實驗三顯微鏡油鏡的使用及細菌形態觀察第一頁，共三十五頁，編輯于2023年，星期五一、實驗目的學習并掌握普通光學顯微鏡的構造和油鏡的使用技術及維護的基本知識（一）顯微鏡油鏡的使用第二頁，共三十五頁，編輯于2023年，星期五二、顯微鏡及油鏡使用原理顯微鏡的構造

1.光學部分目鏡、物鏡、照明裝置(聚光鏡、虹彩光圈、反光鏡等)。它使檢視物放大,生成物象。第三頁，共三十五頁，編輯于2023年，星期五2.機械部分:鏡座、鏡臂、鏡筒、物鏡轉換器、載物臺、載物臺轉移器、粗調節器、細調節器等部件.它起著支持、調節、固定等作用.第四頁，共三十五頁，編輯于2023年，星期五圖1-1-2光學顯微鏡的成像原理倒立的虛像第五頁，共三十五頁，編輯于2023年，星期五顯微鏡的放大倍數和分辨率

1.放大倍數：物鏡放大倍數×目鏡放大倍數2.

顯微鏡的分辨率:是表示顯微鏡辨析兩點之間距離的能力?？捎霉奖硎緸椋?/p>

D=λ/2n·sin(α/2)

式中D：物鏡分辨出物體兩點間的最短距離。：可見光的波長（平均0.55m)n:

物鏡和被檢標本間介質的折射率。：鏡口角（即入射角）。D值越小，分辨率越高，看到的物象越清晰第六頁，共三十五頁，編輯于2023年，星期五油鏡使用的原理油鏡，即油浸接物鏡。當光線由反光鏡通過玻片與鏡頭之間的空氣時，由于空氣與玻片的密度不同，使光線受到曲折，發生散射，降低了視野的照明度。若中間的介質是一層油（其折射率與玻片的相近），則幾乎不發生折射，增加了視野的進光量，從而使物象更加清晰。根據公式D=λ/2n·sin(α/2)，增大分母，使得D值減小，分辨率增大。第七頁，共三十五頁，編輯于2023年，星期五1.不準擅自拆卸顯微鏡的任何部件,以免損壞。2.鏡面只能用擦鏡紙擦，不能用手指或粗布，以保證光潔度3.觀察標本時，必須依次用低、中、高倍鏡，最后用油鏡。當目視接目鏡時，特別在使用油鏡時，切不可使用粗調節器，以免壓碎玻片或損傷鏡面。4.拿顯微鏡時，一定要右手拿鏡臂，左手托鏡座，不可單手拿，更不可傾斜拿。5.油鏡使用結束后，物鏡用擦鏡紙擦三遍：第一遍擦去多余的香柏油；第二遍擦鏡紙蘸上二甲苯再擦鏡頭；第三遍再用干凈的擦鏡紙擦去多余的二甲苯。6.顯微鏡應存放在陰涼用擦鏡紙擦干燥處，以免鏡片滋生霉菌而腐蝕鏡片。顯微鏡保養和使用中的注意事項第八頁，共三十五頁，編輯于2023年，星期五三.顯微鏡油鏡觀察操作方法在高倍鏡或低倍鏡下找到要觀察的樣品區域后，然后將油鏡轉到工作位置。在待觀察的樣品區域滴加香柏油，從側面注視，用粗調節器使油鏡浸在鏡油中并幾乎與標本相接。然后用細調節器調節，在目鏡下找到最合適的觀察點。

第九頁，共三十五頁，編輯于2023年，星期五油鏡使用畢后：上升鏡筒，取下載玻片，用擦鏡紙拭去鏡頭上的鏡油，然后用擦鏡紙蘸少許二甲苯（香柏油溶于二甲苯）擦去鏡頭上殘留的油跡，最后用干凈的擦鏡紙擦去殘留的二甲苯。第十頁，共三十五頁，編輯于2023年，星期五本實驗室按學號使用固定編號的顯微鏡，顯微鏡的保養由對應學號的同學負責。實驗過程中如果所用顯微鏡不能使用，自行與其他同學調節。但顯微鏡如果出現問題，由對應學號的同學承擔責任。第十一頁，共三十五頁，編輯于2023年，星期五一、實驗目的進一步熟悉使用油鏡觀察微生物的方法，初步認識細菌的基本形態和特殊結構特征（二）細菌形態的觀察第十二頁，共三十五頁，編輯于2023年，星期五二、觀察內容基本形態：桿菌，球菌（注意大小、染色性、排列）特殊結構：鞭毛，芽胞，莢膜（先找到菌體，再仔細觀察特殊結構）以畫圖的方式完成該實驗的報告第十三頁，共三十五頁，編輯于2023年，星期五桿菌（大腸桿菌，G-）畫圖注意事項：1、以圓圈表示視野2、注意菌體大小比例合適3、標出菌體顏色，顯示典型排列方式4、特殊結構標出菌體和特殊結構所在位置第十四頁，共三十五頁，編輯于2023年，星期五（三）革蘭氏染色一、實驗目的學習微生物涂片、革蘭氏染色的基本技術第十五頁，共三十五頁，編輯于2023年，星期五二、革蘭氏染色的工作原理革蘭氏染色法是細菌學中重要的鑒別染色法。有芽孢的桿菌和絕大多數球菌以及所有的放線菌和真菌都呈革蘭氏陽性反應；弧菌，螺旋體和大多數致病性的無芽孢桿菌都呈現陰性反應。第十六頁，共三十五頁，編輯于2023年，星期五根據革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌之間細胞壁的結構差異來達到染色的目的的。先用結晶紫初染，所有的細菌都被染成初染料的藍紫色；然后用碘媒染，它與結晶紫結合成結晶紫—碘復合物，從而增強了染料與細菌的結合力。然后再用乙醇脫色處理第十七頁，共三十五頁，編輯于2023年，星期五第十八頁，共三十五頁，編輯于2023年，星期五由于革蘭氏陽性菌細胞壁主要由肽聚糖形成網狀結構、壁厚、類脂質含量低，脫色時網孔收縮，結晶紫—碘不易被洗脫而保留在細胞內，復染時仍保持藍紫色。而革蘭氏陰性菌由于細胞壁的肽聚糖層較薄、類脂含量高，所以當脫色處理時類脂被乙醇溶解，細胞壁透性增大，結晶紫—碘復合物被洗脫，復染時細胞被染上復染劑的顏色（紅色）。第十九頁，共三十五頁，編輯于2023年，星期五大腸桿菌葡萄球菌第二十頁，共三十五頁，編輯于2023年，星期五三、革蘭氏染色的操作方法無菌操作涂片干燥固定染色水洗干燥鏡檢第二十一頁，共三十五頁，編輯于2023年，星期五（1）涂片：先在載玻片上滴一滴生理鹽水，再在菌平板上取一小環培養24小時的大腸桿菌和金黃色葡萄球菌菌體于生理鹽水中涂片（，分別于斜面上挑取少許菌苔于水滴中，混勻并涂成薄膜），把菌液充分涂開，使其分布均勻。注意：載玻片要潔凈無油跡；滴生理鹽水和取菌不宜過多，涂片要均勻，不可過于濃厚第二十二頁，共三十五頁，編輯于2023年，星期五載玻片水滴菌體涂片第二十三頁，共三十五頁，編輯于2023年，星期五染色前必須固定細菌，其目的是：一是殺死細菌并使菌體粘附于玻片上。二是增加其對染料的親和力。常用的有加熱和化學固定兩種方法。固定時盡量維持細胞原有的形態。第二十四頁，共三十五頁，編輯于2023年，星期五⑵干燥：把上面涂好的片于室溫下自然干燥。⑶涂面朝上，在火焰上方過幾次以熱固定菌體（此操作的目的是使得細胞質凝固，以固定細胞形態，并使之牢固附著在載玻片上）。固定時通過火焰1—2次即可。注意：不可過熱，以載玻片不燙手為宜，溫度過高會改變甚至破壞細胞形態。⑷初染：滴數滴結晶紫于菌膜上（以剛好完全覆蓋菌膜為宜）初染1--2分鐘min，水洗。⑸媒染：滴加碘液沖去殘水，并覆蓋約1min，水洗。第二十五頁，共三十五頁，編輯于2023年，星期五⑹脫色：用濾紙吸去載玻片上面的殘水，將玻片傾斜，用95％酒精滴洗至流出酒精剛剛不出現紫色時為止，約20—30s，立即用水沖凈酒精。

注意：革蘭氏染色結果是否正確，乙醇脫色是整個操作的關鍵環節，脫色不足，陰性菌被誤染成陽性菌，脫色過度，陽性菌被誤染成陰性菌。第二十六頁，共三十五頁，編輯于2023年，星期五⑺復染：用番紅液染1—2min,水洗。⑻鏡檢：干燥后（室溫下晾干），置油鏡觀察（先在低倍鏡，然后在油鏡下觀察菌體細胞的形態）。革蘭氏陰性菌呈紅色，革蘭氏陽性菌呈紫色。注意：以分散開的細菌的革蘭氏染色反應為準，過于密集的細菌，常常呈假陽性。（9）同法在一載玻片上以大腸桿菌與金黃色葡萄球菌混合制片，作革蘭氏染色對比。

第二十七頁，共三十五頁，編輯于2023年，星期五(10).實驗結果的記錄：要求在用顯微鏡觀察（左眼觀察）的同時在實驗記錄本上畫下你所觀察到的細菌的形態。第二十八頁，共三十五頁，編輯于2023年，星期五本實驗每人做一張。實驗報告中要畫圖表示結果。第二十九頁，共三十五頁，編輯于2023年，星期五思考題1.涂片為何要固定？固定加熱時間過長會怎樣2.分析影響革蘭氏染色結果的因素。第三十頁，共三十五頁，編輯于2023年，星期五一、實驗目的熟悉芽胞染色的方法（四）芽胞染色第三十一頁，共三十五頁，編輯于2023年，星期五二、芽胞染色的原理細菌的芽胞具有厚而致密的壁，透性低，不易著色，若用一般染色法只能使菌體著色而芽胞不著色(芽胞呈無色透明狀)。芽胞染色法就是根據芽胞既難以染色而一旦染上色后又難以脫色這一特點而設計的。所有的芽胞染色法都基于同一個原則：除了用著色力強的染料外，還需要加熱，以促進芽胞著色。當染芽胞時，菌體也會著色，然后水洗，芽胞染上的顏色難以滲出，而菌體會脫色。然后用對比度強的染料對菌體復染，使菌體和芽胞呈現出不同的顏色，因而能更明顯地襯托出芽胞，便于觀察。第三十二頁，共三十五頁，編輯于2023年，星期五三、芽孢染色法步驟(1)取37℃培養24h～36h的枯草芽孢桿菌作涂片，并干燥，固定。(2)于載片上滴入3～5滴5％孔雀綠水溶液。(3)用試管夾夾住載玻片在火焰上用微火加熱，自載玻片上出現蒸汽時，開始計算時間約4～5min。加熱過程中切勿使染料蒸干，必要時可添加少許染料。(4)傾去