生物系統中mRNA或DNA等目標核酸分子的分析(fēnxī)鑒定必須答復如下三個根本問題：目標核酸分子是否存在于實驗標本中。實驗標本中目標核酸分子的含量是多少。實驗標本中目標核酸分子的序列如何；以及與其他實驗標本中的情況比較，目標核酸分子的序列是否有變化。核酸(hésuān)實驗研究技術進展－1第一頁，共46頁。1證明目標核酸分子是否存在于實驗標本中的根本(gēnběn)實驗方法：1〕雜交法，2〕PCR法，3〕測序法。核酸實驗(shíyàn)研究技術進展－1第二頁，共46頁。2雜交(zájiāo)法：序列，同時還要合成一個標記了的特異性探針。Dotblotting：不經過電泳，直接把檢測樣本點在一個適宜載體上，針對目標DNA分子或RNA分子進行雜交(zájiāo)檢測。Southernblotting：在電泳后，針對目標DNA分子的雜交(zájiāo)檢測。Northernblotting：在電泳后，針對目標RNA分子的雜交(zájiāo)檢測。目標DNA分子原位雜交(zájiāo)檢測。目標RNA分子原位雜交(zájiāo)檢測。核酸實驗(shíyàn)研究技術進展－1第三頁，共46頁。3雜交法的優點與缺點：優點：Dotblotting：簡單實用，適于進行大樣本數同時檢測。Northernblotting：如果檢測結果陽性，其可信度要遠遠高于RT-PCR，因此被譽為評價基因轉錄的GoldenMarker。Southernblotting：對DNA病毒類病原體等的檢測實用性很強。缺點：Dotblotting：由于在同一斑點位置，除了(chúle)目標核酸分子外，同時還存在其它的成千上萬種不同的核酸分子，而這些核酸分子有可能會與探針分子局部結合，這會促進探針分子與目標核酸分子的結合，因此將可能導致陽性結果放大，甚至是假陽性結果。Northernblotting：對低拷貝mRNA有時檢測不出來，容易導致假陰性結果。核酸實驗研究技術(jìshù)進展－1第四頁，共46頁。4例一：cDNAmicroarray檢測(jiǎncè)SHEEC食管癌細胞NGAL基因mRNA轉錄實驗結果反向(fǎnxiànɡ)Dotblotting核酸實驗(shíyàn)研究技術進展－1第五頁，共46頁。5例二：Northernblotting檢測SHEEC食管癌細胞NGAL基因轉錄mRNA實驗(shíyàn)結果NGAL化學發光法核酸(hésuān)實驗研究技術進展－1第六頁，共46頁。6例三：Northernblotting檢測缺氧復氧條件(tiáojiàn)下心肌細胞EGR1基因轉錄mRNA實驗結果EGR1同位素法核酸實驗(shíyàn)研究技術進展－1第七頁，共46頁。7確保雜交法實驗成功的八個關鍵點：關鍵點1：確保實驗方案設計合理。關鍵點2：確保探針的特異性充分。關鍵點3：確保檢測的靈敏度足夠高。關鍵點4：確保樣本質量合格。關鍵點5：確保實驗試劑質量合格。關鍵點6：確保實驗過程標準。關鍵點7：對于編碼序列的cDNA，要確保沒有(méiyǒu)RNA的干擾。關鍵點8：幾種雜交法，或雜交法與其它方法聯合使用，相互印證，確保實驗結果可靠。核酸實驗研究技術(jìshù)進展－1第八頁，共46頁。8PCR法：序列，同時(tóngshí)還要合成一對特異性引物。核酸實驗(shíyàn)研究技術進展－1優點：實驗的靈敏度很高，理論上可檢測實驗生物(shēngwù)系統中所存在的1個拷貝目標核酸分子。陰性結果的可信度很高。缺點：由于容易存在樣本污染情況，與此同時，畢竟在實驗過程中存在著目標核酸分子拷貝數人為放大這樣一個事實，因此，其陽性結果的可信度不如Northernboltting或Southernboltting。第九頁，共46頁。9例子：RT-PCR檢測SHEEC食管癌細胞(xìbāo)NGAL基因轉錄mRNA實驗結果NGAL600bpSMS:食管癌細胞(xìbāo)SHEECM:DNAmarker核酸(hésuān)實驗研究技術進展－1第十頁，共46頁。10核酸實驗研究(yánjiū)技術進展－1確保PCR法實驗成功的八個關鍵點：關鍵點1：確保實驗方案設計合理。關鍵點2：確保引物的特異性充分。關鍵點3：確保樣本質量合格。關鍵點4：確保實驗試劑質量。關鍵點5：確保實驗過程標準。關鍵點6：確保PCR變性、退火和延伸溫度適度。關鍵點7：對于編碼序列cDNA，要確保沒有RNA的干擾。關鍵點8：幾種PCR法，或PCR法與其它方法聯合使用(shǐyòng)，相互印證，確保實驗結果可靠。第十一頁，共46頁。11核酸實驗研究(yánjiū)技術進展－1測序法：通過電泳等手段實驗生物系統中目標核酸的大致大小，而且是對照生物系統中不存在，或者兩者相比在含量上可能有顯著差異，然而(ránér)序列未知。優點：可信度最高。對于解析鑒定未知核酸分子序列片段(piànduàn)是必需的手段。缺點：目標片段(piànduàn)邊緣序列的測定結果有時不準確，在讀原初測序圖時要格外小心。第十二頁，共46頁。12核酸實驗(shíyàn)研究技術進展－1目標片段邊緣序列的測定結果有時不準確(zhǔnquè)例子第十三頁，共46頁。13PolyAtail核酸實驗研究技術(jìshù)進展－1第十四頁，共46頁。14核酸實驗(shíyàn)研究技術進展－1第十五頁，共46頁。15核酸實驗(shíyàn)研究技術進展－1測定(cèdìng)實驗標本中目標核酸分子的含量第十六頁，共46頁。16核酸實驗研究技術(jìshù)進展－1通過Dotblotting，結合斑點光密度掃描分析(fēnxī)，測定實驗標本中目標mRNA分子、目標cDNA分子或目標DNA分子的含量第十七頁，共46頁。17A永生(yǒngshēng)化食管上皮細胞SHEEB食管癌細胞(xìbāo)SHEEC例子(lìzi)：cDNAmicroarray〔反向Dotblotting〕檢測SHEEC食管癌細胞與永生化食管上皮細胞SHEE中NGAL基因轉錄mRNA相對含量實驗結果判斷標準：B/A2或為顯著性差異表達實際情況：核酸實驗研究技術進展－1第十八頁，共46頁。18核酸(hésuān)實驗研究技術進展－1通過RT-PCR，結合條帶光密度掃描分析(fēnxī)，測定實驗標本中目標mRNA分子或目標cDNA分子的含量第十九頁，共46頁。19例子：RT-PCR檢測SHEEC食管癌細胞與永生化食管上皮細胞SHEE中NGAL基因轉錄mRNA相對含量實驗(shíyàn)結果NGAL600bpABMA:永生化食管(shíguǎn)上皮細胞SHEEB:食管(shíguǎn)癌細胞SHEECM:DNAmarkerABMGAPDH226bp核酸實驗研究技術(jìshù)進展－1第二十頁，共46頁。20兩個問題：

反轉錄PCR實驗(shíyàn)是否需要探針？

反轉錄PCR的特異性如何保證？核酸實驗(shíyàn)研究技術進展－1第二十一頁，共46頁。21核酸(hésuān)實驗研究技術進展－1通過Northernblotting，結合條帶光密度掃描分析，測定(cèdìng)實驗標本中目標mRNA分子的含量第二十二頁，共46頁。22例一：Northernblotting檢測SHEEC食管癌細胞與永生化食管上皮細胞SHEE中NGAL基因(jīyīn)轉錄mRNA相對含量實驗結果〔化學發光〕NGALABA:食管癌細胞(xìbāo)SHEECB:永生化食管上皮細胞(xìbāo)SHEEABGAPDHABAB500-400-300-200-100-100-80-60-40-20-核酸實驗研究(yánjiū)技術進展－1第二十三頁，共46頁。23核酸實驗(shíyàn)研究技術進展－1例二：Northernblotting檢測缺氧復氧條件(tiáojiàn)下心肌細胞EGR1基因轉錄mRNA相對含量實驗結果(同位素標記法)1正常2缺氧復氧3缺氧復氧＋溶劑(róngjì)對照4缺氧復氧＋F25缺氧復氧＋鈣離子拮抗劑1234512345EGR1-Actin第二十四頁，共46頁。24核酸實驗(shíyàn)研究技術進展－1通過Southernblotting，結合條帶光密度掃描分析，測定實驗(shíyàn)標本中目標DNA分子的含量第二十五頁，共46頁。25核酸實驗研究技術(jìshù)進展－1通過Southernblotting，結合條帶光密度掃描(sǎomiáo)分析，測定實驗標本中目標DNA分子的含量第二十六頁，共46頁。26核糖核酸酶保護分析〔RibonucleaseProtectionAssay，RPA〕是一種較好的mRNA定量(dìngliàng)檢測技術。RPA的各項實驗指標均優于NorthernBlotting。運用RPA可實現對目標RNA分子的高通量定量(dìngliàng)檢測。核糖核酸酶保護(bǎohù)分析RibonucleaseProtectionAssay(RPA)核酸實驗(shíyàn)研究技術進展－1第二十七頁，共46頁。27原理：以目標基因DNA為模板(múbǎn)，利用32P-〔放射法〕或生物素〔非放射法〕作為標記信號，體外轉錄合成反義RNA探針。將過量的反義RNA探針與樣品總RNA雜交，然后進行核糖核酸酶處理。未與探針雜交的單鏈RNA和過量的游離探針被降解，而目標RNA那么因與探針結合形成雙鏈而被‘保護’。雜交雙鏈進行變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，用放射自顯影或化學發光等方法確定目標RNA的量。核酸實驗(shíyàn)研究技術進展－1第二十八頁，共46頁。28核酸(hésuān)實驗研究技術進展－1第二十九頁，共46頁。29核酸實驗研究(yánjiū)技術進展－1適時熒光(yíngguāng)定量PCRRealtimefluorescentquantitationPCR第三十頁，共46頁。30適時熒光定量PCR與常規PCR的本質區別常規PCR技術：對PCR擴增反響的終產物進行定性(dìngxìng)定量或半定量分析適時熒光定量PCR技術：通過一個特殊的熒光探針，對PCR擴增反響中每一次循環的產物進行適時跟蹤定量分析核酸(hésuān)實驗研究技術進展－1第三十一頁，共46頁。31realtimePCR的擴增曲線(qūxiàn)核酸實驗研究技術(jìshù)進展－1第三十二頁，共46頁。32PE公司(ɡōnɡsī)在同一臺PCR儀上對相同模板進行96次擴增的擴增曲線圖Ct值極具重現(zhònɡxiàn)性核酸實驗(shíyàn)研究技術進展－1第三十三頁，共46頁。33Ct與初始(chūshǐ)模板的關系固定循環數后，熒光信號值與模板數成正比固定熒光信號值后，循環數與初始模板數成反比。初始模板數越多,熒光信號到達閾值時所需要的循環數(Ct值)越少起始模板濃度的對數(duìshù)與Ct呈線性關系，根據樣品的Ct值就可計算出樣品中所含的初始模板數。Threshold104103102核酸實驗(shíyàn)研究技術進展－1第三十四頁，共46頁。34常用(chánɡyònɡ)的定量PCR熒光探針SYBRGreenITaqman水解探針分子信標核酸實驗(shíyàn)研究技術進展－1第三十五頁，共46頁。35SYBRGreenI結合(jiéhé)到雙鏈DNA的小溝部位只有和雙鏈DNA結合(jiéhé)后才發熒光核酸實驗(shíyàn)研究技術進展－1第三十六頁，共46頁。36SYBRGreenI工作(gōngzuò)原理未結合(jiéhé)的SYBRgreenI核酸實驗研究技術(jìshù)進展－1第三十七頁，共46頁。37SYBRGreenI的優點(yōudiǎn)價格相對廉價使用簡便可以用于不同的模板靈敏度很高SYBRGreenI的缺點特異性較差核酸(hésuān)實驗研究技術進展－1第三十八頁，共46頁。38TaqManProbes熒光素淬滅劑

與目標序列互補FAMTETJOEHEXVIC

TAMRADABCYL核酸實驗(shíyàn)研究技術進展－1第三十九頁，共46頁。39TaqManProbes工作(gōngzuò)原理探針與目標序列配對，熒光基團(jītuán)與熒光淬滅劑相鄰，不發生特異熒光光能量轉移Taq游離的探針熒光基團

淬滅劑

延伸時，Taq酶水解探針，熒光基團(jītuán)與熒光淬滅劑別離，發出特異熒光。Taq發出特異熒光光另一波長的熒光核酸實驗研究技術進展－1第四十頁，共46頁。40TaqManProbes的優點：定量關系準確(zhǔnquè)。隨著擴增循環數增加，TaqMan探針釋放出來的熒光基團成倍增加，熒光強度與擴增產物的數量呈正比關系。TaqMan探針特別適合于病毒定量、基因轉錄水平定量、癌細胞基因微突變檢測等。