實驗八微生物的接種技術及分離純化第一頁，共二十一頁，編輯于2023年，星期二

1．掌握倒平板的方法和幾種分離純化微生物的基本操作技術。

2．學習平板菌落計數的基本原理和方法

一、目的要求第二頁，共二十一頁，編輯于2023年，星期二實驗原理1.從混雜的微生物群體中獲得只含有某一種或某一株微生物的過程稱為微生物的分離與純化。本實驗采用平板分離法：

1)選擇合適的選擇培養基。

2)通過稀釋倒平板和平板劃線等技術得到單個菌落。

2.平板菌落計數法是將待測樣品經適當稀釋之后，取一定量的稀釋液接種在平板上，經過培養，平板上出現單個菌落，即為一個菌落形成單位（colony-formingunits,cfu）。第三頁，共二十一頁，編輯于2023年，星期二第四頁，共二十一頁，編輯于2023年，星期二吸取稀釋液

取一吸管，以無菌操作法分別吸取10－5、10－6、

10－7土壤稀釋液0.1mL，加在已制好的平板培養基上。涂板

用玻璃刮刀將稀釋液在培養基上充分混勻鋪平，倒置于恒溫箱培養。計算出每克土壤中細菌的數量。

即用某一培養皿內的菌落數乘以該培養皿接種液的稀釋倍數即得。挑取單個菌落，進行劃線分離。微生物的分離—平板涂布法第五頁，共二十一頁，編輯于2023年，星期二第六頁，共二十一頁，編輯于2023年，星期二微生物的分離—平板傾注法吸取稀釋液

取一吸管，以無菌操作法分別吸取10－4、10－5、

10－6土壤稀釋液0.5-1mL，加在空培養皿中。混和搖勻

水平輕輕轉動培養皿，使菌液、培養基充分混勻鋪平，放在平坦的桌面上，凝固后倒置于恒溫培養箱培養。計算出每克土壤中放線菌的數量。挑取單個菌落，進行劃線分離。第七頁，共二十一頁，編輯于2023年，星期二微生物的分離—平板劃線法制成平板。凝固后，用接種環取相應的菌液一環（10－1）在平板上劃線。

1.連續劃線法：將挑取有樣品的接種環在平板培養基表面作連續劃線。完畢后，倒置于28～300C溫室培養。

2.分區劃線法：用接種環以無菌操作挑取土壤稀釋液1環，先在培養基的一邊作第一次平行劃線3—4條，再轉動培養皿約60度角，并將接種環上剩余物燒掉，待冷卻后通過第一次劃線部分作第二次劃線會，同法依次作第三次和第四次劃線。劃線完畢，蓋上皿蓋，倒置于溫室培養。挑取單個菌落接種于斜面培養基上，如果不純，再移植純化，最后得到純培養。第八頁，共二十一頁，編輯于2023年，星期二第九頁，共二十一頁，編輯于2023年，星期二第十頁，共二十一頁，編輯于2023年，星期二實驗材料樣品：新鮮土壤。培養基：滅菌的淀粉瓊脂培養基、牛肉膏蛋白胨培養基。無菌水：帶有玻璃珠裝有99mL無菌水三角瓶、裝有4.5mL無菌水的試管。其它：無菌培養皿、無菌吸管、無菌三角玻棒、電子天平、記號筆、接種環、酒精燈、火柴。第十一頁，共二十一頁，編輯于2023年，星期二實驗步驟1．制備土壤稀釋液稱取土樣1g，放入盛有99ml無菌水并帶有玻璃珠的三角燒瓶中，振搖混勻。2．10倍梯度稀釋用無菌吸管吸取上述土壤稀釋液0.5ml加入盛有4.5ml無菌水的試管中充分混勻，然后再用無菌吸管從此試管中吸取0.5ml加入盛有4.5ml無菌水的另一支試管中充分混勻，以次類推制成10-3、10-4、10-5、10-6不同稀釋度的溶液。一、土壤中細菌的分離、純化及菌落計數（6皿/組）第十二頁，共二十一頁，編輯于2023年，星期二第十三頁，共二十一頁，編輯于2023年，星期二3．涂布選擇3個連續梯度（10-4、10-5、10-6），每個稀釋度涂布2個平板，涂布時用無菌吸管每個平板滴加0.1mL，用無菌玻棒涂布均勻。4．培養37℃倒置培養過夜。5．計數并檢驗產胞外淀粉酶的菌株

總菌落計數完后，將平板內滴加1-2ml盧戈氏碘液，菌落周圍產生透明圈的菌落就是產胞外淀粉酶的菌株，觀察并計數第十四頁，共二十一頁，編輯于2023年，星期二二、劃線分離

平板的制作（牛肉膏蛋白胨培養基）將15ml培養基無菌條件下倒平板，待其凝固后備用（4皿/組）劃線分離：取枯草桿菌和金黃色葡萄球菌混合菌懸液一環，采用連續劃線或分區劃線的方法分離單菌落第十五頁，共二十一頁，編輯于2023年，星期二（1）計算相同稀釋度的平均菌落數

有較大片菌苔生長時，棄用；以無片菌苔生長的平皿計數。

若片菌苔大小不到培養皿的一半，其余一半分布均勻，將此一半計數×2

（2）選擇平均菌落數在30～300之間的平板

只有一個符合此范圍時，以該平均菌落數乘稀釋倍數。

有兩個在30～300間時，按兩者菌落總數比值決定：比值小于2，取平均；比值大于2，取較小的菌落總數。

（3）所有菌落數均大于300，取稀釋度最高的平均菌落數乘稀釋倍數。

（4）所有菌落數均小于30，取稀釋度最低的平均菌落數乘稀釋倍數。

（5）所有菌落數均不在30～300之間，以最接近30或300的平均菌落數乘稀釋倍數。菌落計數方法p207第十六頁，共二十一頁，編輯于2023年，星期二第十七頁，共二十一頁，編輯于2023年，星期二實驗報告

計算土壤樣品的細菌總數和產胞外淀粉酶的菌落數觀察混合菌懸液的劃線分離情況，并描述兩種菌的菌落形態特征第十八頁，共二十一頁，編輯于2023年，星期二思考題1、如何確定平板上某單個菌落是否為純培養物？請寫出實驗的主要步驟。P74(1)2、如果一項科學研究內容需從自然界中篩選到能產高溫蛋白酶的菌株，你將如何完成？請寫出簡明實驗方案。P74(4)

第十九頁，共二十一頁，編輯于2023年，星期二上次實驗習題解答1、為什么更換不同放大倍數的目鏡或物鏡時，必須用鏡臺測微尺重新對目鏡測微尺進行效正？P48(1)

進行顯微測量時，主要是利用效正后的目鏡測微尺對物象進行測量。而物鏡或目鏡的實際放大倍數與標注的可能有誤差，因此，更換不同放大倍數的目鏡或物鏡時，必須用鏡臺測微尺重新對目鏡測微尺進行效正。

第二十頁，共二十一頁，編輯于2023年，星期二2、某單位要求知道一種干酵母粉中的活菌存活率，請設計1-2中可行的檢測方法。①首先將干酵母