實驗三_藥物敏感試驗和消毒滅菌詳解演示文稿當前第1頁\共有23頁\編于星期三\22點（優選）實驗三_藥物敏感試驗和消毒滅菌當前第2頁\共有23頁\編于星期三\22點3一、藥敏試驗在感染性疾病防治中的意義

近年來，由于各種抗菌藥物的廣泛應用，導致耐藥菌株的迅速增多。尤其是廣譜及超廣譜抗生素的普遍使用，造成耐藥菌株大量出現，給臨床治療帶來極大的困難。同時，由于不合理的使用抗生素，治療的失敗率及不良反應均有增加。因此，藥敏試驗在感染性疾病的防治方面具有日益重要的實際意義。當前第3頁\共有23頁\編于星期三\22點4二.培養+藥敏的目的

1、確定導致感染的病原菌的種類，對于不同的病原菌（G-桿菌或G+球菌，條件致病菌或急性傳染病病原菌）需要采取不同的治療措施。

2、確定病原菌對各種抗生素的敏感性，指導臨床根據病人情況合理用藥。由于細菌耐藥性的快速增長，單純依賴經驗選用藥物經常無效，在更多的時候需要參考藥敏實驗的結果。

3、用于流行病學調查及院內感染的監控，減少耐藥菌株的流行。當前第4頁\共有23頁\編于星期三\22點5三、什么情況下需要做培養+藥敏？感染原因無法確定。病原菌的耐藥性無法確定，經驗用藥可能失敗（尤其是免疫力低下患者、長期使用抗生素者、ICU病房、院內感染患者、接受導管插入或其他創傷性治療患者。）病人對可用藥物過敏，需要檢測其他藥物的耐藥性。病人個體情況要求對某些藥物精確用藥，需要測定其最低抑菌濃度（MIC）。 當前第5頁\共有23頁\編于星期三\22點四、常用抗菌藥物敏感性試驗與耐藥檢測方法介紹其原理：體外測定抗生素藥物抑菌或殺菌的能力。可幫助臨床對感染性疾病選擇最佳用藥，還可進行流行病學調查，了解某些致病菌耐藥性變異情況。紙片擴散法（Kirby-Bauertest）稀釋法（dilutiontest）E試驗法（Etest）聯合藥物敏感試驗特殊耐藥菌及耐藥酶的表型檢測耐甲氧西林葡萄球菌（MRS）的檢測β-內酰胺酶、超廣譜β-內酰胺酶檢測等當前第6頁\共有23頁\編于星期三\22點五、紙片擴散法（K-B法）原理：含有定量抗菌藥物的紙片貼在已接種測試菌的瓊脂平板上，紙片所含的藥物吸取瓊脂中的水分溶解后便不斷向紙片周圍區域擴散，形成遞減的梯度濃度。在紙片周圍抑菌濃度范圍內的細菌生長被抑制，形成透明的抑菌圈。抑菌圈的大小反映測試菌對測定藥物的敏感程度，并與該藥對測試菌的最低抑制濃度（minimalinhibitoryconcentration，MIC）呈負相關，即抑菌圈愈大，MIC愈小。當前第7頁\共有23頁\編于星期三\22點方法：菌液制備：挑取孵育16-24h的血平板上數個菌落置于生理鹽水管中，校正濃度至0.5麥氏標準；涂布接種：無菌棉拭蘸取菌液，在試管壁旋轉擠去多余菌液后在MH瓊脂表面均勻涂布接種3次，每次旋轉平板60o，最后沿平板內緣涂抹1周；貼含藥紙片：平板在室溫下干燥3-5min，用無菌鑷子將含藥紙片緊貼于瓊脂表面，各紙片中心相距應大于24mm，紙片距平板內緣應大于15mm；孵育：35oC16-18h，量取抑菌圈直徑。當前第8頁\共有23頁\編于星期三\22點注意事項1紙片應分布均勻，中心距離不小于24mm。2含菌平板必須避免過濃或過稀。3紙片貼完后應在15min內將平板反過來，置于37度溫箱中。4紙片一旦接觸培養基就不應再挪動位置。5要注意無菌操作。當前第9頁\共有23頁\編于星期三\22點影響藥敏結果的因素培養基應根據試驗菌的營養需要進行配制。傾注平板時，厚度合適（約5-6mm），不可太薄，一般90mm直徑的培養皿，傾注培養基18-20ml為宜。培養基內應盡量避免有抗菌藥物的拮抗物質，如鈣、鎂離子能減低氨基糖苷類的抗菌活性，胸腺嘧啶核苷和對氨苯甲酸（PABA）能拮抗磺胺藥和TMP的活性。細菌接種量細菌接種量應恒定，如太多，抑菌圈變小，能產酶的菌株更可破壞藥物的抗菌活性。藥物濃度藥物的濃度和總量直接影響抑菌試驗的結果，需精確配制。商品藥應嚴格按照其推薦治療量配制。培養時間一般培養溫度和時間為37℃，8-18小時，有些抗菌藥擴散慢如多粘菌素，可將已放好抗菌藥的平板培養基，先置4℃冰箱內2~4小時，使抗菌藥預擴散，然后再放37℃溫箱中培養，可以推遲細菌的生長，而得到較大的抑菌圈。當前第10頁\共有23頁\編于星期三\22點結果判讀：用刻度尺量取抑菌圈直徑，根據CLSI（ClinicalandLaboratoryStandardsInstitute）標準判讀結果；報告：細菌對該抗生素是敏感（susceptible，S）；耐藥（resistant，R）；還是中介（intermediate，I）。當前第11頁\共有23頁\編于星期三\22點12六、如何理解MIC值及藥敏結果？

每種藥物均提供定性和定量兩種結果。定性：敏感（S）表示該藥物對該細菌有抑制或殺滅作用。使用常規劑量可以達到有效的治療效果。

中介（中度敏感，I）表示細菌對該藥物治療的敏感性低于敏感菌株，必須加大劑量以達到更高的血藥濃度才能在特定的生理部位獲得有效的臨床效力；對于使用劑量有嚴格限制的藥物則必須重復測試以確定敏感還是耐藥。

耐藥（R）表示藥物常規劑量所達到的藥物濃度不能抑制或殺死細菌，即使加大劑量也不能達到治療效果或者超過了人體的正常耐受水平。定量：MIC（最低抑菌濃度）表示在體外達到抑制細菌生長所需要的最低的藥物濃度。臨床治療要求的血藥濃度一般為MIC值（μg/ml）的4-8倍。對于不同部位的不同藥物，其濃度可能更高或更低。應具體情況具體分析，不可一概而論。

當前第12頁\共有23頁\編于星期三\22點13長期使用抗生素的病人應該怎樣做藥敏試驗？

長期使用抗生素的病人尤其是住院病人應該經常做藥敏試驗。所謂的長期，并不是一個很長的時間概念，住院病人每隔3-4天就需要做一次細菌學檢查。對于ICU病房的病人，可能每天都要做細菌學檢查。因為這些病人多數免疫力較差，容易受條件致病菌的侵犯，而且反復發作。此外病原菌常呈多重耐藥性，產超廣譜β-內酰胺酶的G-桿菌（ESBL）以及耐甲氧西林葡萄球菌（MRSA和MRSCN）、產AmpC酶的陰溝腸桿菌、銅綠假單胞菌在ICU病房最為常見。對于長期使用抗生素的病人，其感染有以下幾個特點；

1.長期使用抗生素的病人，不同時期（即使在很短的時間內）感染的病原菌種類可能不同，耐藥性因此也不相同。

2、同一株細菌，在長時間用藥時，僅需要3-4天就可以從對某種藥物敏感發展為耐藥。

3.長期使用抗生素容易誘發細菌產生L型變異。常規培養陰性時，進行L型細菌培養能夠提高檢出率。當前第13頁\共有23頁\編于星期三\22點形成條件：生物學特性：與醫學關系：細胞壁中肽聚糖結構受理化或生物因素的直接破壞或合成抑制而形成。形態多形性；染色革蘭陰性；培養高滲培養基；菌落油煎蛋樣

仍有一定致病性細菌L型－細胞壁缺陷細菌臨床分離葡萄球菌L型葡萄球菌L型回復后當前第14頁\共有23頁\編于星期三\22點15滅菌－殺滅或除去所有微生物的繁殖體和芽胞。消毒－殺滅或除去病原微生物。防腐－抑制微生物的生長與繁殖。抑菌劑或防腐劑。除菌:用沖洗、過濾等機械手段除去微生物的方法化療：用對病原菌有毒力但對機體無害的化學物質殺滅或抑制機體內病原微生物的方法消毒與滅菌技術

基本概念當前第15頁\共有23頁\編于星期三\22點擦拭法高壓蒸汽滅菌法常用消毒滅菌的方法物理法

化學法浸泡法熏蒸法噴霧法熱力消毒法生物凈化法輻射消毒法燃燒法烤箱法煮沸法干熱法濕熱法日光曝曬法紫外線燈照射法電子滅菌燈法電離輻射法當前第16頁\共有23頁\編于星期三\22點煮沸消毒法操作規程將物品刷洗干凈，全部浸沒在水中，或在水中加入碳酸氫鈉配成1％一2％的濃度，可將沸點提高到105℃．還可去污防銹。加熱煮沸。水沸后開始計時5—10min，如中途加入物品，則在第二次水沸后重新計時。關閉熱源，用無菌持物鉗取出消毒物品。當前第17頁\共有23頁\編于星期三\22點

焚燒----最徹底的滅菌方法燒灼----直接用火焰滅菌方法如接種環、試管口、三角瓶口干烤----加熱160-170℃2h

玻璃器皿、陶瓷1、干熱滅菌法紅外線----熱效應，與干烤類似滅菌效果：可殺死營養體和芽胞當前第18頁\共有23頁\編于星期三\22點2.濕熱滅菌法高壓蒸汽滅菌法（熱壓滅菌法）最有效的濕熱滅菌法121℃15-20mim（殺芽胞)煮沸消毒法水煮100℃5mim(殺繁殖體)-2h(殺芽胞)流通蒸汽消毒法巴氏消毒法間歇蒸汽滅菌法水蒸汽100℃15-30mim(殺繁殖體)反復多次流動蒸汽間歇加熱滅菌(殺芽胞）較低的溫度61℃30mim/71℃30s（殺致病菌）效果比干熱好當前第19頁\共有23頁\編于星期三\22點壓力蒸汽滅菌的效果監測

物理監測法用150℃或200℃的留點溫度計。使用前將溫度計汞柱甩至50℃以下，放入包裹內，滅菌后檢查其讀數是否達到滅菌溫度化學監測法主要是通過化學指示劑的化學反應，滅菌后呈現的顏色變化來辨別是否達到滅菌的要求。臨床常用的化學指示卡與化學指示膠帶，化學指示卡放在包的中央，化學指示膠帶粘貼在包的外面。生物監測法是最可靠的監測法，利用對熱耐受力較強的非致病性嗜熱脂肪桿菌芽孢作為指示劑，制成每片含106個嗜熱脂肪桿菌芽孢的菌紙片,使用時將10片菌紙片分別放于滅菌器四角及中央，待滅菌完畢，用無菌鑷取出后．再放人培養基內，在56℃溫箱中培養48h至1周，若全部菌紙片無細菌生長則表示滅菌合格。當前第20頁\共有23頁\編于星期三\22點消毒與滅菌技術

輻射滅菌法?非電離輻射：紫外線最佳殺菌波長為250～270nm殺菌機理：干擾DNA的復制與轉錄

特點：紫外線穿透力較弱適應范圍：紫外線消毒適用于空氣消毒與物品表面的消毒。當前第21頁\共有23頁\編于星期三\22點消毒與滅菌技術

濾過除菌法殺菌機理：含有微細小孔<0.22μm,