蛋白質含量測量—、實驗目的學會各種蛋白質含量的測定方法。了解各種測定方法的基本原理和優缺點。二、實驗原理1.考馬斯亮蘭法（Bradford法）考馬斯亮蘭法（Bradford法），是根據蛋白質與染料相結合的原理設計的。這種蛋白質測定法具有超過其他的突出優點，因而正在得到廣泛的應用。這一方法是目前靈敏度最高的蛋白質測定法。考馬斯亮蘭G-250染料（如圖），在酸性溶液中與蛋白質結合，使染料的最大吸收峰的位置（Amax）,由465nm變為595nm,溶液的顏色也由棕黑色變為蘭色。經研究認為，染料主要是與蛋白質中的堿性氨基酸（特別是精氨酸）和芳香族氨基酸殘基相結合。在595nm下測定的吸光度值A5%，與蛋白質濃度成正比。CHjCI^OCHjCI^OBradford法的突出優點是：（1） 靈敏度高，據估計比Lowry法約高四倍，其最低蛋白質檢測量可達1咫。這是因為蛋白質與染料結合后產生的顏色變化很大，蛋白質一染料復合物有更高的消光系數，因而光吸收值隨蛋白質濃度的變化比Lowry法要大的多。（2） 測定快速、簡便，只需加一種試劑。完成一個樣品的測定，只需要5分鐘左右。由于染料與蛋白質結合的過程，大約只要2分鐘即可完成，其顏色可以在1小時內保持穩定，且在5分鐘至20分鐘之間，顏色的穩定性最好。因而完全不用像Lowry法那樣費時和嚴格地控制時間。（3） 干擾物質少。如干擾Lowry法的K\Na\Mg”離子、Tris緩沖液、糖和蔗糖、甘油、筑基乙醇、EDTA等均不干擾此測定法。此法的缺點是：（1） 由于各種蛋白質中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此Bradford法用于不同蛋白質測定時有較大的偏差，在制作標準曲線時通常選用y—球蛋白為標準蛋白質，以減少這方面的偏差。（2） 仍有一些物質干擾此法的測定，主要的干擾物質有：去污劑、TritonXTOO、十二烷基硫酸鈉（SDS）和0.1N的NaOHo（如同0.1N的酸干擾Lowary法一樣）。（3） 標準曲線也有輕微的非線性，因而不能用Beer定律進行計算，而只能用標準曲線來測定未知蛋白質的濃度。2.紫外吸收法蛋白質分子中，酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸殘基的苯環含有共軸雙鍵，使蛋白質具有吸收紫外光的性質。吸收高峰在280nm處，其吸光度（即光密度值）與蛋白質含量成正比。此外，蛋白質溶液在238nm的光吸收值與肽鍵含量成正比。利用一定波長下，蛋白質溶液的光吸收值與蛋白質濃度的正比關系，可以進行蛋白質含量的測定。紫外吸收法簡便、靈敏、快速，不消耗樣品，測定后仍能回收使用。低濃度的鹽，例如生化制備中常用的（NH.）2S0，.等和大多數緩沖液不干擾測定。特別適用于柱層析洗脫液的快速連續檢測，因為此時只需測定蛋白質濃度的變化，而不需知道其絕對值。此法的特點是測定蛋白質含量的準確度較差，干擾物質多，在用標準曲線法測定蛋白質含量時，對那些與標準蛋白質中酪氨酸和色氨酸含量差異大的蛋白質,有一定的誤差。故該法適于用測定與標準蛋白質氨基酸組成相似的蛋白質。若樣品中含有哽吟、嗟嚏及核酸等吸收紫外光的物質，會出現較大的干擾。核酸的干擾可以通過查校正表，再進行計算的方法，加以適當的校正。但是因為不同的蛋白質和核酸的紫外吸收是不相同的，雖然經過校正，測定的結果還是存在一定的誤差。此外，進行紫外吸收法測定時，由于蛋白質吸收高峰常因pH的改變而有變化，因此要注意溶液的pH值，測定樣品時的pH要與測定標準曲線的pH相一致。按測定的波長劃分，紫外吸收法分為多種，本實驗中使用三種：①280nm的光吸收法因蛋白質分子中的酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸在280nm處具有最大吸收，且各種蛋白質的這三種氨基酸的含量差別不大，因此測定蛋白質溶液在280nm處的吸光度值是最常用的紫外吸收法。測定時，將待測蛋白質溶液倒入石英比色.皿中，用配制蛋白質溶液的溶劑（水或緩沖液）作空白對照，在紫外分光度計上直接讀取280nm的吸光度值A”。。蛋白質濃度可控制在0.ri.Omg/ml左右。通常用lcm光徑的標準石英比色皿，盛有濃度為Img/ml的蛋白質溶液時，A*約為1.0左右。由此可立即計算出蛋白質的大致濃度。許多蛋白質在一定濃度和一定波長下的光吸收值（A氣5）有文獻數據可查，根據此光吸收值可以較準確地計算蛋白質濃度。下式列出了蛋白質濃度與（Ax\.）值（即蛋白質溶液濃度為1%,光徑為1cm時的光吸收值）的關系。文獻值A氣g"爾為百分吸收系數或比吸收系數。蛋白質濃度=（MoxlO）/A11cm,280am（mg/ml）（因為：1%濃度?10mg/ml）本實驗中用的是牛血清清蛋白：AJ6.3（280nm）若查不到待測蛋白質的AZs值，則可選用一種與待測蛋白質的酪氨酸和色氨酸含量相近的蛋白質作為標準蛋白質，用標準曲線法進行測定。標準蛋白質溶液配制的濃度為1.0mg/ml。常用的標準蛋白質為牛血清清蛋白（BSA）。標準曲線的測定：取6支試管，按下表編號并加入試劑：用第1管為空白對照，各管溶液混勻后在紫外分光光度計上測定吸光度A”。,以A湖為縱座標，各管的蛋白質濃度或蛋白質量（mg）為橫座標作圖，標準曲線應為直線，利用此標準曲線，根據測出的未知樣品的冬8。值，即可查出未知樣品的蛋白質含量，也可以用2至6管&8。值與相應的試管中的蛋白質濃度計算出該蛋白質的A氣心。顧②215nm與225nm的吸收差法蛋白質的稀溶液由于含量低而不能使用280nm的光吸收測定時，可用215nm與225nm吸收值之差，通過標準曲線法來測定蛋白質稀溶液的濃度。用己知濃度的標準蛋白質，配制成20?lOOpg/ml的一系列5.Oml的蛋白質溶液，分別測定215nm和225nm的吸光度值，并計算出吸收差：吸收差A215—A225以吸收差△為縱座標，蛋白質濃度為橫座標，繪出標準曲線。再測出未知樣品的吸收差，即可由標準曲線上查出未知樣品的蛋白質濃度。本方法在蛋白質濃度20~100pg/m1范圍內，蛋白質濃度與吸光度成正比，NaCK（阻）2SO1以及0.1M磷酸、硼酸和Tris等緩沖液，都無顯著干擾作用，但是0.INNaOH,0.1M乙酸、琥珀酸、鄰苯二甲酸、巴比妥等緩沖液的215nm光吸收值較大，必須將其濃度降到0.005M以下才無顯著影響。三、儀器與試劑考馬斯亮藍法：試劑：（1） 標準蛋白質溶液,用牛血清清蛋白（BSA）,配制成1.Omg/ml和0.lmg/ml的標準蛋白質溶液。（2） 考馬斯亮蘭G—250染料試劑:稱lOOmg考馬斯亮蘭G—250,溶于50ml95%的乙醇后，再加入120ml85%的磷酸，用水稀釋至1升。器材：（1） 可見光分光光度計（2） 旋渦混合器（3） 試管16支紫外吸收法：1?試劑:標準蛋白質溶液，用牛血清清蛋白（BSA）,配制成1.Omg/ml和0.lmg/ml的標準蛋白質溶液。2.器材：（1） 紫外分光光度計（2） 旋渦混合器（3） 試管11支四、實驗步驟（-）.考馬斯亮藍法：標準方法（1） 取16支試管，1支作空白，3支留作未知樣品，其余試管分為兩組按表1中順序，分別加入樣品、水和試劑，即用1.Omg/m1的標準蛋白質溶液給各試管分別加入：0、0.01、0.02、0.04、0.06、0.08、0.1ml,然后用無離子水補充到0.1mlo最后各試管中分別加入5.Oml考馬斯亮藍G—250試劑，每加完一管，立即在旋渦混合器上混合。未知樣品的加樣量見表1中的第8、9、10管。（2） 加完試劑2~5分鐘后，開始用比色皿，在分光光度計上測定各樣品在595nm處的光吸收值A595,空白對照為第1號試管,即0.lmlH20加5.OmlG—250試劑。（3） 用標準蛋白質量（皿）為橫座標，用吸光度值A%,為縱座標，作圖，即得到一條標準曲線。由此標準曲線，根據測出的未知樣品的冬95值，即可查出未知樣品的蛋白質含量。微量法當樣品中蛋白質濃度較稀時（10-100^/ml），可將取樣量（包括補加的水）加大到0.5ml或1.Oml,空白對照則分別為0.5m1或1.Oml壓0,考馬斯亮藍G-250試劑仍加5.Oml,同時作相應的標準曲線，測定595nm的光吸收值。（-）紫外吸收法（1） 取6?11支試管，1支作空白，其余試管按表2.3.4中劑量，分別加入樣品和水。加完后，在旋渦混合器上混合。（2） 加完試劑2?5分鐘后，開始用比色皿，在分光光度計上測定各樣品在表中指定波長處的光吸收值，空白對照為第1號試管，即純水。（3） 用標準蛋白質量（心）為橫座標，用吸光度值為縱座標，作圖，即得到一條標準曲線。該方法不要求測未知。加量步驟，在1到6號試管中依次加入標準蛋白(lmg/mL)體積0.0、0.4、0.6、0.8、1.2、1.6、2.0ml,7號試管中加入2.OmL待測蛋白溶液,再加入去離子水將體積補充至2.0mlo操作流程圖如下：取試管，標號按表格依次加入蛋白質，水和考馬斯亮藍(紫外吸收法不用)測定所需的分光光度值六、實驗結果：數據及處理(_).考馬斯亮藍微量法：標準數據表記錄表1考馬斯亮藍法常量法數據(加樣單位：ml)管號 12345 6 7 8 9 10標準蛋白質/mL(0.1mg/ml)00.10.20.40.60.81.0未知蛋白質(mL)0.050.10.2蒸餡水(mL)1.00.90.80.60.40.200.950.90.8蛋白質濃度(mg/mL)00.010.020.040.060.080.10考馬斯亮藍G-250試劑(M)333333333每管中的蛋白質質量(昭)01020406080100光吸收值J)0.000.0520.0930.1700.2190.2640.3230.1360.2380.3290.000.0620.1140.1590.2400.2560.3180.1310.2340.317平均值“595)0.000.0570.1040.1650.2300.2600.3210.1340.2360.323數據處理與圖像擬合根據表中的兩組標準蛋白吸光度的平均值進行二次曲線擬和，得到標準曲線如下(/?2二0.9933)：標準蛋白■光度吸收關系圖(S6S<旦堅密呆0.1340.250.4470.5620.344y=-0.065x2+0.614x+0.006RJ0.9980.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2標準蛋白濃度(mg/mL)將未知蛋白的吸光度代入計算，分別得到8、9、10組的蛋白質濃度，依次為：C]=0.032mg/mL。2=0.065mg/mLC3=0.108mg/mL根據稀釋的倍數，可得到待測蛋白的濃度依次如下：G=0.032+0.05=0.64mg/mLC2=0.0654-0.1=0.65mg/mLG=0.1084-0.2=0.54mg/mL綜上數據，排除第二組取前兩組數據平均可得：C=(0.64+0.65)4-2=0.645mg/ml(-)紫外吸收法1.280nm法數據記錄表2 280nm法的實驗數據(加樣單位：ml)管號 1234567標準蛋白質(1.Omg/ml)00.40.81.21.62.00未知蛋白質(mL)2.0蒸葡水(mL)2.01.61.20.80.400

管中的蛋白濃度(mg/mL)00.20.40.60.81.0光吸收值(心)00.1300.2510.3630.4460.5550.30800.1380.2480.3240.4480.5690.311平均光吸收值(血)00.1340.2500.3440.4470.5620.3102.數據處理與圖像擬合得到的標準曲線如下(R2=0.9984)：標準蛋白-紫外光度吸收關系圖(。82)迫嘗嘗果0.5620.250.4470.1340.20.40.3440.6y=-0.065x2(。82)迫嘗嘗果0.5620.250.4470.1340.20.40.3440.6y=-0.065x2+0.614x+0.006RJ0.9980.8標準蛋白濃度(mg/mL)由圖可知：紫外吸收法中吸收的光度值與蛋白濃度成二次曲線關系，其相關度R2=0.9984o由待測蛋白的A280=0.310可知：°待測蛋白=0.57mg/凡七、實驗結論與分析運用考馬斯亮藍法，將待測蛋白質與染料相結合，從而溶液的顏色由棕黑色變為藍色，最大吸收峰也發生變化，顏色的深淺和吸收峰的強度與蛋白質的濃度存在一個正相關的關系，通過測定吸收峰的強度即可定量的對比和估計蛋白質的濃度，直接觀察顏色的深淺也可粗略地估計蛋白質的濃度。在相同的實驗條件下,以己知的標準蛋白作參考，通過對比其最強吸收峰的強度即可得出待測蛋白溶液的濃度所處在的范圍，可以粗略估計待測蛋白的濃度；而將標準蛋白的濃度與吸收峰強度之間的關系進行線性擬合后即可定量的計算待測蛋白質的濃度，本實驗中采用二項指數近似，在R2要求不高于0.9933的情況下，可以計算得到待測蛋白的濃度為0.645mg/mLo運用紫外吸收法時我們采用了相同的方法，只是檢測的指標改為280nm波長的吸收值，結果得到待測蛋白的濃度為0.5mg/mL。由于第三組數據與前兩組差距較大，故平均時排除了誤差組，其實驗測量的相關度可以達到&2=0.9984。兩個實驗同時證明，運用蛋白質濃度的不同而引起的其它物理參數的變化可以逆向來探討蛋白液的濃度，考馬斯亮藍法和紫外吸收法都是精度較高的測量蛋白質濃度的方法，其可信度R2都大于0.99o八、思考題解答用考馬斯亮蘭法G-250測定蛋白質含量有何特點，操作過程中應注意什么？Bradford法的突出優點是：（1） 靈敏度高，其最低蛋白質檢測量可達1咫。這是因為蛋白質與染料結合后產生的顏色變化很大，蛋白質一染料復合物有更高的消光系數。（2） 測定快速、簡便，只需加一種試劑。完成一個樣品的測定，只需要5分鐘左右。由于染料與蛋白質結合的過程，大約只要2分鐘即可完成，其顏色可以在1小時內保持穩定，且在5分鐘至20分鐘之間，顏色的穩定性最好。（3） 干擾物質少。如K\Na\Mg?離子、Tris緩沖液、糖和蔗糖、甘油、筑基乙醇、EDTA等均不干擾此測定法。此法的缺點是：（1） 由于各種蛋白質中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此Bradford法用于不同蛋白質測定時有較大的偏差，在制作標準曲線時通常選用y—球蛋白為標準蛋白質，以減少這方面的偏差。（2） 仍有一些物質干擾此法的測定，主要的干擾物質有：去污劑、TritonX-100.十二烷基硫酸鈉（SDS）和0.1N的NaOH。（3） 標準曲線也有輕微的非線性，因而不能用Beer定律進行計算，而只能用標準曲線來測定未知蛋白質的濃度。操作過程中應該注意：不可使用石英比色皿（因不易洗去染色），可用塑料或玻璃比色皿，使用后立即用少量95%的乙醇蕩洗，以洗去染色。塑料比色皿決不可用乙醇或丙酮長時間浸泡。并且，加樣、混合和測定之間的時間最好不要太長.考馬斯亮蘭G-250和R-250各有何特點，在電泳染色方面有何異同？（詳見講義參考文獻12.）考馬斯亮藍R-250即三苯基甲烷，每個分子含有兩個S03基團，偏酸性，和氨基黑一樣也是結合在蛋白質的堿性基團上。在一定pH時，這種染料一蛋白復合物被完全解聚。考瑪斯亮藍R-250與不同蛋白結合呈現基本相同的顏色，并且在比較寬的范圍內，掃描峰的面積與蛋白量有線性關系。考馬斯亮藍R250