基因操作技術詳解演示文稿目前一頁\總數二十八頁\編于十三點優選基因操作技術目前二頁\總數二十八頁\編于十三點

第一節

DNA克隆

1DNA克隆克隆是指遺傳上同一的生物體群體或由無性繁殖所產生的無性繁殖系(如株系,細胞系,菌株)DNA克隆是指含有相同DNA分子或DNA片段的的細胞群體.通過分離基因組DNA,擴增某個特定DNA片段,轉化到受體細胞中增殖，可制備出一個特定DNA克隆.

DNA制備是DNA克隆及其他DNA操作的第一步驟.DNA克隆的基本程序如下:目前三頁\總數二十八頁\編于十三點DNA提取

→

分離和擴增特定DNA片段(PCR)

載體連接

↓

↓

重組體DNA

↓轉化宿主細胞

↓

細胞培養(細胞克隆)

克隆篩查↓(分子雜交)

↓

靶DNA克隆

↓

表達分析與功能分析

目前四頁\總數二十八頁\編于十三點1.1DNA制備(提取)

組織細胞---→研磨破細胞---→

萃取

↓↓離心↓

分離

↓純化↓DNA樣品(

WithDNA

)目前五頁\總數二十八頁\編于十三點1.2DNA擴增(PCR)目前六頁\總數二十八頁\編于十三點1.3

轉化轉化是把外源DNA（重組體DNA）轉移到宿主細胞中復制的過程。靶DNA

重組載體轉化細胞

分子克隆載體DNA目前七頁\總數二十八頁\編于十三點2宿主細胞,載體及亞克隆宿主?宿主生物或細胞能夠高速率復制外源DNA.?

多數宿主是細菌(如E.coli),培養細胞或原生質體.

?

宿主細胞通常需經感受態處理才能吸收外源DNA.

載體?載體是獨立于宿主細胞的復制子.

?載體易分離,帶有選擇標記,并容易插入外源DNA.

?

常用的載體有:質粒,噬菌體,粘粒,細菌人工染色體和酵母人工染色體.目前八頁\總數二十八頁\編于十三點亞克隆:

亞克隆是從一個載體中將特定克隆DNA片段轉移到另一載體的過程.克隆DNA分離→

限制酶切

→靶DNA片段分離收集

靶DNA片段純化

→

載體連接

轉化,篩選,克隆分析

亞克隆目前九頁\總數二十八頁\編于十三點3DNA文庫

DNA文庫由一個基因組的全部DNA克隆所構成,每個DNA克隆含有基因組DNA(基因組文庫)或總cDNA(cDNA文庫)的一個隨機片段.

?基因組文庫:

基因組DNA→隨機片段→重組體DNA→轉化↓

基因組DNA克隆

?cDNA文庫:

提取總mRNA→反轉錄為cDNA→重組體DNA

↓

轉化

↓

cDNA克隆

vectors目前十頁\總數二十八頁\編于十三點基因文庫篩選是用分子探針或特殊蛋白質從基因文庫中尋找特定DNA克隆的過程.DNA探針

每一克隆DNA

分子雜交(SouthernorWesternblot)

檢測與定性

克隆分析:結構(序列)分析,功能分析(編碼蛋白質)

比對分析(同源基因).目前十一頁\總數二十八頁\編于十三點第二節質粒載體制備DNA載體是能獨立復制并能插入外源DNA的小分子DNA理想載體的要求:

?高復制率;

?多個限制性內切酶識別位點(每種酶一個識別位點);

?帶有選擇性標記(克隆篩選標記和重組體篩選標記);

?能容納較大的DNA片段插入.質粒是存在于細菌染色體外的小DNA分子,是最早用于基因操作的載體分子,主要用于攜帶外源基因進入細菌細胞中復制和表達.通常將攜帶外源基因的載體稱為重組載體

(重組DNA)目前十二頁\總數二十八頁\編于十三點1質粒?質粒是染色體外的環狀DNA分子.

絕大多數質粒發現于細菌細胞中,但對細菌的代謝和生命周期是非必需的.

?質粒的存在可能賦予宿主細胞一些特性,如抗藥性、耐逆性、接合性等.

?質粒能獨立于宿主DNA復制.

?質粒賦予宿主的一些特性,可作為選擇性標記.?質粒根據其復制特性可分為兩類:

嚴謹型質粒(低復制率);

松馳型質粒(高復制率).

目前十三頁\總數二十八頁\編于十三點重組體篩選

雙標記,負選擇目前十四頁\總數二十八頁\編于十三點重組體篩選

藍白斑目前十五頁\總數二十八頁\編于十三點2質粒制備

培養含所需質粒的細菌株系;離心收集細菌沉淀物,再懸浮;堿裂解部分破壁增加細胞透性:

懸浮培養→裂解液→中和→離心→收集上清液

酚萃取除去蛋白質;乙醇沉淀,收集質粒DNA;DNA純化:CsCl2

梯度離心(大量制備用)

緩沖液溶解,酚/仿萃取,乙醇沉淀

目前十六頁\總數二十八頁\編于十三點質粒

DNA

制備工藝目前十七頁\總數二十八頁\編于十三點質粒DNA瓊脂糖凝膠電泳+目前十八頁\總數二十八頁\編于十三點第三節限制性內切酶及酶切片段凝膠電泳1限制性DNA內切酶限制性內切酶催化從DNA分子內部水解磷酸二酯鍵,切斷雙鏈DNA限制性內切酶有特定的識別位點,且不同的限制性內切酶的識別位點的序列各不相同.

限制

-

修飾系統是生物體的主要防御機制:

?限制性內切酶在特定位點切割外來DNA,切割后的DNA片段再被其他的DNase完全水解;?甲基化酶給自身DNA的識別位點上的C或A堿基加上甲基,使限制性內切酶不能催化該位點DNA水解,從而保護宿主DNA免受破壞.

目前十九頁\總數二十八頁\編于十三點限制性內切酶的分類:TypeI有特定識別位點但隨機切割.TypeII有特定識別位點且在同一位置切割.TypeIII有特定識別位點但在之外幾個堿基處切割DNA.

限制性內切酶TypeII

的作用特點：識別位點是回文序列.切割后產生粘性末端(3`-突出或5`-突出),可進行退火堿基配對并用DNA連接酶修復連接.少數限制性內切酶切割后可產生平端(鈍端),須用特殊的DNA連接酶(如T4

DNA連接酶)連接.目前二十頁\總數二十八頁\編于十三點

目前二十一頁\總數二十八頁\編于十三點2瓊脂糖凝膠電泳反應體系:瓊脂糖(0.5-2.0%);緩沖液(約pH8.0);DNA樣品(上樣緩沖液

+

DNA

+

EB

或其他染色劑);電場(

約100V

).目前二十二頁\總數二十八頁\編于十三點注意事項:在高pH條件下,所有DNA分子在緩沖液中均帶負電荷,在電泳過程中將向正極遷移.遷移率與DNA分子的大小(長度)成正相關.相同大小的DNA在超螺旋狀態下的電泳遷移快于線性DNA和環狀DNA,線性DNA的電泳遷移快于環狀DNA.較大的DNA分子須在較低濃度的凝膠上進行電泳,較小的DNA分子可用較高濃度的凝膠.當DNA與蛋白質結合時,其電泳遷移明顯地減緩（凝膠阻滯）.目前二十三頁\總數二十八頁\編于十三點Electrophoretogram酶切片段的電泳分離目前二十四頁\總數二十八頁\編于十三點從瓊脂糖凝膠中分離特定的DNA片段:

?切膠,熔解凝膠和去除EB;

?酚/仿萃取、離心收集和純化DNA。

熔膠和去EB

Tar