《植物生物學(xué)實驗》

逆境脅迫水稻幼苗及其生理指標(biāo)分析實驗一：水稻幼苗對鹽脅迫的反應(yīng)實驗二：用氮藍(lán)四唑法測定植物超氧化物歧化酶活力

一、實驗?zāi)康牧私庵参锶绾螌δ婢趁{迫產(chǎn)生反應(yīng)。觀察分析水稻幼苗鹽脅迫后發(fā)生的形態(tài)生理指標(biāo)變化，用于指導(dǎo)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)。實驗一：水稻幼苗對鹽脅迫的反應(yīng)二、實驗原理逆境或脅迫（Stress）：對植物產(chǎn)生傷害的環(huán)境。逆境脅迫生物因素非生物因素溫度：低溫(冷害、凍害)，高溫?zé)岷λ郑焊珊担瑵窈Α澈}害酸雨紫外線（UV）營養(yǎng)虧缺、重金屬病害蟲害雜草逆境脅迫對植物傷害的表現(xiàn)形態(tài)變化：生長停滯，葉片萎蔫、卷曲、變黃、枯死等。生理生化：葉綠素含量減少，光合速率下降，呼吸速率下降或升高，細(xì)胞膜系統(tǒng)破壞，酶活性紊亂等。植物對逆境脅迫的適應(yīng)

適應(yīng)方式：避逆性（stressavoidance）：植物會在時空上躲避開不良環(huán)境，如沙漠植物只在雨季生長、陰生植物在樹蔭下生長等。耐逆性（stresstolerance）：植物能夠忍受逆境的作用。

適應(yīng)的形態(tài)生理變化：形態(tài)變化：如干旱條件下葉小、根系發(fā)達(dá)；淹水時擴(kuò)大根部通氣組織；冬季低溫來臨前生長停止、進(jìn)入休眠等。生理變化：1.生物膜結(jié)構(gòu)改變，形成脅迫蛋白，如熱激蛋白、抗凍蛋白等。2.保護(hù)酶系統(tǒng)受破壞

由超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、過氧化物酶(POD)等組成的保護(hù)酶系統(tǒng)會降低或消除活性氧的危害。正常情況下，細(xì)胞內(nèi)自由基的產(chǎn)生和清除處于動態(tài)平衡狀態(tài)，自由基水平很低，不會傷害細(xì)胞。遭受逆境脅迫時，細(xì)胞內(nèi)自由基積累過多，SOD等保護(hù)酶系統(tǒng)被破壞，產(chǎn)生許多有害的過氧化產(chǎn)物如丙二醛等，會傷害細(xì)胞。自由基會破壞膜結(jié)構(gòu)，損傷大分子生命物質(zhì)，引起一系列生理生化紊亂，導(dǎo)致植物死亡。活性氧：陰離子自由基、羥基自由基(-OH)、過氧化氫(H2O2)、單線態(tài)氧(1O2)，具有很強(qiáng)的氧化能力、對許多生物功能分子有破壞作用、引起膜的過氧化作用。自由基：具有未配對價電子的原子或原子團(tuán)。天然的非酶自由基清除劑有維生素E、谷胱甘肽、抗壞血酸、類胡蘿卜素等。3.增加滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，有利吸水：糖、有機(jī)酸、一些無機(jī)離子如K+，其中脯氨酸是最有效的。4.增加脫落酸(ABA)含量。植物鹽脅迫鹽脅迫（鹽害）：土壤鹽分過多對植物造成危害。通常土壤含鹽量達(dá)0.2-0.5%時就不利于植物生長，主要鹽分：氯化鈉、硫酸鈉、碳酸鈉、碳酸氫鈉等。鹽土：氯化鈉和硫酸鈉較多的土壤。堿土：碳酸鈉和碳酸氫鈉較多的土壤。鹽堿土：含鹽量0.6-10%。

若鹽脅迫強(qiáng)度較小，除鹽后，植物生長可以恢復(fù)；

若鹽脅迫強(qiáng)度較大，除鹽后，植物生長不可恢復(fù)鹽害植物對鹽脅迫的適應(yīng)

根據(jù)植物抗鹽能力大小分為：鹽生植物：耐鹽范圍1.5-2.0%，如堿蓬、蘆葦、紅樹植物等。甜土植物（非鹽生植物）：耐鹽范圍0.2-0.8%，如甜菜、高粱等大多數(shù)農(nóng)作物。鹽生植物的避鹽機(jī)制

避鹽：植物通過某種方式將細(xì)胞內(nèi)鹽分控制在傷害閾值之下，以避免鹽分過多對細(xì)胞傷害。泌鹽：植物通過莖、葉上專門分泌鹽分的鹽腺(或鹽囊泡)將鹽分分泌到體外，減少或避免鹽分對植物的傷害，如紅樹植物。稀鹽：植物通過吸收大量水分和加速生長，稀釋細(xì)胞內(nèi)鹽分濃度，并將鹽分積累在莖葉的肉質(zhì)化組織，維持體內(nèi)鹽分濃度的恒定，如堿蓬。拒鹽：植物對鹽有一定的選擇性吸收，并能將鹽分重新分配在植物的安全部位，從而降低鹽分對地上部的傷害，如蘆葦、燈芯草。泌鹽的紅樹植物（鹽腺）稀鹽的堿蓬（肉質(zhì)化）拒鹽的鹽生植物蘆葦——地上部分拒鹽燈芯草——地上部分拒鹽植物血鹽脅慌迫的槳傷害摔表現(xiàn)生理繪干旱訪：土壤釋中鹽爽分過藏多使貸土壤蘭溶液陜水勢城下降峽，導(dǎo)漢致植院物吸瓣水困稻難，察甚至長體內(nèi)鉆水分勿有外燙滲的擴(kuò)危險管，造慰成生甜理干殃旱。離子播失調(diào)府：植物搭由于禾過多猾吸收箭某種冤鹽類迅而排盯斥對韻另一死些礦簡質(zhì)鹽云的吸屑收，吉導(dǎo)致宣營養(yǎng)萬缺乏冬或產(chǎn)雪生毒呆害作偶用。代謝餡破壞西：葉綠癥體解根體、足光合轎速率菜下降命；蛋喝白質(zhì)喂合成捧受抑犯制、拾分解害加強(qiáng)芹，產(chǎn)釣生有幫毒物什質(zhì)，許對細(xì)蹄胞產(chǎn)用生毒京害。膜透緒性改劍變：高濃躍度Na宣Cl可置席換細(xì)是胞膜傻結(jié)合Ca2+、K+，膜結(jié)犬構(gòu)破幸壞、功能昨改變，細(xì)胞的內(nèi)K+、有猜機(jī)質(zhì)著等外滲失。三、鑰實驗倦試劑圖與材壘料試劑估：氯化鮮鈉主要議儀器僑與器善皿：電子瘡天平慈，低搜溫冰爬箱，熊燒杯壞，容撐量瓶聲，量況筒，PE手套趨等。材料支：水稻紅幼苗脅迫楊方式問：鹽脅底迫，貌配制氧濃度0~踏0.牲3m似ol途/L。四、斬實驗衰步驟1.自己女設(shè)計缸配制2個不彈同鹽嗎濃度塑的Na柏Cl溶液框并設(shè)樹置對準(zhǔn)照(C乞K)。2.挑選跟生長備整齊押一致挑的水券稻秧辟苗60歐-9剪0株，錢然后炊隨機(jī)墓取10松-1錢5株于1個燒榨杯中齒，觀皂測記候載描局述鹽脅怕迫處族理前各杯多水稻還秧苗淹的農(nóng)揉藝形泳態(tài)性魂狀(如苗庭高、石葉片嗓顏色幸、葉方片數(shù)匆等)。3.各杯穗分別債加入偶不同展?jié)舛萅a帖Cl溶液50槳ml左右?guī)Вㄔ蕜t：銜根系闊要浸廁入溶京液中談），竟然后掀放置毀在實悉驗架歉上進(jìn)永行鹽腐脅迫侄處理磨。4.處理12振-2你4小h后(具體悼應(yīng)視繪情況事而定)，當(dāng)泊高鹽發(fā)度處那理的欣秧苗緊葉片墾開始負(fù)出現(xiàn)丘卷曲蹈時，漁觀測句記載處理熔后各杯葛秧苗釀農(nóng)藝部形態(tài)事性狀傻的變歡化，肥然后帳將各急杯的萍秧苗葉片分別弊剪下點(diǎn)、隨豎機(jī)稱猴取少覽量葉替片0.掃2-弊0.疼5g，放乏入PE手套投中并份做好恰標(biāo)記偽，置擦于冰義箱冷蓋凍保形存?zhèn)鋭裼谩Ｎ濉⒉m實驗啄分組四個威人組懇成一詳個小旺組進(jìn)像行水授稻幼芝苗鹽匯脅迫護(hù)反應(yīng)煌實驗膛。每小隊組設(shè)初置3個處狠理：1個對椅照和2個不防同鹽仔濃度盆，每懇處理2個重孩復(fù)，巡壽共6份樣水品。注意替每杯罵要做宇好自粗己的跑標(biāo)記越、寫肥上組笛別或榜姓名出。預(yù)習(xí)暮下周爹實驗財：應(yīng)用引氮藍(lán)哀四唑悲（NB岡T）法安測定詳植物雀超氧虜化物輝歧化工酶（SO田D）的搞活力泄。《植物得生物雄學(xué)實利驗》逆境獨(dú)脅迫蛇水稻讀幼苗梁及其筒生理崗指標(biāo)神分析實驗柜二：酸用氮藍(lán)四貢唑（NB時T）法麻測定植物連超氧員化物抗歧化邁酶（SO變D）活洗力一、園實驗災(zāi)目的學(xué)習(xí)零掌握驅(qū)用氮藍(lán)屈四唑芝（NB棵T）法狂來測輛定植臂物超氧膛化物矮歧化歸酶（su半pe腰ro意xi商de照d層is士mu淹ta吹se就,挺SO貍D）的柔活力特。了解巴不同雅鹽濃養(yǎng)度脅財迫對水物稻幼遲苗葉縱片SO木D酶的前影響霧。二、歐實驗鴉原理SO紡D發(fā)現(xiàn)罪：19柔38年Ma懼rn等人升首次蹈從牛紅生血球中分躁離得涂到SO斧D。SO齊D分布努：廣泛任分布木在各拐種生須物體巾內(nèi)，振其活組性高嗚低可竹作為尸抗衰珠老的紗指標(biāo)訪。SO符D類型扣：SO過D是含Cu、Zn、Mn、Fe金屬瀉元素帝、能逆清除千超氧襖陰離互子自功由基表的酶驗，其選類型很有Cu肝/Z迅n-裙SO竿D、Mn慕-S殿OD、Fe毫-S走OD。SO址D測定翅方法直接茫法：脈沖蕉輻射陷分解獎法、球電子討順磁允共振慢波法拘、核驢磁共址振法懷。間接蓄法（崖化學(xué)燦法）痰：鄰苯士三酚續(xù)自氧以化法刃、細(xì)隙胞色孟素C還原妥法、客羥胺映法、叼黃嘌匙呤氧枝化酶-N體BT法、紹腎上明腺素正法等宏。免疫明法：放射旺免疫譯法、拔化學(xué)受發(fā)光撫免疫穿分析舅法、EL強(qiáng)IS耽A法等省。超氧粒陰離裝子自裝由基那壽命閣短，臨不穩(wěn)訪定，謝不易鵲直接條測定SO渴D活性驕，因雅而采金用間食接測鼓定法包。常學(xué)用有3種：氮藍(lán)問四唑捧（NB智T）光她化還交原法、鄰村苯三栽酚自畝氧化您法、葛化學(xué)守發(fā)光版法。在有憤氧化汽物質(zhì)熟存在塊下，核黃突素可被肅光還田原，零還原村的核綁黃素摘極易襖再氧繳化而包產(chǎn)生氧自奴由基，可皺將氮藍(lán)廊四唑還原附為藍(lán)色恥的甲悼腙，甲蝕腙在56齊0n睬m處有往最大幼吸收鍋。而SO風(fēng)D可清也除氧庫自由愉基，淋從而奶抑制喇了甲陸腙的清形成第。光還練原反增應(yīng)后諷，反應(yīng)上液藍(lán)凡色愈感深，敵說明瓜酶活椅性愈省低，反鉆之酶煤活性振愈高東。據(jù)睡此可賞以計送算出腰酶活數(shù)性大秋小。酶單位/樣品量=NB饅T法測測定SO傅D酶活慌性的血原理核黃謙素：在艦有氧適物質(zhì)葛存在沈下，脈還原斑的核坑黃素氧與氧梅反應(yīng)寸產(chǎn)生氧自糞由基。氮藍(lán)液四唑(N浪BT齒)：氧偽自由印基將絹無色(或微馬黃)的NB報T還原啊為藍(lán)色貨甲腙劇。甲硫掠氨酸：電鍵子供概體——提供潑核黃沒素的慣還原質(zhì)反應(yīng)尚所需臺的電樣子供束體，犁使得主核黃后素的街光激取發(fā)還逗原反膠應(yīng)得宮以進(jìn)浪行。SO周D酶：SO銀D通過催化餡氧自順由基渴歧化子反應(yīng)，生欺成O2與H2O2，從而枯抑制銹藍(lán)色乳甲腙滅形成被。SO遙D催化吉反應(yīng)捷如下代：（1）在令一定抵鹽度卷的脅主迫下嚴(yán)，植管物葉于片中SO棕D活性脹隨鹽系濃度攤的升太高而荷增強(qiáng)映。（2）SO雪D酶能孕有效派抑制夸膜脂井過氧斃化作睛用，賄具有一定露的保闖護(hù)作忙用。因此奏，鹽揭脅迫溪的損靜傷在臉一定結(jié)范圍脖內(nèi)是盤可以棗修復(fù)勾。膜系孔統(tǒng)的佩修復(fù)政與SO蓄D、CA核T、PO賠D等抗喊氧化梢酶的年活性蹈和抗軟壞血智酸(A慶SA延)、谷禾胱甘躬肽(G非SH貫)等抗祝氧化客物含還量的開變化映密切竭相關(guān)配。鹽脅亂迫對冬植物燃葉片SO榨D酶的蝴影響二、緣瑞實驗竭材料好、儀鐮器與慘試劑材料浪：水稻鏈幼苗史鹽脅涉迫處陷理后鋤的葉利片。儀器樂設(shè)備靜：電子羊天平訂，高渡速臺津式離草心機(jī)報，分戰(zhàn)光光附度計莊，移慨液器慨，熒寒光燈鳥（反敞應(yīng)試拜管處潑照度駝為40絲式00柏Lx），午試管妹數(shù)支粥，研遣缽，笨燒杯頁，離側(cè)心管姨，量突筒等袋。試劑扶：SO吊D抽提辮液：50夜mm盆ol卵/L磷酸庫緩沖被液（pH織7.纖8）14姻.5相mm碧ol扒/L甲硫滲氨酸哪（Me京t）溶留液：沸現(xiàn)配腰現(xiàn)用斬。2.賄25友mm矩ol雀/L氮藍(lán)幟四唑刊溶液嗚（NB冷T）：禿避光章保存零，現(xiàn)格配現(xiàn)購用。60瞇μm良o(jì)l霞/L核黃何素溶屈液：腹避光扮保存品，現(xiàn)有配現(xiàn)挪用。3μ壟mo剩l/掛L幫ED包TA－Na2溶液主要悠試劑綱配制丙（供賽參考籃）：（1）50歇mm付ol紅/L磷酸劈燕鈉緩娘沖液之（pH稱7.同8）：A液：Na香H2PO4·屑2H2O（分壞子量15胳6.姿01）：3.辰12尤g溶于銜蒸餾度水，急定溶孩至10同0m嚴(yán)l。B液：Na2HP鑼O4·棗12尾H2O（分億子量35涼8.英14）：7.孝17貫g溶于刊蒸餾溝水，申定溶泰至10乳0m總l。取A液8.政5m寄l與B液91招.5取ml混合剩，定則容至40趴0m求l，pH7臉.8。（2）SO夕D提取躍液：50慕mm扎ol搶/L磷酸勤緩沖鎖液[含0.予1m區(qū)mo矩l/仁L晴ED鳥TA；0.則3%灘(w欠/v用)和Tr咽it禾on畝X臂-1昨00；2-培4%（w/禽v）聚女乙烯栗聚吡駱咯烷動酮（PV內(nèi)P）,須pH善7.勺8]。即每誘升磷熱酸緩堅沖液畏中加20包gPV料P，20鎖0μl也0.咸5m農(nóng)ol到/L的ED鼠TA母液希，3m臨l略Tr個it鉤on益X拐-1昨00。（3）14弓.5規(guī)mm往ol煌/L甲硫頁氨酸愁（分優(yōu)子量14耳9.脊21）：稱2.栽16勁3g溶于克蒸餾擱水，辨定溶濱至10醫(yī)00泄ml獎(較難派溶，占需稍嶺微加辨熱）跌。（4）2.和25暫mm顏ol冊/L波N活BT（分另子量81幕7.細(xì)7）：稱92姻mg溶于50印ml刃5厚0m胃M磷酸庸磷酸團(tuán)緩沖勁液（pH界7.饞8），糊現(xiàn)配農(nóng)現(xiàn)用押，避率光保煤存。（5）60媽μm毯ol勒/L核黃珍素（紡分子閣量37猶6.逗36）：稱2.繁25熔mg溶于50倉ml腹5這0m雀M磷酸部磷酸賓緩沖殃液（pH傷7.怠8）杠，現(xiàn)緩配現(xiàn)犯用，躍避光兩保存拔。（6）3μ珠mo屠l/欲L暮ED謙TA鬧-N艇a2（分先子量37跳2.罵24）：A、0.醋5mo刺l/捆L：稱9.砍30項6g溶于肅蒸餾歉水，索定容溝至50奇ml。（注趟意：林?jǐn)嚢枧鯐r用Na步OH調(diào)pH至8.恥0才能軟完全毫溶解美）。B、0.州5mmo韻l/烈L：取A液1m墨l用蒸季餾水嫂稀釋胞定容怕至10嬸00亞ml。C、3μm招ol腦/L：取B液3m救l用磷姜酸緩謙沖液疤稀釋負(fù)定容蜓至50聞0m稈l。三、梢實驗蹲步驟酶液槽提取蠢：將經(jīng)拘鹽脅牲迫處館理、雅稱好破保存煤的水讀稻葉任片0.反2-稿0.邪5g置于預(yù)冷粱的研炊缽中，彎加1-快2m篩l預(yù)冷鐮的SO扣D提取搭液在冰兵浴上株研磨黃成漿近，并準(zhǔn)轉(zhuǎn)移蠅到離伯心管贏中，紀(jì)再用樓提取悲液清莖洗研霞缽，沃每次1m終l，轉(zhuǎn)車移到厭同一豪離心馬管中代，終伏體積碰不超購過4m深l；于60介00肆-8篩00愧0r蛋pm下離補(bǔ)心5-閑10汗m嘗in，上扛清液唉即為SO黎D酶粗伯提液尿，置捧于冰墨箱保享存?zhèn)浼谩?.反應(yīng)圓體系試劑用量（ml/管）50mMSOD提取液1.514.5mM

甲硫氨酸0.32.25mMNBT0.33μMEDTA-Na20.360μM核黃素0.3蒸餾水0.25酶液0.05（2支對照管以提取液代替酶液）總體積3.03.做預(yù)蠻實驗乓：在正命式測鏡定SO菠D活性算之前帳，要拐進(jìn)行功酶液紅加入婦量的省預(yù)實革驗，攔以確巴定最務(wù)佳酶押液濃綿度。酶液五稀釋請：取其致中一翠管酶錯液按1倍、10倍、10弊0倍稀柄釋。混合找液配梁制：計算4-怠5支試邁管的預(yù)用量尋，按窯反應(yīng)挪體系姜表中私各溶仁液(除酶逝液外)配制1份混詢合液(現(xiàn)用鞋現(xiàn)配)。加酶攝液：在每看支試賭管中浪加混榆合液2.頸95客ml，再分犯別加狗入相踩對應(yīng)枕的酶上液量呆，其腳中2支空擺白對薪照用提者取液堪代替遣酶液洗，混悔勻，峽馬上禮用黑貞色塑恥料袋爺罩住慢。照光想反應(yīng)塞：取1支對搬照管淹于暗利處，結(jié)其余卷的置庸于試雕管架固上，館于40鎮(zhèn)00箭Lx日光鐮燈下旁反應(yīng)20需mi僚n（要灶求各管社受光柴情況純一致，光護(hù)照時抗間視臨具體邪情況金而定臺，如塊光照犁強(qiáng)、膠溫度確高則歸時間條縮短景，反錢之則取延長族，時悼間要火嚴(yán)格壞控制兼）。終止車反應(yīng)撐：照光昏完畢馬上么用黑涌色塑迎料袋哲罩住杠試管昆架，以早終止揚(yáng)反應(yīng)悶。SO希D活性陪測定廁：以不躺照光薪的對定照管豪做空掛白，母分別母測定眉各管OD值。確定幼酶液頸加入奴量：以抑說制率竿在35紀(jì)%-敢65廟%為佳籃。4.正式鈴實驗準(zhǔn)備8支相焰同型疑號的資試管南：6支樣牌品、2支對照世。混合遞液配斧制：按8-云10支試顯管的用量回配制浸（同預(yù)日實驗）。加酶交液：各管暮加入混合剝液2.竭95飽ml，6支分需別加革入相對棒應(yīng)的冬酶液量圍，2支對醬照管棚用提吃取液尼代替，混惡勻，思遮光要。照光潮反應(yīng)租：取1支對薯照管蹲置暗獲處，其余驢各管于40泛00籌Lx日光活燈下緣瑞反應(yīng)欣，時工間根據(jù)個預(yù)實確驗進(jìn)行捆調(diào)整畢（縮峽短或僻延長蛛）。終止悠反應(yīng)馳：照光導(dǎo)完成店后，迅速宗用黑鬧色垃缸圾袋座罩住訓(xùn)試管崗架，終角止反域應(yīng)。SO假D活性由測定處：以不照椒光的慮對照壓管做空冬白調(diào)衰零，胖逐一德迅速喂測定順各管堤在56斜0仔nm處的OD值。四、進(jìn)結(jié)果慨計算一個SO顏D酶活尸性單洪位的顆確定蔬：按最洞初測錄定SO犬D活性戀時的貿(mào)設(shè)計里，以能湊抑制體反應(yīng)50普%的酶微量為咐一個SO拉D酶活乎性單納位。如NB珍T在光準(zhǔn)照下迷被還鎖原為辦藍(lán)色恐甲腙巧，檢員測OD56晶0=0鴨.5；若蟻在反悔應(yīng)系還統(tǒng)中闖加入麗酶，SO始D催化侍歧化鳴為H2O2和O2，與NB購T競爭，部仰分抑春制了NB丑T還原勉成藍(lán)璃甲腙單的反貼應(yīng)，啄檢測OD56遣0=0沸.2紗5，NB臘T的光愁化還越原剛鈴被SO踢D抑制50珠%，則穗此時目加入布的酶搖量為叛一個SO奧D酶單需位。SO機(jī)D總活河性：禮以每裙克鮮古重酶超單位盜表示剪。SO件D比活