淺論一種人硫氧還蛋白基因修飾肝細(xì)胞的制備【摘要】【目的】制備出一種人硫氧還蛋白(hTrx)基因修飾的肝細(xì)胞。【方法】逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)法擴(kuò)增出hTrxcDNA，應(yīng)用重組逆轉(zhuǎn)錄病毒制備hTrx基因修飾大鼠肝細(xì)胞。白蛋白免疫組化SABC法進(jìn)行肝細(xì)胞活性鑒定，MTT比色試驗進(jìn)行抗氧化應(yīng)激能力檢測。【結(jié)果】克隆出hTrx開放閱讀框cDNA并制備出重組逆轉(zhuǎn)錄病毒，感染真核細(xì)胞后可分泌融合表達(dá)的hTrx并具有生物學(xué)活性。制備出hTrx基因修飾大鼠肝細(xì)胞，免疫組化SABC法顯示肝細(xì)胞功能正常，MTT比色法檢測具有較強的抗氧化應(yīng)激能力(P)，并可有效增殖。【結(jié)論】成功制備出一種具有較強抗氧化應(yīng)激的hTrx基因修飾肝細(xì)胞。

【關(guān)鍵詞】肝細(xì)胞;人硫氧還蛋白;基因修飾

Abstract：【Objective】Topreparethehumanthioredoxin(hTrx)gene-modifiedhepatocytes.【Methods】hTrxcDNAwasamplifiedbyreversetranscription-polymerasechainreaction(RT-PCR)，recombinantretroviruswasappliedtoprimaryculturedrathepatocyteforinfectiontogeneratehTrxgene-modifiedrathepatocytes，whoseviabilityandantioxidativecapacitywereexaminedwithalbumin-immunohistochemicalstainingandMTTassay，respectively.【Results】ThehTrxopenreadingframescDNAwasclonedandassembledwithrecombinantretrovirus，theneukaryoticcellsinfectedbythisviruswerecapableofexpressingbioactivehTrxintheformoffusionproteins.ImmunohistochemistrydemonstratednormalfunctionofthehTrxgene-modifiedhepatocytes，whichpossessedstrongantioxidativecapacityasshownbyMTTassayandcouldbeproliferatedeffectively.【Conclusion】ThehTrxgene-modifiedhepatocytewithmorestrongerantioxidativecapacityisprepared.

人硫氧還蛋白(humanthioredoxin，hTrx)是目前已知Trx中活性最好的蛋白，由TrX構(gòu)成的氧化還原系統(tǒng)廣泛存在于組織細(xì)胞中，具有清除自由基和維持體內(nèi)穩(wěn)定的氧化還原狀態(tài)的重要作用，對缺血再灌注損傷有明確的保護(hù)作用。Trx也可通過對轉(zhuǎn)錄因子如NF-κB等的調(diào)節(jié)作用，促進(jìn)細(xì)胞的增殖及抑制細(xì)胞的凋亡等[1-2]。研究發(fā)現(xiàn)Trx對肝細(xì)胞生存生長具有明顯的促進(jìn)作用，同時其抗氧化和凋亡抑制作用，因此可在肝細(xì)胞移植和生物人工肝細(xì)胞保存方面發(fā)揮重要作用。但能否持久地促進(jìn)肝細(xì)胞的增殖，減少凋亡和氧化應(yīng)激成為Trx應(yīng)用的關(guān)鍵。本實驗成功進(jìn)行了hTrx基因修飾肝細(xì)胞的制備，修飾后的肝細(xì)胞表現(xiàn)出較強的抗氧化應(yīng)激能力，可緩解細(xì)胞損傷等。

1材料和方法

hTrxcDNA基因克隆

根據(jù)GenBank中hTrxcDNA序列(J04026)設(shè)計引物，引入BglⅡ、BamHⅠ酶切位點，并加入對框序列TT(不含終止子TAA)。引物：正向5′-GCAGATCTATGGTGAAGCAGATCGAGAG-3′，反向5′-GCGGATCCTTGACTAATTCATTAATGGTGGCTTC-3′。異硫氰酸胍一步法從143(TK-)人骨肉瘤細(xì)胞中提取模板RNA。應(yīng)用錨定引物oligo(dT)15逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一條鏈，聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增hTrxcDNA基因，插入載體質(zhì)粒pGEM-TEasy構(gòu)建重組質(zhì)粒pGEM/hTrx，并進(jìn)行基因序列測定。質(zhì)粒的制備、純化、酶切、連接及轉(zhuǎn)化按常規(guī)方法進(jìn)行。

含hTrx基因的重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的構(gòu)建

大量制備逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pLEGFP-N1(購自Clontech公司)，將其和pGEM/hTrx分別行BglⅡ、BamHⅠ聯(lián)合酶切、回收、連接。篩選鑒定含hTrx基因的重組質(zhì)粒pLEGFP/hTrx。

重組逆轉(zhuǎn)錄病毒的制備

運用磷酸鈣共沉淀轉(zhuǎn)染法進(jìn)行重組逆轉(zhuǎn)錄病毒的制備。取pLEGFP/hTrx，電泳定量約1g/L。加入mol/LCaCl2，加至復(fù)蘇的PA317細(xì)胞(胚胎成纖維細(xì)胞)表面，可見細(xì)密沉淀鈣粒形成。37℃下CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)8h，加入含100mL/L小牛血清的DMEM培養(yǎng)液，置37℃培養(yǎng)箱內(nèi)72h。g/L胰酶消化后按1：3傳代，質(zhì)量濃度為400μg/mL的G418(一種氨基糖苷類抗生素)篩選高表達(dá)細(xì)胞株。14d時有多個抗性克隆形成，細(xì)胞克隆單瓶培養(yǎng)至抗性細(xì)胞形成單層，消化傳代后，加入DMEM培養(yǎng)液(不含G418)培養(yǎng);收集細(xì)胞上清液進(jìn)行病毒濃縮純化。加入預(yù)冷飽和硫酸銨，透析純化濃縮，經(jīng)μm微孔濾膜除菌處理。

重組逆轉(zhuǎn)錄病毒滴度測定

復(fù)蘇NIH3T3細(xì)胞(小鼠胚胎成纖維樣細(xì)胞)，鋪滿培養(yǎng)瓶后，g/L胰酶消化，培養(yǎng)接種于24孔培養(yǎng)板。將制備的多組病毒液均相應(yīng)作104、105和106倍稀釋接種在細(xì)胞表面;37℃，5%體積分?jǐn)?shù)CO2條件下培養(yǎng)72h，熒光顯微鏡下觀察每孔含熒光的細(xì)胞數(shù)，計算病毒滴度，選擇最高滴度的病毒液為實驗用重組病毒。重組質(zhì)粒含EGFP，與目的基因表達(dá)的蛋白融合，熒光顯微鏡下顯現(xiàn)綠色熒光，較好地反映重組逆轉(zhuǎn)錄病毒的形成情況及感染活性。

重組逆轉(zhuǎn)錄病毒感染細(xì)胞后hTrx表達(dá)和活性測定

用胰島素還原實驗進(jìn)行重組逆轉(zhuǎn)錄病毒感染細(xì)胞后hTrx表達(dá)和活性測定。取重組逆轉(zhuǎn)錄病毒液，接種于NIH3T3細(xì)胞表面。37℃，5%體積分?jǐn)?shù)CO2條件培養(yǎng)后取上清液，取不同體積(25μL、50μL、100μL)上述標(biāo)本，加入實驗用Buffer，30℃反應(yīng)，檢測波長為650nm時的吸光度。另取空質(zhì)粒pLEGFP-N1、DMEM培養(yǎng)基制備對照組，本實驗前期制備的hTrx作為標(biāo)準(zhǔn)品陽性對照(1μmol/L，μmol/L，10μmol/L)。比較各組酶反應(yīng)速度(某一濃度的酶在達(dá)到最大吸光度值時與所用最小時間之間的比值，用以反映該酶反應(yīng)的活性)。

hTrx基因修飾大鼠肝細(xì)胞的制備

原代SD大鼠肝細(xì)胞的培養(yǎng)方法同前所述。將分離的大鼠肝細(xì)胞按1×106細(xì)胞/mL接種于涂有多聚賴氨酸培養(yǎng)瓶中，加入含100mL/L小牛血清DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，加入重組逆轉(zhuǎn)錄病毒原液及8μg/mLpolybrene(凝聚胺)作用3h;重復(fù)感染一次，繼續(xù)培養(yǎng)48h，至培養(yǎng)肝細(xì)胞80%成片，以400μg/mLG418篩選肝細(xì)胞抗性克隆并生長穩(wěn)定成片，熒光顯微鏡下觀察肝細(xì)胞中熒光蛋白表達(dá)情況。空質(zhì)粒pLEGFP-N1制備的逆轉(zhuǎn)錄病毒制備對照組肝細(xì)胞。

hTrx基因修飾大鼠肝細(xì)胞活性鑒定

白蛋白免疫組化SABC法進(jìn)行肝細(xì)胞活性鑒定。將制備的病毒感染肝細(xì)胞以g/L胰酶消化后接種于蓋玻片上，37℃，5%體積分?jǐn)?shù)CO2培養(yǎng)4h使細(xì)胞貼壁緊密，丙酮固定。一抗兔抗鼠白蛋白單克隆抗體(1∶200)，二抗生物素化HRP-山羊抗兔單克隆抗體IgG(1∶4000)。DAB顯色，以細(xì)胞漿內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性染色。正常大鼠原代培養(yǎng)肝細(xì)胞作為陽性對照。

hTrx基因修飾大鼠肝細(xì)胞抗氧化應(yīng)激能力檢測

MTT比色試驗進(jìn)行抗氧化應(yīng)激能力檢測。將肝細(xì)胞(hTrx基因修飾大鼠肝細(xì)胞、空質(zhì)粒pLEGFP-N1轉(zhuǎn)染病毒感染肝細(xì)胞及正常大鼠肝細(xì)胞)制成單細(xì)胞懸液，以每孔100μL，細(xì)胞數(shù)104接種于96孔培養(yǎng)板上，培養(yǎng)至細(xì)胞80%成片，加入實驗濃度為200μmol/LH2O2作用12h、24h和48h，每孔加入新鮮配制的MTT(g·L-1)25μL作用4h，待出現(xiàn)藍(lán)色結(jié)晶后，加入二甲基亞砜(DMSO)150μL，震蕩使其溶解，570nm波長下測定各組不同時間吸光度值，繪制生長曲線。

統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS統(tǒng)計軟件包處理，組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，率的比較為?字2檢驗。

2結(jié)果

克隆基因的序列

克隆上的hTrx開放閱讀框cDNA基因序列為315bp(含起始子ATG、不含終止子TAA)，推導(dǎo)氨基酸數(shù)104個(不含起始子ATG編碼的Met)。另外可見BglⅡ、BamHⅠ識別位點及對框堿基TT。與已知序列比對2個堿基發(fā)生改變：第117位C→G、第221位C→T，這可能由于模板來源不同所致，其它堿基完全一致。推導(dǎo)的氨基酸序列，第39位Asn→Lys，第74位Thr→Met，存在活性位點保守序列—Trp—Cys32—Gly—Pro—Cys35—Lys—，以及其外側(cè)3個半胱氨酸Cys殘基Cys62，Cys69和Cys73。

pLEGFP/hTrx的篩選

重組質(zhì)粒經(jīng)BamHⅠ單酶切后，1%瓊脂糖凝膠電泳見7172bp處有一光亮帶;BglⅡ、BamHⅠ雙酶切后在323bp、6849bp處各有一光亮帶，與理論值完全一致，確定為pLEGFP/hTrx重組載體質(zhì)粒(圖1)。

重組逆轉(zhuǎn)錄病毒滴度

本實驗最高病毒滴度為×106感染數(shù)/mL，選擇該組進(jìn)行擴(kuò)增生產(chǎn)重組逆轉(zhuǎn)錄病毒，進(jìn)行后續(xù)實驗。

重組逆轉(zhuǎn)錄病毒感染細(xì)胞后hTrx表達(dá)和活性

重組病毒組、空質(zhì)粒病毒組及無病毒組之間酶反應(yīng)活性的比較見表1，可見在各個反應(yīng)劑量重組病毒組酶反應(yīng)速度均遠(yuǎn)高于空質(zhì)粒病毒組和無病毒組(P=)，顯示有較高的酶反應(yīng)活性，并有一定的劑量依賴性。該結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)品組實驗結(jié)果相似。提示本實驗制備的重組病毒感染真核細(xì)胞后，細(xì)胞可分泌融合表達(dá)的hTrx并具有硫氧還蛋白生物學(xué)活性。

hTrx基因修飾大鼠肝細(xì)胞的制備和活性

實驗制備的hTrx基因修飾大鼠肝細(xì)胞有EGFP綠色熒光蛋白表達(dá)。免疫組化SABC法檢測可見細(xì)胞漿內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒的陽性染色，表明hTrx基因修飾大鼠肝細(xì)胞可分泌表達(dá)白蛋白，細(xì)胞功能正常(圖2)。

hTrx基因修飾大鼠肝細(xì)胞抗氧化應(yīng)激能力

hTrx作為一種抗氧化劑，具有較強的抗氧化應(yīng)激能力。打擊實驗中，MTT比色法檢測在12h和24h時，hTrx基因修飾組與空病毒組、正常肝細(xì)胞組D(650nm)值比較有統(tǒng)計學(xué)意義(P=)，48h時差異有明顯統(tǒng)計學(xué)差異(P=)，而后兩組在任何時間段差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P=，表1)。顯示出hTrx基因修飾大鼠肝細(xì)胞具有較強的抗氧化應(yīng)激能力，并可有效增殖，表明hTrx具有明確的肝細(xì)胞保護(hù)作用。各組生長曲線之間的比較見圖3。

3討論

肝細(xì)胞移植技術(shù)已具有較為完備的實驗及理論基礎(chǔ)，可以治療多種肝相關(guān)疾病，但尚有許多問題有待進(jìn)一步解決，包括增殖、免疫、養(yǎng)營等。成熟肝細(xì)胞為終末分化細(xì)胞，分裂增殖能力較差，也不能冷凍保存，移植后增殖緩慢及增殖能力受限。由于移植肝細(xì)胞數(shù)量的限制以及很難得到滿意的增殖，肝功能支持的時間及受損肝實質(zhì)的替代的程度不甚理想，有研究顯示其替代作用一般不超過受體肝臟功能的1%，提高移植肝細(xì)胞的增殖指數(shù)、防止過多凋亡及氧化應(yīng)激成為需要重點解決的關(guān)鍵問題之一。促進(jìn)干細(xì)胞向成熟肝細(xì)胞定向轉(zhuǎn)化的研究尚需完善，對成熟肝細(xì)胞的改造仍有現(xiàn)實的意義。

hTrx在細(xì)胞生存和生長中具有極重要的作用，它的生物學(xué)功能包括促進(jìn)細(xì)胞DNA和蛋白質(zhì)合成、生長因子樣作用、抗氧化作用、轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)以及凋亡抑制作用等。我們前期制備出具有生物學(xué)活性的rhTrx對原代培養(yǎng)肝細(xì)胞的生存生長也顯示出具有促進(jìn)作用。外源性hTrx在體內(nèi)實驗中局部應(yīng)用較難進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部，很快代謝使其作用不夠持久。本實驗將目的基因?qū)腚x體肝細(xì)胞，從而達(dá)到在體內(nèi)長期表達(dá)的目的。

目前已有多個實驗對肝細(xì)胞進(jìn)行體外基因修飾，主要在于增強移植肝細(xì)胞的增殖與功能，降低移植后的排斥反應(yīng)和逆轉(zhuǎn)肝纖維化等。在提高增殖方面，有研究將外源性基因片段整合入肝細(xì)胞DNA中，成為所謂“永生化細(xì)胞”，并能夠加以人為控制[7-8];敲除與抑制細(xì)胞增殖密切相關(guān)基因的小鼠肝細(xì)胞，移植后細(xì)胞增殖數(shù)量明顯增加;將血管內(nèi)皮生長因子(vascularendothelialgrowthfactor，VEGF)、Bcl-2、肝細(xì)胞生長因子(hepatocytegrowthfactor，HGF)等基因?qū)牍w肝細(xì)胞后移植，肝細(xì)胞的存活和再生增加，抗凋亡能力明顯增強[10-13]。本實驗制備出hTrx基因修飾肝細(xì)胞表現(xiàn)出較強的抗氧化應(yīng)激能力，可緩解細(xì)胞損傷并可有效增殖，也進(jìn)一步表明hTrx具有明確的肝細(xì)胞保護(hù)和促進(jìn)增值作用。這種hTrx基因修飾肝細(xì)胞可在肝細(xì)胞移植和生物人工肝細(xì)胞保存方面發(fā)揮重要作用。

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