流式細胞技術和流式細胞儀第1頁，共74頁，2023年，2月20日，星期一本章內容提要

概述

第一節流式細胞儀的工作原理

第二節流式細胞儀的分類與結構

第三節流式細胞儀的主要性能指標

第四節流式細胞儀應用的技術要求

第五節FCM的維護及常見故障的排除

第六節流式細胞儀的臨床應用

本章內容小結第2頁，共74頁，2023年，2月20日，星期一概述

流式細胞儀的定義流式細胞術的定義生物學顆粒的內容流式細胞儀的發展史第3頁，共74頁，2023年，2月20日，星期一概述

流式細胞儀的定義:流式細胞儀是以激光為光源，集流體力學技術、電子物理技術、光電測量技術、計算機技術以及細胞熒光化學技術、單克隆抗體技術為一體的新型高科技儀器。

第4頁，共74頁，2023年，2月20日，星期一概述

流式細胞術的定義:應用流式細胞儀對于處在快速直線流動狀態中的細胞或生物顆粒進行快速的、多參數的定量分析和分選的技術稱為流式細胞術。

第5頁，共74頁，2023年，2月20日，星期一概述

生物學顆粒包括大的免疫復合物、DNA、RNA、蛋白質、病毒顆粒、脂質體、細胞器、細菌、霉菌、染色體、真核細胞、雜交細胞、聚集細胞等，所檢測的生物顆粒的理化性質包括細胞大小、細胞形態、胞漿顆粒化程度、DNA含量、總蛋白質含量、細胞膜完整性和酶活性等。第6頁，共74頁，2023年，2月20日，星期一概述

1934年：Moldavan1967年：VanDilla和LosAlamos

1965年：Kamentsky

1969年：Fulwyler利用Sweet

80年代

90年代第7頁，共74頁，2023年，2月20日，星期一概述

1934年Moldavan使懸浮的血紅細胞從一個毛細玻璃管中流過，每個通過的細胞可被一個光電裝置記錄下來，這可謂流式細胞儀的最初模型。第8頁，共74頁，2023年，2月20日，星期一概述

1965年Kamentsky用紫外吸收和可見光散射兩個參數同時測量未染色的細胞，給出了細胞中核酸的含量和細胞大小，奠定了多參數流式細胞測量的基礎。第9頁，共74頁，2023年，2月20日，星期一概述

1967年VanDilla和LosAlamos采用了Crosland-Taylor設計的層流流動室和氬離子激光器開發出了液流束、照明光軸，檢測系統三者互相垂直的流式細胞儀，成為目前各種流式細胞測量儀的基礎。

第10頁，共74頁，2023年，2月20日，星期一概述

1969年Fulwyler利用Sweet的靜電墨水噴射液滴偏轉技術，建立了流式細胞分選術。Ehrlich和Wheeless利用飛點掃描技術和縫掃描技術使零分辨率的流式細胞儀變成了低分辨率的流式細胞儀。第11頁，共74頁，2023年，2月20日，星期一概述

80年代以來，流式細胞儀的數據采集、存儲、顯示、分析日趨完善，隨著樣品制備方法的增多，新的熒光染料和細胞標記物的出現，流式細胞儀的應用范圍逐漸擴大。

第12頁，共74頁，2023年，2月20日，星期一概述

進入90年代，標本制備儀和自動進樣器的問世，以及適合臨床應用的單克隆抗體的增加，使流式細胞儀不僅出現在大專院校和科研單位，它也逐漸進入醫院的中心實驗室和檢驗科。第13頁，共74頁，2023年，2月20日，星期一第一節流式細胞儀的工作原理第一節流式細胞儀的工作原理

一、生物學顆粒分析原理

二、細胞分選原理第14頁，共74頁，2023年，2月20日，星期一第一節流式細胞儀的工作原理1.樣品的進入流動室：將懸浮分散的單細胞懸液，經特異熒光染料染色后，放人樣品管。在氣體壓力的作用下，懸浮在樣品管中的單細胞懸液形成樣品流垂直進入流式細胞儀的流動室，沿流動室的軸心向下流動。第15頁，共74頁，2023年，2月20日，星期一第一節流式細胞儀的工作原理2.鞘液的作用：流動室軸心至外壁的鞘液也向下流動，形成包繞細胞懸液的鞘液流，鞘液和樣品流在噴嘴附近組成一個圓柱流束，自噴嘴的圓形孔噴出，與水平方向的激光束垂直相交，相交點稱為測量區。第16頁，共74頁，2023年，2月20日，星期一第一節流式細胞儀的工作原理3.信號的產生與接收：染色的細胞在測量區受激光照射后發出熒光，同時產生光散射。這些信號分別被光電倍增管和光電二極管接收，經過計算機儲存、計算、分析這些數字化信息，就可得細胞的大小和核酸含量等指標。第17頁，共74頁，2023年，2月20日，星期一第一節流式細胞儀的工作原理當某類細胞的特性與要分選的細胞相同時，流式細胞儀就會在這類細胞形成液滴時給含有這類細胞的液滴充以特定的電荷，帶有電荷的液滴向下落入偏轉板間的靜電場時，依所帶電荷的符號分別向左偏轉或向右偏轉，落入指定的收集器內。第18頁，共74頁，2023年，2月20日，星期一第二節流式細胞儀的分類和基本結構一、流式細胞儀的分類

（一）流動室與液流驅動系統

（二）激光光源與光束成形系統

（三）光學系統

（四）信號檢測與分析

（五）細胞分選器二、流式細胞儀的基本結構第19頁，共74頁，2023年，2月20日，星期一第二節流式細胞儀的分類和基本結構一、流式細胞儀的分類流式細胞儀根據功能不同可分為臨床型和科研型。臨床型只有分析功能，沒有分選功能，操作簡便，易學易掌握。科研型既有分析功能又有分選功能，可快速將所感興趣的細胞分選出來。第20頁，共74頁，2023年，2月20日，星期一第二節流式細胞儀的分類和基本結構一、流式細胞儀的分類流式細胞儀根據其結構不同又可分為一般流式細胞儀和狹縫掃描流式細胞儀。前者的光斑直徑大于被檢細胞體積，只能提供細胞內某種生物化學成分的參數。狹縫掃描流式細胞儀被檢細胞直徑大于激光光斑直徑，可計算出細胞直徑大小、核直徑大小、核漿比例等一系列的形態學信息的定量資料。

第21頁，共74頁，2023年，2月20日，星期一第二節流式細胞儀的分類與結構

狹縫掃描流式細胞儀

被檢細胞直徑大于激光光斑直徑，細胞通過光束時各部分被依次掃描。第22頁，共74頁，2023年，2月20日，星期一第二節流式細胞儀的分類和基本結構二、流式細胞儀的基本結構（一）流動室與液流驅動系統流動室由石英玻璃制成，并在石英玻璃中央開一個孔，供細胞單個流過，檢測區在該孔的中心，流動室內充滿了鞘液,鞘液的作用是將樣品流環包。樣品流在鞘流的環包下形成聚焦，保證每個細胞通過激光照射區的時間相等，從而得到準確的細胞熒光信息。

第23頁，共74頁，2023年，2月20日，星期一第二節流式細胞儀的分類和基本結構

由右圖可知，空氣泵產生壓縮空氣，通過鞘流壓力調節器加在鞘液上一恒定的壓力，這樣鞘液以勻速運動流過流動室，在整個系統運行中流速是不變的。

第24頁，共74頁，2023年，2月20日，星期一第二節流式細胞儀的分類和基本結構

由于激光焦點處能量分布為正態分布（見圖），中心處能量最高。因此，當樣本速率選擇高速時，處在樣本流不同位置的細胞或顆粒，受激光照射的能量不一樣，從而被激發出的熒光強度也不相同。

第25頁，共74頁，2023年，2月20日，星期一第二節流式細胞儀的分類和基本結構（二）激光光源與光束成形系統激光是一種相干光源，它能提供單波長、高強度及穩定性高的光照。由于細胞的快速流動，每個細胞經過光照區的時間僅為1μs左右，且細胞所攜帶熒光物質被激發出的熒光信號強弱，與被照射的時間和激發光的強度有關，因此細胞必須達到足夠的光照強度。

第26頁，共74頁，2023年，2月20日，星期一第二節流式細胞儀的分類和基本結構（三）光學系統FCM的光學系統是由若干組透鏡、濾光片和小孔組成。濾光片主要分為：1.長通濾光片長通濾光片使特定波長以上的光通過。2.短通濾光片特定波長以下的光通過。3.帶通濾光片帶通濾光片允許一定波長范圍內的光通過第27頁，共74頁，2023年，2月20日，星期一第二節流式細胞儀的分類和基本結構（四）信號檢測與分析當細胞攜帶熒光素標記物，通過激光照射區時，細胞內不同物質產生不同波長的熒光信號。這些信號以細胞為中心，向空間360度立體角發射，產生散射光和熒光信號。第28頁，共74頁，2023年，2月20日，星期一第二節流式細胞儀的分類和基本結構（四）信號檢測與分析

1.散射光信號散射光分為前向角散射和側向角散射，散射光不依賴任何細胞樣品的制備技術(如染色)，稱為細胞的物理參數（或稱固有參數）。（1）前向角散射前向角散射與被測細胞的大小有關（2）側向角散射側向散射光可提供細胞內精細結構和顆粒性質的信息。第29頁，共74頁，2023年，2月20日，星期一第二節流式細胞儀的分類和基本結構（四）信號檢測與分析

2.熒光信號當激光光束與細胞正交時，一般會產生兩種熒光信號。一種是細胞自身在激光照射下發出微弱的熒光信號，稱為細胞自發熒光；另一種是經過特異熒光素標記細胞后，受激發照射得到的熒光信號，通過對這類熒光信號的檢測和定量分析能了解所研究細胞的性質和數量。第30頁，共74頁，2023年，2月20日，星期一第二節流式細胞儀的分類和基本結構（四）信號檢測與分析2.熒光信號

（1）熒光信號線性測量和對數測量線性放大器的輸出與輸入是線性關系，細胞DNA含量、RNA含量、總蛋白質含量等的測量一般選用線性放大測量。在細胞膜表面抗原等的熒光檢測時通常使用對數放大器。第31頁，共74頁，2023年，2月20日，星期一第二節流式細胞儀的分類和基本結構（四）信號檢測與分析2.熒光信號

（2）熒光信號的面積和寬度熒光信號的面積是采用對熒光光通量進行積分測量，一般對DNA倍體測量時采用面積，這是因為熒光脈沖的面積比熒光脈沖的高度更能準確反映DNA的含量。熒光信號的寬度常用來區分雙連體細胞。第32頁，共74頁，2023年，2月20日，星期一第二節流式細胞儀的分類和基本結構（四）信號檢測與分析2.熒光信號

（3）光譜重疊的校正當細胞攜帶兩種熒光受激光激發而發射兩種不同波長的熒光時，理論上可選擇濾片使每種熒光僅被相應的檢測器檢測，但由于目前所使用的各種熒光染料都是寬發射譜性質，雖然它們之間發射峰值各不相同，但發射譜范圍有一定的重疊。第33頁，共74頁，2023年，2月20日，星期一第二節流式細胞儀的分類和基本結構

從右圖中可以看出，陰影為探測器檢測光譜的范圍，FITC探測器會探測到少量的PE光譜，而PE探測器則檢測到較多的FITC光譜。

第34頁，共74頁，2023年，2月20日，星期一第二節流式細胞儀的分類和基本結構

圖中點A通過透鏡f成像在A’處，而點B通過透鏡f成像在B’處。在光電倍增管前放上一小孔，作為空間濾波器，排除其它雜散光信號，從而確保了A點光源進不了B’點處，B點光源也進不了A’點處。

第35頁，共74頁，2023年，2月20日，星期一第二節流式細胞儀的分類和基本結構（五）細胞分選器1．小水滴的形成壓電晶體帶動流動室振動，液流形成水滴。噴嘴的振動頻率即每秒鐘產生水滴的數目。當噴嘴直徑為50μm時，信號頻率為40kHz，則每秒鐘產生4萬個水滴。若每秒鐘流出的細胞是1000個，則平均每40個水滴中只有一個水滴是有細胞的，其他皆為空白。

第36頁，共74頁，2023年，2月20日，星期一第二節流式細胞儀的分類和基本結構（五）細胞分選器2．邏輯電路

為了分選細胞，需要細胞在經過測量區時判斷出哪個細胞滿足了分選的條件，并產生一個邏輯信號，此信號驅動充電脈沖發生器，使之產生充電脈沖。第37頁，共74頁，2023年，2月20日，星期一第二節流式細胞儀的分類和基本結構（五）細胞分選器3．水滴的充電與偏轉

當水滴從流束上將要斷開時給整個流束充電，則水滴從流束上斷開后便帶有同極性的多余表面電荷。下落的水滴通過一對平行板電極形成的靜電場時，帶正電荷的水滴向帶負電的電極板偏轉，這樣就可用容器收集水滴。第38頁，共74頁，2023年，2月20日，星期一第二節流式細胞儀的分類和基本結構（六）FCM測量數據的存貯、顯示與分析目前FCM數據的存貯的方式均采用列表排隊(ListMode)方式。目前FCM所采用的都是多參數指標，熒光標記物參數數量在逐漸增多。采用ListMode方式可大量節約內存和磁盤容量。第39頁，共74頁，2023年，2月20日，星期一第三節流式細胞儀的主要性能指標

一、熒光測量靈敏度二、儀器的分辨率三、前向角散射光檢測靈敏度四、FCM分析速度五、FCM分選指標第40頁，共74頁，2023年，2月20日，星期一第三節流式細胞儀的主要性能指標一、熒光測量靈敏度靈敏度的高低是衡量儀器檢測微弱熒光信號的重要指標。一般以能檢測到單個微球上最少標有FITC或PE熒光分子數目來表示，現在的FCM均可達到檢測小于100個熒光分子的指標。第41頁，共74頁，2023年，2月20日，星期一第三節流式細胞儀的主要性能指標二、儀器的分辨率分辨率是衡量儀器測量精度的指標，通常用變異系數CV(CoefficientofVariation)值表示：(δ是分布的標準誤差，是分布的平均值)第42頁，共74頁，2023年，2月20日，星期一第三節流式細胞儀的主要性能指標三、前向角散射光檢測靈敏度前向角散射光檢測靈敏度是指能夠檢測到的最小顆粒大小，一般目前商品化的FCM可以測量到0.2μ～0.5μ左右。第43頁，共74頁，2023年，2月20日，星期一第三節流式細胞儀的主要性能指標四、FCM分析速度分析速度以每秒分析的細胞數來表示。當細胞流過光束的速度超過FCM儀器響應速度時，細胞產生的熒光信號就會丟失，這段時間稱為儀器的死時間。死時間越短，儀器處理數據越快，一般可達到3000～6000個/秒左右。大型機已達到每秒幾萬個細胞。第44頁，共74頁，2023年，2月20日，星期一第三節流式細胞儀的主要性能指標五、FCM分選指標分選指標主要包括分選速度、分選純度和分選收獲率。分選速度指每秒可提取所要細胞的個數。分選純度指要分選的目的細胞占分選出細胞的百分比。分選收獲率指被分出的細胞與原來溶液中該細胞的百分比。第45頁，共74頁，2023年，2月20日，星期一第四節流式細胞儀應用的技術要求

流式細胞分析儀器是一項集多學科知識綜合應用的復雜儀器，除了對儀器各方面性能指標有嚴格的要求以外，在實驗設計與樣品處理方面也需要有豐富的基礎理論及操作經驗。

一、檢測樣品制備的重要性

二、常用的熒光染料與標記染色

三、FCM操作技術的質量控制第46頁，共74頁，2023年，2月20日，星期一第四節流式細胞儀應用的技術要求

一、檢測樣品制備的重要性因為流式細胞儀測量的是每個細胞所產生的散射光和熒光信號，如果兩個或多個細胞間粘連重疊或細胞碎片過多，都會影響信號的收集及所收集信號的真實性，所以制備單細胞懸液是進行流式細胞儀分析最關鍵的第一步。第47頁，共74頁，2023年，2月20日，星期一第四節流式細胞儀應用的技術要求

二、常用的熒光染料與標記染色散射光信號是激光照在細胞上所產生的前向光和側向光信號。熒光信號來自于細胞的自發熒光或被分析細胞經特異性熒光標記染色后通過激光束激發后所產生的。因此，被分析細胞在制備成單細胞懸液后，經過與熒光染料染色后才能上機進行檢測。第48頁，共74頁，2023年，2月20日，星期一第四節流式細胞儀應用的技術要求

三、流式細胞儀操作技術的質量控制在臨床檢測中，應對各個工作環節和儀器性能進行嚴格的質量控制和規范化操作，以保證各項檢測數據和指標的可靠性。

1．光路與流路校正

2．PMT校準

3．絕對計數的校準第49頁，共74頁，2023年，2月20日，星期一第四節流式細胞儀應用的技術要求

1．光路與流路校正主要目的在于確保激光光路與樣品流處于正交狀態，使儀器檢測時的變異減少到最小，從而控制儀器的CV值。在流路校正物中，有標準大小的熒光微球，其物理性質、生物學特性和化學特性均經過標定。

第50頁，共74頁，2023年，2月20日，星期一第四節流式細胞儀應用的技術要求

2．PMT校準

流式細胞儀在使用過程中，光電倍增管隨時間的增加，其放大功率會有所改變，對樣品檢測的靈敏度會產生影響。為保證樣品檢測時儀器處于最佳工作狀態，采用質控品進行PMT校準，必要時進行電壓補償。第51頁，共74頁，2023年，2月20日，星期一第四節流式細胞儀應用的技術要求

3．絕對計數的校準

為保證儀器在計數時的準確性，儀器應采用絕對計數標準品建立絕對計數標準。該標準品是經標定的，如以計算1000個細胞為1ml，作為設定標準。在樣本測定時，以此為標準進行絕對計數，從而獲得絕對計數的標準值。第52頁，共74頁，2023年，2月20日，星期一第五節FCM的維護及常見故障的排除一、儀器的維護1.激光電源的波動范圍應小于±10%。2.冷卻水須用過濾器，并保證壓力和流量。3.室溫在18℃～24℃，相對濕度小于85%。4.安裝單獨的可靠的地線。5.儀器操作必須有經過培訓的人員操作。6.樣品和鞘液管道每周應用漂白粉液清洗。第53頁，共74頁，2023年，2月20日，星期一第五節FCM的維護及常見故障的排除故障信息引起故障的原因解決方法清洗液高度錯誤清洗液少了加清洗液清洗液高度警示清洗液傳感器失靈與公司聯系數據處理速率錯誤數據太大，難以處理稀釋樣品文件名錯誤輸入的文件名與系統沖突輸入另一個文件名二、常見故障及排除第54頁，共74頁，2023年，2月20日，星期一第五節FCM的維護及常見故障的排除故障信息引起故障的原因解決方法存取數據時發生錯誤流式細胞儀不能存取數據關開計算機重試程序錯誤軟件不能執行該程序選擇主菜單上的重建項程序號太大程序號不能大于32取消一些程序，再輸入相應號碼沒有激光束激光器關閉檢查電源，開激光器二、常見故障及排除第55頁，共74頁，2023年，2月20日，星期一第五節FCM的維護及常見故障的排除故障信息引起故障的原因解決方法激光器開啟錯誤

激光器門打開

關激光器門

參數太多

選擇的參數應小于8個

取消某些參數，重新選擇

參數不存在

程序中無此參數

重新建立程序

二、常見故障及排除第56頁，共74頁，2023年，2月20日，星期一第五節FCM的維護及常見故障的排除故障信息引起故障的原因解決方法樣品壓力錯誤因為樣品管壞了，樣品不能被壓入流動室換一個樣品管建立樣品壓力錯誤流式細胞儀連接錯誤檢查連接，開關機重試鞘液高度錯誤鞘液太少補充鞘液二、常見故障及排除第57頁，共74頁，2023年，2月20日，星期一第六節流式細胞儀的臨床應用六、FCM對自身免疫性疾病HLA抗原的分析二、流式細胞儀在血液學中的應用三、流式細胞儀在細胞生物學中的應用四、流式細胞儀在腫瘤學中的應用五、流式細胞儀在AIDS病檢測中的分析七、流式細胞儀在藥物學方面的應用一、流式細胞儀在免疫學中的應用第58頁，共74頁，2023年，2月20日，星期一第六節流式細胞儀的臨床應用一、流式細胞儀在免疫學中的應用流式細胞術廣泛地應用于免疫理論研究及其臨床實踐，所以有人稱之為現代免疫技術基石之一。尤其同單克隆抗體的結合應用，在淋巴細胞及其亞群分析、淋巴細胞功能分析、免疫分型、分選、腫瘤細胞的免疫檢測、研究細胞周期等方面都起著相當重要的作用。第59頁，共74頁，2023年，2月20日，星期一第六節流式細胞儀的臨床應用二、流式細胞儀在血液學中的應用血液病多為腫瘤性、免疫性和遺傳性疾病，惡性血液病約占其總數一半以上。FCM在血液細胞的分類、分型，造血細胞分化的研究，血細胞中各種酶的定量分析，如過氧化物酶、非特異性酯酶等方面應用廣泛。第60頁，共74頁，2023年，2月20日，星期一第六節流式細胞儀的臨床應用三、流式細胞儀在細胞生物學中的應用細胞生物學研究中，應用最頻繁也最普通的是細胞周期分析，研究細胞周期或DNA倍體與細胞表面受體及抗原表達的關系，包括細胞周期各時相的百分比和細胞周期動力學參數的測定等內容。對同一細胞的參數測定技術則導致了對細胞周期的一些新發現，典型的方法是吖啶橙雙染色技術。

第61頁，共74頁，2023年，2月20日，星期一第六節流式細胞儀的臨床應用四、流式細胞儀在腫瘤學中的應用近年來熒光細胞化學技術的發展，以及熒光探針標記的單克隆抗體，為流式細胞技術研究各種腫瘤抗原、腫瘤蛋白、致癌基因開辟了新途徑，極大地提高了腫瘤學的研究水平，并為流式細胞技術在腫瘤學的研究中開辟了更廣闊的應用前景。第62頁，共74頁，2023年，2月20日，星期一第六節流式細胞儀的臨床應用五、流式細胞儀在AIDS病檢測中的分析流式細胞術用于AIDS免疫功能的檢測是最重要的檢測手段，采用三參數熒光標記計數可對T淋巴細胞及亞群進行分析，并通過動態監測T細胞亞群可以對HIV感染者或AIDS發病者進行區別。

第63頁，共74頁，2023年，2月20日，星期一第六節流式細胞儀的臨床應用六、FCM對自身免疫性疾病HLA抗原的分析利用FCM可以進行HLA-B27／HLA-B7雙標記抗體檢測HLA-B27陽性細胞，同時又可排出交叉反應。通常58％～97％的強直性脊柱炎患者可檢出這種抗原，而正常人僅2％～7％可檢出這種抗原。FCM檢測HLA-B27快速、特異、敏感，為強制性脊柱炎的臨床診斷提供了有力的幫助。第64頁，共74頁，2023年，2月20日，星期一第六節流式細胞儀的臨床應用七、流式細胞儀在藥物學方面的應用流式細胞儀在檢測藥物在細胞中的分布，研究藥物的作用機制方面應用廣泛。亦可用于篩選新藥，如化療藥物對腫瘤細胞的凋亡機制，可通過測DNA凋亡峰，Bcl-2凋亡調節蛋白等進行觀察。第65頁，共74頁，2023年，2月20日，星期一本章小結

本章簡要介紹了流式細胞術和流式細胞儀的基本概念。論述了流式細胞儀的基本原理、流式細胞儀的分類和基本結構、主要性能指標、操作技術的質量控制、流式細胞儀的維護及常見故障的排除以及流式細胞儀的臨床應用。第66頁，共74頁，2023年，2月20日，星期一本章小結

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