第七章外源基因在真核細胞中的表達與調控第一頁，共一百五十八頁，編輯于2023年，星期一基因工程的基本程序

載體外源DNA片段外源DNA插入剪切引入宿主細胞選出含有重組DNA的細胞abbAAb重組DNA的擴增或表達第二頁，共一百五十八頁，編輯于2023年，星期一基因重組的主要目的是要使目的基因在某一細胞中能得到高效表達，即產生人們所需要的高產目的基因產物，如蛋白質、多肽類生物藥物。基因工程技術的核心是基因表達技術。基因表達是指結構基因在調控序列的作用下轉錄成mRNA，經加工后在核糖體的協助下又轉譯出相應的基因產物——蛋白質，再在受體細胞環境中經修飾而顯示出相應的功能。從基因到有功能的產物這整個轉錄、轉譯及所有的加工過程就是基因表達的過程，它是在一系列酶和調控序列的共同作用下完成的。第三頁，共一百五十八頁，編輯于2023年，星期一

一、概述（一）幾個重要的概念1、表達系統（geneexpressionsystem)：

基因工程中用來獲得有功能的異源蛋白質的體系，包括表達載體的構建、受體細胞的建立及表達產物的分離、純化。第四頁，共一百五十八頁，編輯于2023年，星期一第五頁，共一百五十八頁，編輯于2023年，星期一2、據受體細胞的不同可分為：1）原核表達系統：

將外源基因引入原核細胞，并使其在原核細胞中以發酵形式快速高效地表達、合成基因產物的體系。2）真核表達系統：

使外源基因在真核細胞中表達的體系。第六頁，共一百五十八頁，編輯于2023年，星期一（二）原核表達系統的局限性

1.缺乏翻譯后加工修飾系統，不能進行糖基化、甲基化的修飾，影響某些蛋白的活性。2.在原核細胞中表達的真核蛋白不穩定，易被細菌蛋白酶降解。3.很難實現真正的分泌出胞，其產量很低，而且容易出現信號肽不被切割，或不在特異位置上切割。4.表達產物常以包涵體（防止蛋白酶的水解）的形式存在，后期需要經過變性（鹽酸胍或尿素）復性（二硫蘇糖醇、巰基乙醇等還原劑），并且復性效率低。5.內毒素的污染第七頁，共一百五十八頁，編輯于2023年，星期一真核基因組結構復雜龐大:形成復雜的染色質或者染色體基因不連續性:內含子、外顯子3.含有大量的重復序列：低度、中度或高度4.存在許多基因家族（有一定同源性而又不完全相同的基因簇）：如珠蛋白基因家族、ras基因家族等。5.沒有原核細胞的操縱子，不產生多順反子mRNA:即一個編碼基因轉錄生成一個mRNA分子，經翻譯生成一條多肽鏈(單順反子mRNA）。6.基因表達調控復雜（三）真核基因組結構特點第八頁，共一百五十八頁，編輯于2023年，星期一(a)原核生物mRNA為多順反子(b)真核生物mRNA為單順反子第九頁，共一百五十八頁，編輯于2023年，星期一第十頁，共一百五十八頁，編輯于2023年，星期一（四）真核基因表達調控特點

——多方面、多層次1.轉錄前（基因組水平）調控：基因結構改變，持久且不可逆2.轉錄水平調控：3.轉錄后修飾：4.翻譯水平的調控：5.翻譯后修飾：第十一頁，共一百五十八頁，編輯于2023年，星期一第十二頁，共一百五十八頁，編輯于2023年，星期一轉錄前調控1.基因丟失：目前認為這種調節方式主要是在較低等的真核生物中。2.基因擴增：是指某些基因的拷貝數專一性大量增加的現象。3.基因重排：是指某些基因片段改變原來存在的順序而重新排列組合。4.甲基化修飾：

DNA甲基化是一種重要的基因組表觀遺傳修飾，參與調控許多細胞過程，包括胚胎發育、轉錄、染色質結構、X染色體失活、基因組印跡以及染色體穩定性。5.染色質結構對基因表達的調控：細胞分裂時松開分散在核內的染色質稱為常染色質，常染色質的基因可以轉錄。染色體中的某些區段到分裂期后，仍保持緊湊折疊的結構，在間期核中可以看到其濃集的斑塊，稱為異染色質，基因不能轉錄表達。第十三頁，共一百五十八頁，編輯于2023年，星期一轉錄水平調控1.RNA聚合酶:I,II,III2.順式調控因子（cis-actingfactor)3.反式作用因子（trans-actingfactor)第十四頁，共一百五十八頁，編輯于2023年，星期一酶主要轉錄產物RNA聚合酶ⅠrRNA，大多數snRNARNA聚合酶ⅡmRNA前體，部分snRNARNA聚合酶ⅢtRNA、部分snRNA

真核細胞中RNA聚合酶的種類第十五頁，共一百五十八頁，編輯于2023年，星期一順式調控因子順式調控因子（cis-actingfactor)：是與結構基因串連的、對基因轉錄的精確起始和轉錄活性具重要調控作用的特定DNA序列。包括正性調控元件（啟動子、增強子）和負性調控元件（沉寂子、加尾和轉錄終止信號）第十六頁，共一百五十八頁，編輯于2023年，星期一啟動子啟動子（Promoter）:位于基因的5'端與基因轉錄起始有關的核苷酸序列。一般包括轉錄起始點及其上游100-200bp序列作用特點：近距離作用、具有方向性、空間位置較恒定分類：核心啟動子元件（轉錄起始點上游-30bp區的TATA-box）：決定基因轉錄精確起始。上游啟動子元件(包括：-70至-80bp區域的CAAT盒及其兩側的GC盒):協同決定轉錄基礎效率。組織特異性元件:如肝細胞特異性啟動子元件HP1，與白蛋白、AFP等基因在肝細胞中的特異性表達有關。誘導性啟動子元件：如cAMP反應元件（CRE），介導對cAMP、生長因子等信號的反應。第十七頁，共一百五十八頁，編輯于2023年，星期一

啟動子結構模式圖

SP1NF1

SP1TBP第十八頁，共一百五十八頁，編輯于2023年，星期一第十九頁，共一百五十八頁，編輯于2023年，星期一表－1哺乳類RNA聚合酶Ⅱ啟動子中

常見的元件元件名稱

共同序列

結合的蛋白因子

名稱分子量DNA長度TATATATAAATFIID30,000～10bpGCGGGCGGSP-1105,000～20bpCAATGGCCAATCTCTF/NF160,000～22bpkBGGGACTTTCCNFkB44,000～10bpATFGTGACGTATF?~20bpOctaneATTTGCATOct-176,000～10bp第二十頁，共一百五十八頁，編輯于2023年，星期一增強子增強子(Enhancer):是一類本身不具備啟動子活性但能夠促進轉錄活性的順式調控元件。構成：由單拷貝或多拷貝組件串連構成，長100-200bp，核心組件8-12bp。作用特點：遠距離作用無方向性有啟動子依賴性，但對啟動子無嚴格專一性，因而無基因特異性。組織特異性相位性第二十一頁，共一百五十八頁，編輯于2023年，星期一第二十二頁，共一百五十八頁，編輯于2023年，星期一負性調控元件沉寂子（silencer)或衰減子(dehancer)：是一類抑制基因轉錄的順式調控元件，作用方式同增強子。轉錄終止信號：加尾信號：AATAA,polyA上游10-20bpG/T簇：能形成發夾結構的反向重復序列第二十三頁，共一百五十八頁，編輯于2023年，星期一第二十四頁，共一百五十八頁，編輯于2023年，星期一反式作用因子反式作用因子（Trans-actingfactor）:由位于不同或相同染色體上相距較遠的基因所編碼的蛋白質因子，通過與順式調控元件和RNA聚合酶的相互作用而調節基因轉錄活性。第二十五頁，共一百五十八頁，編輯于2023年，星期一轉錄信號1PTrans-actingfactorTrans-actingfactor(DNA結合蛋白）Cis-actingfactorAgenemRNAofAProteinABgenemRNAofBProteinB第二十六頁，共一百五十八頁，編輯于2023年，星期一反式作用因子可以分為3類：（1）普通轉錄因子（通用轉錄因子）：主要識別啟動子的核心啟動成分，如TATA盒結合因子TFIID；（2）組織特異性轉錄因子：是特殊組織與細胞中的反式作用因子，如淋巴細胞中的Oct-2；（3）誘導性反式作用因子：與反應性元件（responseelements）相結合的反式作用因子。如HSRE（熱休克反應元件，heatshockresponseelement）

GRE（糖皮質激素反應元件，glucocorticoidresponseelement）

CRE（cAMP反應元件，cAMPresponseelement）

第二十七頁，共一百五十八頁，編輯于2023年，星期一反式作用因子的結構DNA結合域轉錄激活域TF

富含谷氨酰胺結構域

酸性α-螺旋結構域

富含脯氨酸結構域

同源結構域

鋅指結構域

亮氨酸拉鏈

螺旋-環-螺旋

螺旋-轉角-螺旋第二十八頁，共一百五十八頁，編輯于2023年，星期一螺旋轉角螺旋鋅指結構亮氨基拉鏈螺旋環螺旋同源結構域SP1OCT-2AP-1myc第二十九頁，共一百五十八頁，編輯于2023年，星期一第三十頁，共一百五十八頁，編輯于2023年，星期一1、RNA加工成熟：無論是rRNA、tRNA、mRNA，轉錄后都必須經過加工，才能成為有功能的分子。

rRNA：前體是45S，成熟的rRNA是18S、28S、5.8S，還要經過化學修飾--核糖甲基化。

tRNA：首先經過核苷的修飾，生成4.5S前體tRNA，再剪接成為成熟的tRNA。

mRNA：5’加帽子，3’加poly(A)，還要經過剪接以及核苷酸的甲基化修飾。轉錄后水平的調控第三十一頁，共一百五十八頁，編輯于2023年，星期一第三十二頁，共一百五十八頁，編輯于2023年，星期一

真核生物的基因可以分為兩大類：一類是簡單的轉錄單位；另一類是復雜轉錄單位。轉錄后加工方式是不同的。（1）簡單轉錄單位：編碼產生一個多肽，轉錄后加工有3種形式。a、基因沒有內含子，轉錄后無需加工，也沒有poly(A),如組蛋白基因。b、沒有內含子，無需剪切，但需要加poly(A)尾，如α-干擾素基因。c、有內含子，需要加工，及加poly(A)尾，但它們只產生一個有功能的mRNA，如ɑ,β-珠蛋白基因。2、轉錄后加工的多樣性第三十三頁，共一百五十八頁，編輯于2023年，星期一第三十四頁，共一百五十八頁，編輯于2023年，星期一初級轉錄產物可通過不同的方式加工成兩個或兩個以上的mRNA。a、利用多個轉錄起始點或剪接位點產生不同的蛋白質。b、利用多個加多聚（A）位點和不同的剪切方式產生不同的蛋白質。c、雖無剪接，但有多個轉錄起始位點或加poly(A)位點。

（2）復雜轉錄單位第三十五頁，共一百五十八頁，編輯于2023年，星期一利用多個轉錄起始點或剪接位點產生不同的蛋白質第三十六頁，共一百五十八頁，編輯于2023年，星期一第三十七頁，共一百五十八頁，編輯于2023年，星期一利用多個加多聚（A）位點和不同的剪切方式產生不同的蛋白質第三十八頁，共一百五十八頁，編輯于2023年，星期一雖無剪接，但有多個轉錄起始位點或加poly(A)位點第三十九頁，共一百五十八頁，編輯于2023年，星期一翻譯水平的調控對可溶性蛋白質因子的修飾：如eIF-2磷酸化后可抑制蛋白質的合成。對mRNA穩定性的調節反義RNA對翻譯的調控作用反義RNA(anti-sense)：一段含有與被調控基因所產生mRNA互補的堿基序列的小分子RNA。①與mRNA結合，形成雙鏈RNA。影響mRNA的模板效率；②可能參與mRNA的拼接。第四十頁，共一百五十八頁，編輯于2023年，星期一第四十一頁，共一百五十八頁，編輯于2023年，星期一1.多肽的切割：切去前端的信號肽2.多肽的有限水解：蛋白質（酶原）必須經過有限的酶和化學水解才能變成有活性的物質。3.多肽的化學修飾：蛋白質磷酸化、糖基化（糖蛋白）、乙酰化。4.多肽的剪接：多肽被剪接成數個片段，再以一定的順序結合起來，形成有活性的蛋白質。翻譯后的調控第四十二頁，共一百五十八頁，編輯于2023年，星期一二、真核表達系統

真核表達系統（Eukaryoticexpressionsystem)：指在真核細胞中表達外源基因的體系。

組成：真核表達載體受體細胞基因轉移方式第四十三頁，共一百五十八頁，編輯于2023年，星期一（一）真核表達系統的必要性和優勢1.具有轉錄后加工系統：剪除內含子2.具有完善的翻譯后加工系統：對表達蛋白進行修飾，具有天然構型。3.可實現分泌表達:將表達產物分泌至細胞外培養液，簡化了純化工藝。4.有助于深入了解真核基因表達調控機制,實現基因治療。第四十四頁，共一百五十八頁，編輯于2023年，星期一（二）真核表達載體真核表達載體：適用于在真核細胞中表達外源基因的載體。真核載體根據受體不同，可分為：酵母表達載體、哺乳動物表達載體、昆蟲桿狀病毒表達載體。第四十五頁，共一百五十八頁，編輯于2023年，星期一

真核表達載體包括在大腸桿菌中起作用的復制起始位點、抗生素抗性基因、多克隆位點等。真核表達載體中還具有：①真核表達調控元件：包括啟動子、增強子、轉錄終止序列、polyA加尾信號等②真核細胞復制起始序列③真核細胞藥物抗性基因第四十六頁，共一百五十八頁，編輯于2023年，星期一真核表達載體帶有的polyA加尾信號可保證新轉錄的mRNA能有效地加上polyA。真核表達載體的基本組成

OriPro：原核復制起始序列；P：啟動子；MCS：多克隆位點；TT：轉錄終止序列；orieuk：真核復制起始序列。注：不是所有真核表達載體都有整合序列PolyA第四十七頁，共一百五十八頁，編輯于2023年，星期一（三）真核表達系統1.酵母表達系統：利用酵母表達載體，在酵母細胞中表達外源基因2.哺乳動物細胞表達系統：利用重組質粒或病毒載體，在哺乳動物細胞內表達外源基因3.昆蟲細胞表達系統：利用昆蟲桿狀病毒表達載體，在昆蟲細胞內表達外源基因第四十八頁，共一百五十八頁，編輯于2023年，星期一

酵母表達系統

第四十九頁，共一百五十八頁，編輯于2023年，星期一特點及優勢

酵母菌是單細胞真核生物，其遺傳背景清楚培養簡單，生長周期短，經濟生物安全性高可分泌表達，簡化純化工藝第五十頁，共一百五十八頁，編輯于2023年，星期一（一）酵母載體在酵母細胞中復制、擴增和表達的載體，包括克隆載體和表達載體。主要組成元件：篩選標記：如抗生素抗性基因Zeocin(博來霉素,屬于爭光霉素家族的成員）營養缺陷標記基因Leu(β異丙基蘋果酸脫氫酶,參與丙酮酸向亮氨酸的轉化)

第五十一頁，共一百五十八頁，編輯于2023年，星期一

Leu-作為酵母載體的選擇標記基因第五十二頁，共一百五十八頁，編輯于2023年，星期一用于酵母載體中的調控序列ARS（AutoReplicationSequence)：自主復制序列，為酵母復制起始區(點)。2μM質粒：酵母核質中的小的環狀DNA，可以獨立復制并轉錄。酵母啟動子：常用的有GAP（3-磷酸甘油醛脫氫酶）、AOX1（醇氧化酶-1）、ADH(乙醇脫氫酶)、SUC(蔗糖酶)、PGK(磷酸甘油酸激酶)、Apase(堿性磷酸酶)啟動子。酵母著絲粒區段(CEN)：增加轉化子穩定性。第五十三頁，共一百五十八頁，編輯于2023年，星期一酵母載體的種類酵母克隆載體：不含酵母啟動子，不能在酵母中表達外源基因，如YIP、YRP、YEP酵母表達載體：酵母克隆載體+酵母啟動子,若引入信號肽序列，則成為分泌型載體YAC：酵母人工染色體（yeastartificialchromosome)可插入200～800kb的外源基因片段，因而特別適合高等真核生物基因組的克隆與表達研究。第五十四頁，共一百五十八頁，編輯于2023年，星期一1.YIp(酵母整合型質粒)：細菌質粒DNA+酵母遺傳標記，通過同源重組整合入酵母染色體，轉化子穩定，但轉化率極低。2.YRp(酵母復制型質粒)：細菌質粒DNA+酵母遺傳標記(YIp)+酵母復制序列(ARS),可自主復制，但穩定性差。3.YEp(酵母附加子型質粒)：細菌質粒DNA+酵母標記基因(YIp)+酵母2μM質粒，游離于核外存在并自主復制。I.

酵母克隆載體第五十五頁，共一百五十八頁，編輯于2023年，星期一

酵母克隆載體的構建第五十六頁，共一百五十八頁，編輯于2023年，星期一II.酵母表達載體含酵母啟動子穿梭載體(shuttlevector)：既可以攜帶外源基因在原核細胞中復制增殖，又可以在真核細胞中表達外源基因的載體。種類：釀酒酵母表達載體畢赤酵母表達載體分泌型表達載體：引入酵母的信號肽基因，如因子信號肽第五十七頁，共一百五十八頁，編輯于2023年，星期一釀酒酵母表達載體Leu2編碼β異丙基蘋果酸脫氫酶，作為篩選標記。帶有此質粒的酵母菌在不含有亮氨酸的培養基中能生長。第五十八頁，共一百五十八頁，編輯于2023年，星期一畢赤酵母表達載體整合型HIS4編碼組氨醇脫氫酶基因，作為篩選標記。HIS4區的整合方式為位點特異性單交換引起的基因插入，整合后使營養缺陷型宿主恢復野生型，在不含組氨酸的培養基上能生長。第五十九頁，共一百五十八頁，編輯于2023年，星期一5‘AOX1啟動子片段含有AOX1啟動子，在甲醇的誘導下可啟動外源蛋白的表達；α-因子信號肽序列為約89個氨基酸的信號肽序列，能使外源蛋白分泌到發酵上清中，更利于外源蛋白的純化；多克隆位點含多個酶切位點，為外源基因的插入提供位點；TT序列提供有效的轉錄終止和polyA修飾信號；HIS4為營養缺陷型篩選標志；3‘AOX1基因片段能夠與基因組AOX1基因屬同源重組；抗Amp基因和pBR322能使空載體和構建的表達載體在E.coli中篩選和復制。以應用于畢赤酵母表達系統的pPIC9載體為例解釋載體的構件第六十頁，共一百五十八頁，編輯于2023年，星期一畢赤酵母分泌型表達載體啟動外源基因的啟動子：PGAPPTEF1PEMT，MCS：多克隆位點鑒定的標記：6╳His，myc.終止子：AOX1TT，CYC1TT抗生素篩選標記：zeocin.復制起始位點：pUCori第六十一頁，共一百五十八頁，編輯于2023年，星期一III.酵母人工染色體（YAC）YAC:利用酵母的著絲粒序列（CEN）、酵母復制起始區（ARS）及端粒重復序列（TEL）構建的人工染色體結構：左臂：TEL、選擇標記、ARS、CEN

右臂：TEL、選擇標記特點：容量大（200-800kb），穩定性差作用：構建基因組文庫第六十二頁，共一百五十八頁，編輯于2023年，星期一

YAC載體中最常用的是pYAC4篩選標記:His3:組氨酸合成缺陷性標記URA3:尿嘧啶合成缺陷性標記SUP4:赭石突變(ade2-1)抑制基因sup4第六十三頁，共一百五十八頁，編輯于2023年，星期一第六十四頁，共一百五十八頁，編輯于2023年，星期一（二）受體細胞1、釀酒酵母：它具有作為宿主菌必須具備的許多條件，是最早應用于外源基因克隆和表達的酵母菌。目前已表達了諸如乙型肝炎疫苗、人胰島素、人粒細胞集落刺激因子等多種外源基因產物。其缺點是在發酵過程中會產生乙醇，影響酵母的生長代謝和基因產物的表達。此外，釀酒酵母在蛋白質的加工過程中會發生過度糖基化作用，其分泌表達能力也有待提高。第六十五頁，共一百五十八頁，編輯于2023年，星期一表1-3在釀酒酵母中表達的重組蛋白種類名稱疫苗乙肝病毒表面抗原，瘧原蟲環子孢子蛋白，HIV－1外殼蛋白診斷試劑丙肝病毒蛋白，HIV－1抗原人類治療用蛋白藥物上皮生長因子，胰島素，類胰島素生長因子，血小板源生長因子，胰島素前體，成纖細胞生長因子，集落刺激因子，α1抗胰蛋白酶，凝血因子XⅢa第六十六頁，共一百五十八頁，編輯于2023年，星期一2、畢赤酵母：新發展的酵母受體細胞高表達（12mg/L）：AOX1啟動子或GAP啟動子高穩定性：載體為整合型高分泌（10mg/L）：因子信號肽基因

在畢赤酵母中得到表達的重組異源蛋白有乙型肝炎表面抗原、人腫瘤壞死因子、人表皮生長因子、鏈激酶等幾十種。畢赤酵母的分泌表達能力比釀酒酵母強，但對其遺傳背景了解還比較少，且發酵周期也比較長。第六十七頁，共一百五十八頁，編輯于2023年，星期一（三）轉化①鋰鹽法；②PEG法；③原生質球法；④電穿孔法。

電穿孔法：效率較高,應用最廣整合型載體轉化前要酶切線性化第六十八頁，共一百五十八頁，編輯于2023年，星期一（四）外源基因在酵母菌中的表達1、胞內表達：直接表達外源基因

2、分泌表達：在MCS前加入信號肽序列

pGAPZ,利用因子分泌表達第六十九頁，共一百五十八頁，編輯于2023年，星期一第七十頁，共一百五十八頁，編輯于2023年，星期一第七十一頁，共一百五十八頁，編輯于2023年，星期一人Endostatin

基因的克隆、表達中國人胎肝總RNAEndostatincDNApGEM-T載體T-A克隆RT-PCR重組endostatin克隆載體pGAPZaA載體重組endostatin表達載體電轉化GS115畢赤酵母菌ZeocinSDS陽性重組子第七十二頁，共一百五十八頁，編輯于2023年，星期一第七十三頁，共一百五十八頁，編輯于2023年，星期一重組Endostatin的初步純化與抑制作用研究陽性重組子大量擴增、表達endostatin蛋白培養上清超濾濃縮SepharoseG25去鹽Heparin親和層析初步純化的重組endostatin蛋白濃縮液透析抑制作用研究體外作用ECV304細胞HepG2.2.15細胞體內作用裸鼠人肝癌模型兔角膜新生血管第七十四頁，共一百五十八頁，編輯于2023年，星期一（五）高表達的策略1.利用誘導型強啟動子2.提高整合拷貝數3.控制蛋白酶降解活性4.分泌表達第七十五頁，共一百五十八頁，編輯于2023年，星期一（六）缺點不能實現全部的翻譯后修飾功能第七十六頁，共一百五十八頁，編輯于2023年，星期一哺乳動物細胞表達系統第七十七頁，共一百五十八頁，編輯于2023年，星期一

優點進行完全的翻譯后修飾可表達產生有功能的膜蛋白用途：表達大量的外源蛋白研究基因的功能基因治療

有效選擇轉化細胞，要求載體具備明顯的標記基因第七十八頁，共一百五十八頁，編輯于2023年，星期一（一）幾種常用的哺乳動物表達系統的選擇標記基因1、胸苷激酶(tk)基因2、二氫葉酸還原酶(dhfr)基因3、新霉素抗性基因(neo)、4、氯霉素乙酰轉移酶基因檢測系統5、黃嘌呤-鳥嘌呤轉移酶（XGPRT）基因第七十九頁，共一百五十八頁，編輯于2023年，星期一1、胸苷激酶（tk）基因胸腺嘧啶核苷激酶簡稱胸苷激酶（thymidineKinase,TK）在所有真核細胞中都有表達,是嘧啶生物合成補救代謝途徑中的一個關鍵酶,它可催化胸苷磷酸化轉變成為dTMP,繼續磷酸化生成dTTP,參與DNA的生物合成。第八十頁，共一百五十八頁，編輯于2023年，星期一tk+細胞中：胸苷(T)→胸苷-磷酸→TTP二氫葉酸二氫葉酸還原酶

四氫葉酸

TTPdCTPdATP

氨基喋呤(Aminopterin)

tk阻斷補加次黃嘌呤（H）死亡存活補救合成第八十一頁，共一百五十八頁，編輯于2023年，星期一胸苷激酶(tk)基因HAT選擇法原理攜帶外源基因的載體連接有tk基因，可以表達胸苷激酶以tk－細胞為受體細胞在HAT（次黃嘌呤－氨基喋呤－胸苷）選擇培養基中，只有外源基因轉化成功的tk+細胞存活，tk-細胞死亡則陽性重組子在HAT中篩選出來第八十二頁，共一百五十八頁，編輯于2023年，星期一2、二氫葉酸還原酶(dhfr)基因二氫葉酸二氫葉酸還原酶

四氫葉酸

TTPdCTPdATP

氨基蝶呤氨甲喋呤阻斷第八十三頁，共一百五十八頁，編輯于2023年，星期一二氫葉酸還原酶基因篩選法原理

攜帶外源基因的載體連接有dhfr基因，可以表達二氫葉酸還原酶以dhfr-細胞為受體：CHO細胞dhfr-細胞無法在普通培養基中存活，而轉化入dhfr基因后可以存活，并表達外源基因。若在培養基內加入氨甲蝶呤，進行加壓篩選，可以提高外源基因表達量。第八十四頁，共一百五十八頁，編輯于2023年，星期一3、新霉素抗性基因(neo)新霉素的類似物G418（gentamycin）對原核、真核細胞均有毒性。攜帶外源基因的載體連接有neo基因，neo編碼的磷酸轉移酶可滅活G418，因而，只有轉化入neo基因的細胞才能夠在含有G418的培養基中存活。此種篩選方法要求載體攜帶neo基因，而對受體細胞無要求，應用更為簡便。第八十五頁，共一百五十八頁，編輯于2023年，星期一4、氯霉素乙酰轉移酶基因檢測系統

氯霉素乙酰轉移酶（Cat）是由大腸桿菌轉座子Tn9編碼的。Cat可催化氯霉素發生乙酰化作用，使其實去活性。雖然真核細胞不含有內源性的Cat酶活性，但真核細胞的啟動子可引發外源性Cat基因的表達。第八十六頁，共一百五十八頁，編輯于2023年，星期一以Cat基因作為選擇標記的原理將帶有Cat基因的質粒載體轉化到哺乳動物細胞后，就會合成Cat。哺乳動物細胞本身不能合成Cat，所以只要在轉化的細胞中檢測到Cat的活性，即可肯定它是來自外源的Cat質粒。特別適用于瞬時表達的研究。第八十七頁，共一百五十八頁，編輯于2023年，星期一5、黃嘌呤-鳥嘌呤轉移酶（XGPRT）基因XGPRT是由大腸桿菌Ecogpt基因編碼的一種核苷酸代謝酶，哺乳動物細胞無XGPRT酶，不能利用黃嘌呤形成黃嘌呤核苷酸（XMP），但有鳥嘌呤磷酸核糖轉移酶（HGPRT），可催化黃嘌呤形成次黃嘌呤核苷酸（IMP）。哺乳動物細胞可通過IMP生成GMP。當用IMP脫氫酶抑制劑霉酚酸，抑制了GMP的合成，使細胞失去合成DNA能力而死亡。第八十八頁，共一百五十八頁，編輯于2023年，星期一黃嘌呤-鳥嘌呤轉移酶（XGPRT）

基因篩選法原理將含XGPRT基因的重組體導入真核細胞后，在轉化細胞中就能表達XGPRT酶，可在含有黃嘌呤的培養基中通過XMP中間體補救合成GMP，使DNA合成正常進行。加入霉酚酸后，陽性克隆因不受霉酚酸的抑制而存活，而未轉化的陰性細胞則受霉酚酸的抑制而死亡，以此可用來篩選陽性細胞。第八十九頁，共一百五十八頁，編輯于2023年，星期一第九十頁，共一百五十八頁，編輯于2023年，星期一（二）外源基因導入哺乳動物

細胞的載體質粒型(非病毒型)載體病毒型載體第九十一頁，共一百五十八頁，編輯于2023年，星期一啟動子：病毒來源的：SV40、CMV、RSV

細胞來源的：HSP、MCK（肌酸激酶）增強子:來源于SV40、RSV、CMV（在不同種屬細胞中都有極強的促進轉錄能力）篩選標記原核序列：復制子及篩選標記真核復制起始點：提高外源基因表達水平轉錄終止信號和多聚腺苷酸化信號

哺乳動物細胞表達載體的主要元件第九十二頁，共一百五十八頁，編輯于2023年，星期一1.質粒型載體由真核復制信號、啟動子、轉錄單位及質粒片段組成,不需要包裝細胞。如：pcDNA3、pVAX1、pEGFP-N1等。第九十三頁，共一百五十八頁，編輯于2023年，星期一第九十四頁，共一百五十八頁，編輯于2023年，星期一BGH：BovineGrowthHormone第九十五頁，共一百五十八頁，編輯于2023年，星期一pVAX1的特點不僅具有在大腸桿菌中高拷貝復制和在多數哺乳類動物細胞中高效表達蛋白的特點,而且pVAX1具有卡那霉素抗性,在人體內產生變應反應者較少。pVAX1是由美國食品和藥品管理委員會（FDA）推薦的唯一可以應用于人體實驗的載體質粒。迄今為止，關于pVAX1的研究已涉及動物和臨床試驗。第九十六頁，共一百五十八頁，編輯于2023年，星期一第九十七頁，共一百五十八頁，編輯于2023年，星期一pEGFP-N1載體具有以下幾方面特點：

①從結構上看，該質粒具有很強的復制能力，可以滿足隨宿主細胞分裂時跟隨胞質遺傳給新生的子細胞，這是保證目的基因穩定表達的因素之一；

②含有高效的功能強大的啟動子SV40和PCMV，可以使目的基因在增殖的細胞中穩定表達；

③具有多克隆位點，便于目的基因的插入；

④該載體具有neo基因，可以采用G418來篩選已成功轉染了該載體的靶細胞。

這些特殊的結構可以實現目的基因在靶細胞內的穩定表達。

第九十八頁，共一百五十八頁，編輯于2023年，星期一GFP的相關知識：

綠色熒光蛋白(GreenFluorescentProtein，GFP)基因來源于JellyfishAequoreaVictoria，是Shimomura等于1962年發現的蛋白質，由238個氨基酸組成，分子量約為27Kd。GFP在包括熱、極端PH和化學變性劑等苛刻條件下都很穩定，用甲醛固定后會持續發出熒光，但在還原環境下熒光會很快熄滅。

第九十九頁，共一百五十八頁，編輯于2023年，星期一

與以往常用的報告基因相比，GFP具有以下優點：

①在熒光顯微鏡下，用波長約490nm的紫外線激發后，即可觀察到綠色熒光，直接、簡捷、便于檢測；

②無需任何的作用底物或共作用物,檢測的靈敏度不受反應效率的影響，保證了極高的檢出率；

③蛋白本身性質穩定；

④可在多種異源生物中表達且無細胞毒性；

⑤其基因片段長度較小(約717bp)，易于構建融合蛋白，且融合蛋白仍能保持熒光激發活性，為研究其他基因表達產物的分布提供了方便。

第一百頁，共一百五十八頁，編輯于2023年，星期一EGFP是一種優化的突變型GFP，使其產生的熒光較普通GFP強35倍，大大增強了其報告基因的敏感度。EGFP與其他蛋白的融合表達已有很多成功的例子，而且其N及C端均可融合，并不影響其發光。

第一百零一頁，共一百五十八頁，編輯于2023年，星期一2.病毒型載體外源DNA插入病毒DNA或取代病毒基因某一片段，重組DNA隨病毒顆粒而復制(多需輔助病毒或包裝細胞的存在)。如：逆轉錄病毒載體、腺病毒載體等第一百零二頁，共一百五十八頁，編輯于2023年，星期一病毒型載體的類型整合型整合入宿主染色體，隨染色體復制而復制可持續表達外源基因安全性低：插入誘變

SV40載體，逆轉錄病毒載體，慢病毒載體，腺相關病毒載體游離型不整合生物安全性高瞬時表達腺病毒載體，痘苗病毒載體第一百零三頁，共一百五十八頁，編輯于2023年，星期一SV40(猴空泡病毒40)載體dsDNA病毒，基因組約5.2kb基因結構清楚,含有整套基因表達調控序列早期區：T、t抗原（腫瘤蛋白質或抗原）T抗原是細胞轉化的啟動所必須的。t抗原對于細胞的轉化不是必需的，但可起加強作用。

晚期區：產生病毒衣殼蛋白（VP1，VP2及VP3)，包裝病毒顆粒所必需復制起始位點：早、晚區基因之間第一百零四頁，共一百五十八頁，編輯于2023年，星期一第一百零五頁，共一百五十八頁，編輯于2023年，星期一

特點載體構建：早期取代晚期取代天然SV40載體宿主范圍窄，容量小（2.5kb）易形成野生型病毒溶源生長：導致宿主細胞裂解死亡故較少使用，做瞬時轉染用（轉化COS細胞），或利用其調控元件。pSV系列由SV40派生的一系列質粒型載體第一百零六頁，共一百五十八頁，編輯于2023年，星期一第一百零七頁，共一百五十八頁，編輯于2023年，星期一第一百零八頁，共一百五十八頁，編輯于2023年，星期一逆轉錄病毒載體(RV)

基因組結構：ssRNA(9.2kb)LTRgagpolenvLTRφLTR（longterminalrepeat）:長末端重復序列,含啟動子和polyA信號,介導病毒整合。φ包裝信號：是包裝病毒顆粒時所必須的非編碼序列。結構蛋白：核心蛋白(gag)、逆轉錄酶（pol)、衣殼蛋白(env)。第一百零九頁，共一百五十八頁，編輯于2023年，星期一第一百一十頁，共一百五十八頁，編輯于2023年，星期一逆轉錄病毒穿梭載體pLXSNMCS第一百一十一頁，共一百五十八頁，編輯于2023年，星期一載體元件：LTR、標記基因及質粒部分組成逆轉錄病毒載體系統包括：一個含有目的基因的表達載體；一個編碼VSV-G（皰疹性口腔炎病毒糖蛋白G，是一種包膜蛋白，具有廣泛的宿主范圍）的輔助質粒；表達gag/pol的輔助質粒；293T（人胚腎細胞）包裝細胞。

第一百一十二頁，共一百五十八頁，編輯于2023年，星期一優點：宿主范圍廣，能感染多種動物和人類的不同類型的細胞而無嚴格的組織特異性；逆轉錄病毒載體能夠高效地感染分裂的宿主細胞，感染細胞后能夠將載體基因組穩定整合到宿主基因組的隨機位點上，使目的基因長期穩定表達。逆轉錄病毒的免疫原性較低。缺點：只能感染分裂細胞，而不能感染非分裂細胞；能夠插人的外源基因較小(7～8kb)，難以滿足較大基因的轉移；載體DNA整合人宿主染色體是隨機的，并因隨機整合使原癌基因激活或抑癌基因失活，從而具有引發癌癥的風險；

第一百一十三頁，共一百五十八頁，編輯于2023年，星期一目的基因

RV穿梭載體

包裝細胞系

重組RV載體E．coli大量擴增病毒載體DNA重組逆轉錄病毒顆粒

受體細胞

表達蛋白，研究宿主細胞性狀克隆共轉染感染轉化輔助質粒篩選、擴增第一百一十四頁，共一百五十八頁，編輯于2023年，星期一

慢病毒載體（lentivirus）屬逆轉錄病毒亞屬，是一類非鼠源性逆轉錄病毒，以人類免疫缺陷病毒（HIV）為代表。慢病毒源性載體（lentivirus-basedvector，LV）：能將外源基因整合入非分裂細胞的基因組內。無明顯免疫反應，長期的轉基因表達。具有嚴格的宿主范圍、滴度低及HIV-1獨特的致病性，限制了它作為轉基因載體的應用。主要應用于轉染神經元，效果好于腺相關病毒載體和逆轉錄病毒載體。

第一百一十五頁，共一百五十八頁，編輯于2023年，星期一第一百一十六頁，共一百五十八頁，編輯于2023年，星期一腺相關病毒載體（AAV）腺相關病毒：Adeno-AssociatedVirus，AAV線狀單鏈DNA病毒，4.7kb，缺陷型非病原性人類細小病毒，只有與腺病毒、單純皰疹病毒等共感染時才能進行有效復制。感染細胞范圍廣，可感染分裂期與分裂后期細胞野生型病毒可定點整合人類19號染色體長臂，基因表達穩定;

第一百一十七頁，共一百五十八頁，編輯于2023年，星期一缺點外源基因插入容量小（5kb以下）感染效率比逆轉錄病毒低制備滴度低存在一定的免疫反應主要應用于轉染骨骼肌、視網膜、肝細胞、神經元細胞等第一百一十八頁，共一百五十八頁，編輯于2023年，星期一腺病毒（Ad）載體基因結構：dsDNA,線性，36kbφE1A

E1BL1E3E2AE2BE4Φ：包裝信號E1—E4:結構蛋白第一百一十九頁，共一百五十八頁，編輯于2023年，星期一載體構建：取代結構基因特點：安全性高(人為自然宿主，不整合)

滴度高（1011pfu/ml）容量大（--36kb)

可感染非分裂細胞可直接體內應用，原位感染組織是目前基因治療的最常用載體缺點：免疫原性高，表達時間短無組織特異性真核細胞內篩選復雜，費時第一百二十頁，共一百五十八頁，編輯于2023年，星期一AdEasy-1systemAdEasy-1system具有以下優點：1.效率高：可以感染分裂期與靜止期細胞2.篩選方便：帶有目的基因的穿梭載體與病毒骨架質粒的同源重組發生于原核細胞（如細菌）內。3.生物安全性高：不整合4.插入容量大第一百二十一頁，共一百五十八頁，編輯于2023年，星期一AdEasy-1system包括：腺病毒穿梭載體：可連接外源基因骨架質粒：含有腺病毒大部分結構基因的質粒，pAdEasy-1

受體細胞：E.coliBJ5183

包裝細胞：轉入E1或E4基因區的HEK293（人胚腎細胞）或911細胞（人胚視網膜細胞）第一百二十二頁，共一百五十八頁，編輯于2023年，星期一穿梭載體第一百二十三頁，共一百五十八頁，編輯于2023年，星期一第一百二十四頁，共一百五十八頁，編輯于2023年，星期一痘苗病毒載體容量大安全性好：長期用作預防天花的疫苗可用來構建多價疫苗

第一百二十五頁，共一百五十八頁，編輯于2023年，星期一常用的病毒載體的特點：第一百二十六頁，共一百五十八頁，編輯于2023年，星期一（三）受體細胞1、CHO細胞（中國倉鼠卵巢癌細胞）

可穩定表達外源基因，并可大規模生產藥物、抗體及診斷試劑，被美國FDA確認為基因工程受體細胞。2、COS細胞（猴腎細胞系）

能瞬時大量表達外源蛋白，是進行外源基因瞬時表達時用途最廣的宿主細胞。3、其他細胞：如腫瘤細胞Hela(人宮頸癌細胞）等。第一百二十七頁，共一百五十八頁，編輯于2023年，星期一（四）重組載體導入細胞的方法第一百二十八頁，共一百五十八頁，編輯于2023年，星期一1.病毒感染：借用病毒的感染方式，將外源基因事先插入到病毒的基因組中，并用適當的方式包裝成有感染活性的重組病毒顆粒，用于感染細胞，從而將外源病毒導入到相應的細胞中。常用：逆轉錄病毒；腺病毒；皰疹病毒等。優點：整和效率高,可使外源基因在宿主細胞中長期表達,適用于難以轉染的原代細胞。缺點：重組病毒建立有一定難度；存在潛在的安全危險性。第一百二十九頁，共一百五十八頁，編輯于2023年，星期一目的基因

AdV穿梭載體

包裝細胞HEK293

重組AdV載體E．coli

BJ5183同源重組陽性的腺病毒基因組載體DNA重組rAd病毒顆粒

受體細胞

表達蛋白，研究宿主細胞性狀克隆轉染感染骨架質粒共轉染轉化E．coli

擴增轉化Ecoli擴增第一百三十頁，共一百五十八頁，編輯于2023年，星期一圖1：復制缺陷型重組腺病毒載體制備原理圖圖2輔助病毒依賴型腺病毒載體制備示意圖第一百三十一頁，共一百五十八頁，編輯于2023年，星期一2.轉染：外源DNA導入到細胞中的非病毒方法，通常稱為轉染。分化學方法和物理方法。理想的轉染方法：操作簡單、高效、低毒、對細胞正常生理狀況影響小、重復性好、成本低。磷酸鈣共沉淀法陽離子脂質體轉染受體介導的基因轉移電穿孔顯微注射基因槍第一百三十二頁，共一百五十八頁，編輯于2023年，星期一Atypicalmammalianexpressionvectorforhigh-levelproteinexpression第一百三十三頁，共一百五十八頁，編輯于2023年，星期一磷酸鈣共沉淀法

磷酸鈣有利于促進外源DNA與靶細胞表面結合,氯化鈣+DNA+磷酸緩沖液按一定的比例混和,形成極小的磷酸鈣-DNA復合物沉淀黏附在細胞膜表面,借助內吞作用進入細胞質。沉淀顆粒的大小和質量對于轉染的成功至關重要。第一百三十四頁，共一百五十八頁，編輯于2023年，星期一磷酸鈣共沉淀法的優缺點優點：能用于任何DNA導入哺乳類動物,瞬時轉染和穩定轉染。缺點：轉染效率低：進入細胞的DNA只有１％－５％可以進入細胞核,其中只有不到１％的DNA可以與細胞DNA整合,在細胞中進行穩定表達。重復性不佳：pH值、鈣離子濃度、DNA濃度、沉淀反應時間、細胞孵育時間乃至各組分加入順序和混合的方式都可能對結果產生影響。第一百三十五頁，共一百五十八頁，編輯于2023年，星期一脂質體介導基因轉移法中性脂質體是利用脂質膜包裹DNA,借助脂質膜將DNA導入細胞膜內。

第一百三十六頁，共一百五十八頁，編輯于2023年，星期一帶正電的陽離子脂質體,DNA并沒有預先包埋在脂質體中,而是帶負電的DNA自動結合到帶正電的脂質體上,形成DNA-陽離子脂質體復合物,從而吸附到帶負電的細胞膜表面,經過內吞被導入細胞。第一百三十七頁，共一百五十八頁，編輯于2023年，星期一脂質體介導方法的優缺點優點：適用于把ＤＮＡ轉染入懸浮或貼壁培養細胞,可用于瞬時轉染和穩定轉染；轉染效率高,比磷酸鈣法高5-100倍；能夠把ＤＮＡ和ＲＮＡ轉染到各種細胞,轉染的穩定性好,可重復性高,轉染時最好不加血清和抗生素。缺點：陽離子脂質體細胞毒性相對較高,對部分細胞可能會干擾細胞的代謝。第一百三十八頁，共一百五十八頁，編輯于2023年，星期一受體介導的基因轉移

配體寡肽E5針對細胞表面受體（IGFRI，II）HA20流感病毒血凝素功能域20肽，作為內吞小體釋放寡肽多聚陽離子多肽PCP多聚賴氨酸（PL）攜帶外源基因的質粒DNA第一百三十九頁，共一百五十八頁，編輯于2023年，星期一質粒DNAE5-PCP-PLHA20-PCP-PLHA20：破壞溶酶體膜E5：特異性導入肝癌細胞吞噬溶酶體第一百四十頁，共一百五十八頁，編輯于2023年，星期一電穿孔介導基因轉移法

靠脈沖電流在細胞膜上打孔而將核酸導入細胞.

第一百四十一頁，共一百五十八頁，編輯于2023年，星期一電穿孔法的優缺點優點：轉染效率較高缺點：需要昂貴的儀器（電穿孔儀）