共22頁；當前第13頁；編輯于星期日\13點6分四、超凈臺操作接種擴大培養從大腸桿菌斜面→錐形瓶中的液體培養基接種好后在37度搖床振蕩培養12h注意事項:1.火焰旁從斜面上用接種環取菌;2.取菌前接種環要用酒精燈灼燒滅菌,冷卻后方能取菌;3.取菌后封口膜和棉塞復原.本文檔共22頁；當前第14頁；編輯于星期日\13點6分四、超凈臺操作劃線分離法原理：通過接種環在瓊脂固體培養基表面連續劃線的操作，將聚集的菌種逐步稀釋分散到培養基的表面。由于劃線過程中接種環上的菌液逐漸減少，因此最后部分的細菌間距加大。獲得單菌落首尾注意事項:1.接種環灼燒滅菌后要冷卻，避免溫度高殺死菌種1.接種環只蘸一次菌液,但要在培養基不同位置連續劃線多次,不能劃破培養基.2.劃線首尾不能相接3.劃線后,培養皿倒置培養37℃，12~24h本文檔共22頁；當前第15頁；編輯于星期日\13點6分第一區域第二區域第三區域第四區域第五區域注意1:不能出現線條的重疊注意2:第二次或隨后幾次的操作總是從上一次劃線的末端開始注意3:最后一個區域不能與第一個區域相連本文檔共22頁；當前第16頁；編輯于星期日\13點6分

平板劃線接種灼燒接種環冷卻劃線（第一區域）蘸取菌液灼燒接種環冷卻劃線（第二區域）灼燒接種環冷卻劃線（第三區域）灼燒接種環冷卻劃線（第四區域）灼燒接種環冷卻劃線（第五區域）灼燒接種環平板倒置放置培養本文檔共22頁；當前第17頁；編輯于星期日\13點6分第一次灼燒每次劃線之前灼燒劃線結束灼燒目的避免接種環上可能存在的微生物污染培養物殺死上次劃線結束后接種環上的殘留菌種殺死接種環上殘留的菌種，避免細菌污染環境或感染操作者在作第二次以及其后的劃線操作時，為什么總是從上一次劃線的末端開始劃線？劃線后，線條末端細菌的數目比線條起始處要少，每次從上一次劃線的末端開始，能使細菌的數目隨著劃線次數的增加而逐步減少，最終能得到由單個細菌繁殖而來的菌落。單菌落分離的標志？劃線的末端出現不連續的單個菌落為什么要倒置培養？既可以使培養基表面的水分更好地揮發，又可以防止皿蓋上的水珠落入培養基，造成細菌隨水擴散污染，難以分成單菌落，達不到分離的目的本文檔共22頁；當前第18頁；編輯于星期日\13點6分1、系列稀釋操作四、超凈臺操作涂布分離法2、涂布平板操作玻璃刮刀本文檔共22頁；當前第19頁；編輯于星期日\13點6分細菌的分離方法劃線分離法和涂布分離法。

種類:作用:單菌落的分離是消除污染雜菌的通用方法，也是用于篩選高表達量菌株的最簡便方法之一。

劃線分離法，簡單方便；涂布分離法，單菌落更易分開，但操作復雜些本文檔共22頁；當前第20頁；編輯于星期日\13點6分單菌落培養試管斜面培養基密閉效果比平面的好很多,不容易進入雜菌，同時能用來做純細菌的長期保存。在無菌操作下將單菌落用接種環取出，再用劃線法接種在斜面上，37℃培養24h后，置于4℃冰箱中保存本文檔共22頁；當前第21頁；編輯于星期日\13點6分分析與討論:1、如何操作才可以盡量避免被雜菌污染？（