淺論亞硒酸鈉對人結腸癌細胞的抑制機制【摘要】目的：研究亞硒酸鈉對人結腸癌細胞的抑制機制。方法：通過DNA末端原位標記染色法檢測亞硒酸鈉溶液對人結腸癌細胞株SW111C凋亡的影響；應用免疫組織化學染色技術觀察亞硒酸鈉對人結腸癌細胞株SW111Cp16，p21，PCNA，CD44基因表達的影響；并測定亞硒酸鈉對小鼠T淋巴細胞亞群的影響。結果：TUNEL染色法表明亞硒酸鈉作用細胞后凋亡指數明顯升高(),且具有劑量-效應關系；亞硒酸鈉作用后人結腸癌細胞SW111Cp16和p21基因的蛋白表達上調，PCNA和CD44基因的蛋白表達下調；亞硒酸鈉能使小鼠CD3+，CD4+細胞數增加，而且CD4+/CD8+比值升高，與對照組比較差異有統計學意義。結論：亞硒酸鈉可通過誘導細胞凋亡，影響p16，p21，PCNA，CD44基因表達和提高機體的免疫功能而抑制SW111C的生長。

【關鍵詞】亞硒酸鈉；SW111C細胞；凋亡；p16；p21；PCNA；CD44；T淋巴細胞亞群

［Abstract］Objective:ToinvestigatetheinhibitionmechanismofsodiumseleniteonSW111Ccells.Methods：TheapoptosisofSW111Ccellstreatedwithsodiumselenitewasobservedexpressionofp16,p21,PCNA,CD44treatedwithsodiumselenitewasperformedbyimmunohistochemistrytechnique.TheTlymphocytesubsetsweredetectedbyanimalexperiment.Results：TheapoptoticindexofSW111Ccellsincreasedandwaspositivelycorrelatedtotheconcentrationofsodiumselenite().Theexpressionofp16andp21wasupregulatedandtheexpressionofPCNAandCD44wasdownregulatedaftertreatedbysodiumexposuretosodiumselenite,thenumberofCD3+andCD4+cellsinmiceincreasedandCD4+/CD8+increasedtoo.Conclusion：ThesodiumselenitecouldinhibittheproliferationofSW111Ccellsbyinducingcellapoptosis,andinfluencetheexpressionofp16,p21,PCNA,CD44withimprovingimmunefunction.

［Keywords］sodiumselenite;SW111Ccells;apoptosis;p16;p21;PCNA;CD44;Tlymphocytesubsets

大量流行病學調查、動物實驗及臨床實驗研究結果表明微量元素硒與結腸癌的發生率和死亡率呈負相關，外源性補硒能有效抑制多種人類腫瘤的發生與發展［1］。本實驗以人結腸癌細胞株SW111C為研究對象，應用DNA末端原位標記染色法檢測亞硒酸鈉溶液對人結腸癌細胞株SW111C凋亡的影響，應用免疫組織化學染色技術觀察亞硒酸鈉對人結腸癌細胞株SW111Cp16,p21,PCNA,CD44基因表達的影響，并測定亞硒酸鈉對小鼠T淋巴細胞亞群的影響，旨在探討亞硒酸鈉在結腸腫瘤預防和治療過程中潛在的應用價值，為深入研究硒與腫瘤的關系提供資料。

1材料與方法

材料及動物

SW111C細胞株購自吉林省腫瘤研究所；小鼠購自吉林省生物制品所；亞硒酸鈉為沈陽市試劑五廠生產；1640培養液購自Life,Technogies公司；胎牛血清、胰蛋白酶購自北京鼎國生物技術發展中心；細胞凋亡原位檢測試劑盒購自深圳晶美公司；鼠抗人p16,p21,PCNA,CD44單克隆抗體，免疫組化SAP即用型試劑盒，磷酸酶底物BCIP/NBT顯色濃縮液，多聚賴氨酸，ClerMount封片劑均購自北京中山生物技術有限公司；小鼠T細胞亞群檢測試劑盒購自北京邦定醫學生物公司。

實驗方法

DNA末端原位標記染色法［2］檢測細胞凋亡

取對數生長期結腸癌細胞5×104/ml培養24h，加入終濃度為20,10和5μmol/L的亞硒酸鈉，對照組不加亞硒酸鈉。細胞培養24h終止培養，收集細胞并涂片，4%低聚甲醛固定30min，mol/LPBS緩沖液洗滌3次，每次5min，預冷%TritonX100處理，4℃2min，PBS洗滌。以下步驟按試劑盒說明進行。凋亡指數計算方法：數5個高倍鏡1000個細胞,分別計數凋亡細胞和總細胞數,AI=凋亡細胞數/總細胞數×100%。

免疫組化法測定p16,p21,PCNA,CD44基因表達

p16,p21,PCNA,CD44基因檢測采用鏈霉素卵白素-生物素免疫組化技術，操作按說明書進行，PBS代替第一抗體作陰性對照。

亞硒酸鈉溶液對小鼠T淋巴細胞亞群的影響

小鼠稱重并隨機分組，分為亞硒酸鈉低、中、高3個實驗組及對照組，每組8只。飼養40天后斷頭取血涂片，用小鼠T細胞亞群檢測試劑盒檢測。細胞涂片標本室溫干燥2h以上，滴固定液1滴，固定1～2min后PBS洗。加抗T淋巴細胞亞群單克隆抗體15μl，放濕盒37℃30min，加羊抗鼠IgG二抗15μl，37℃30min，加APAAP復合物15μl，37℃30min，加堿性磷酸酶底物顯色液25μl，37℃30min，用自來水沖洗終止顯色，加蘇木素復染液1滴作用1min，自來水沖洗，光學顯微鏡觀察并計數。

統計學處理

各組實驗數據用±s表示，采用軟件進行單因素方差分析，組間比較用q檢驗，為差異有統計學意義。

2結果

亞硒酸鈉誘導后SW111C細胞凋亡指數

TUNEL檢測結果顯示亞硒酸鈉終濃度在10μmol/L以上時可誘導SW111C細胞凋亡，其作用具有劑量-效應關系。5μmol/L組%與對照組%相比,；20μmol/L組%,10μmol/L組%與對照組相比,，且20μmol/L組高于10μmol/L組。

亞硒酸鈉作用后SW111C細胞p16,p21,CD44,PCNA基因表達

p16,p21基因表達

亞硒酸鈉作用于SW111C細胞24h后,與空白對照組相比p16,p21基因表達增強，表現為陽性細胞數增多及染色強度增強，見圖1，圖2。

CD44,PCNA基因表達

亞硒酸鈉作用于SW111C細胞24h后,與空白對照組相比CD44,PCNA基因表達降低，表現為陽性細胞數減少及染色強度減弱，見圖3，圖4。

亞硒酸鈉溶液作用后小鼠T細胞亞群檢測結果

T細胞亞群檢測結果顯示亞硒酸鈉溶液作用后小鼠CD3＋,CD4＋細胞數增加，而且CD4＋/CD8＋比值升高，與對照組比較差異有統計學意義,結果見表1。表1不同濃度亞硒酸鈉作用后小鼠T淋巴細胞亞群檢測結果

3討論

硒是人體必需的微量元素，具有抗腫瘤作用,并可影響癌基因與抑癌基因的表達，與惡性腫瘤間存在明顯的負相關關系［3］，腸癌的發生與癌基因和抑癌基因異常表達有一定的相關性。p16基因是人們發現的第一個直接作用于細胞周期抑制細胞分裂的抑癌基因，阻止細胞由G1期進入S期，從而使細胞增殖停止。p16基因的任何缺失和突變都可使細胞異常增殖而發生腫瘤。陳萍等［4］的研究表明p16基因缺失可能是非小細胞肺癌發生的早期始動環節，檢測相關標本中p16基因缺失對肺癌的早期診斷有重要意義。p21/WAF1是野生型p53的激活片段，是重要的細胞周期抑制蛋白，通過阻止細胞周期進程和促進細胞分化負責對細胞周期進行調控，當DNA損傷時，p53上升通過β轉錄生長因子方式誘導p21/WAF1產生，導致細胞G1期阻滯和凋亡［5］。增殖細胞核抗原(PCNA)是DNA聚合酶輔助因子，細胞增殖信號必須通過PCNA參與才能引發DNA合成。PCNA在許多腫瘤組織中呈高表達，且與腫瘤的惡性程度呈正相關，是細胞活躍分裂的指標［6］。CD44為細胞表面黏附分子，又稱P糖蛋白，在多種細胞表面表達，介導細胞與細胞、細胞與基質之間的相互作用，其表達程度直接影響癌細胞的脫離和再附著，參與腫瘤細胞的增生和轉移。腫瘤的轉移每個環節均有CD44高表達，有助于腫瘤細胞的黏附和轉移［7］。本研究結果表明：亞硒酸鈉可使p21及p16基因表達增強、PCNA及CD44基因表達降低。PCNA基因減少，細胞DNA合成減少，進一步使腫瘤細胞增殖受阻或減慢。

文獻報道亞硒酸鈉可誘導胃癌SGC7901細胞凋亡［8］。本實驗結果表明亞硒酸鈉可誘導SW111C細胞凋亡，且該作用與亞硒酸鈉濃度有關，表現為較小劑量時無此作用，較大劑量時可誘導細胞凋亡，具有劑量-效應關系。

T淋巴細胞是構成機體抗腫瘤免疫防御系統的重要因素，包括CD3＋,CD4＋,CD8＋細胞亞群。多種惡性腫瘤患者伴有T淋巴細胞亞群異常和CD4＋/CD8＋比值失調［9］。本實驗結果顯示補硒組小鼠CD3＋,CD4＋細胞數升高，且CD4＋/CD8＋比值上升。小鼠T亞群細胞數及比例改變必引起免疫功能改變，CD3＋,CD4＋和CD8＋淋巴細胞是具有免疫活性的細胞，這些細胞的活性上升，可以導致機體對外來抗原的識別和清除功能上升，表明亞硒酸鈉可以通過激發機體免疫系統而在抑制腫瘤生長過程中發揮作用。

【參考文獻】

［1］RedmanC,ScottJA,BainesAT,etal.Inhibitoryeffectofselenomethionineonthegrowthofthreeselectedhumantumorcelllines［J］.CancerLett,1998,125:103-110.

［2］譚繼宏，涂水平，蔣曉華，等.氧化砷誘導胃癌細胞凋亡的實驗研究［J］.中華消化雜志，2000，20：37-39.

［3］俸家富，李少林.硒、硒蛋白和硒的抗癌機理［J］.微量元素與健康研究，2001，18：70-72.

［4］陳萍，李堅，殷凱生，等.非小細胞肺癌p16基因缺失的研究［J］.江蘇大學學報:醫學版，2004，14：106-109.

［5］KolarZ,MurrayG,ScottK,etal.RelationofBcl2expressiontoandrogenreceptor,P21WAF1/CIP,andcycliD1statusinprostatecancer［J］.ClinPathol,2000,53(1):15-18.

［6］莊小強，林三仁，鄭杰，等.胃黏膜病變與cmet原癌基因表達的關系及預后意義［J］.中華消化雜志，2001，21，116-118.

［7］孫宜，侍慶.卵巢癌中p53基因突變和粘附分子CD44V6的表達［J］.中國癌癥雜志，2001，1：19-20.

［8］