DNA的基本分子生物學操作

（表達載體的構建）胥慧2009.9現在是1頁\一共有40頁\編輯于星期日如何研究某個基因的功能?遺傳學

突變體

基因缺失或下調過量表達體內/體外生化反應基因轉入及表達!現在是2頁\一共有40頁\編輯于星期日表達載體的構建btbk轉化E.coli構建正確的質粒酶切鑒定轉化粗糙脈孢菌Western檢測表達BTBK的菌株現在是3頁\一共有40頁\編輯于星期日表達載體構建流程零、策略的設計一、PCR擴增基因二、乙醇沉淀基因三、酶切基因及載體四、瓊脂糖凝膠電泳回收基因及載體五、連接六、轉化大腸桿菌七、質粒的小量提取八、PCR/酶切鑒定及測序九、質粒的大量提取現在是4頁\一共有40頁\編輯于星期日/annotation/genome/neurospora/查找基因現在是5頁\一共有40頁\編輯于星期日查找基因現在是6頁\一共有40頁\編輯于星期日設計引物引物長度：18-22ntGC含量（DNAMANhybrid:50~60℃）DNAMAN檢查：游離3’端>8bp以G/C結尾酶切位點的選擇（巧用平端酶）保護堿基負義鏈引物注意反向考察是否移碼EcoRV(buffer3)HpaI(4)ScaI(3)SmaI(4)SnaBI(4)StuI(214)現在是7頁\一共有40頁\編輯于星期日一、PCR

（Phusion/Taq）5XHFbuffer:10μlNEBdNTPs:0.5μl

Phusion:0.4

μl

Primer1:0.5μl

Primer2:0.5μl

Template:1μl

ddH2O:37.1μl

98℃1min98℃10sec25X55℃30sec72℃1min72℃10min10℃∞Notes:1.Phusion酶的擴增效率為每分鐘2~4kb.2.最后加酶！現用現取，取出冰浴。現在是8頁\一共有40頁\編輯于星期日一、PCR10XPCRbuffer:5μlMgCl2:3μldNTPs:0.5μl

Taq:1μl

Primer1:0.5μl

Primer2:0.5μl

Template:1μl

ddH2O:38.5μl

94℃5min94℃30sec30X55℃30sec72℃2min72℃10min10℃∞請愛護PCR儀！反應完及時取出；散熱5分鐘；嚴禁過夜。現在是9頁\一共有40頁\編輯于星期日問題篇P不出來：

從自己操作檢查起；負義鏈引物是否忘記反向了；退火溫度是否合適（考慮降溫）；換模板；換Taq試；重設引物。大于5kb的基因考慮分兩段。

量太少：

增大模板量；降溫；多P幾管。非特異條帶：

若目的條帶比非特異亮，大膽升溫；若非特異比目的帶大，嚴格控制延伸時間；膠回收目的帶作模板再PCR。大小不對：

溫度；模板；重設引物。現在是10頁\一共有40頁\編輯于星期日二、乙醇沉淀DNA1.合并PCR產物，用TEbuffer將體系擴大至200μl，混勻。加入2~2.5V無水乙醇、1/10V醋酸鈉(3M,pH5.2)，混勻。2.置于-80℃30min以上,或者，液氮速凍。3.4℃12000rpm離心15min，倒掉上清。4.70%乙醇洗沉淀，吸盡上清，烘干。5.以適量ddH2O溶解DNA。Notes:離心后迅速倒掉乙醇，切忌反復看到底有沒有沉淀；可加完70%乙醇后再適當離心；烘干后保持EP管豎直向上；充分溶解DNA。現在是11頁\一共有40頁\編輯于星期日三、酶切做酶切前必須研究NEB產品目錄！EcoRI現在是12頁\一共有40頁\編輯于星期日25度的50度的、60度的……三、酶切現在是13頁\一共有40頁\編輯于星期日三、酶切現在是14頁\一共有40頁\編輯于星期日酶切反應體系50μl體系5μl體系buffer1/2/3/4/U:5μl0.5μlDNA:xμlaμl

Enzyme:1.5~2μl0.3μl

ddH2O:補足三、酶切現在是15頁\一共有40頁\編輯于星期日反應的溫度:

大多數酶的最適反應溫度是37℃。25℃酶：ApaISmaI50℃酶：反應時間:（NEB快速酶切產品:5min）一般2h。若切末端的幾個堿基，延長時間。研究NEB產品目錄！三、酶切現在是16頁\一共有40頁\編輯于星期日三、酶切現在是17頁\一共有40頁\編輯于星期日雙酶切不同反應溫度的酶不可以作雙酶切。若兩者buffer相同，先切低溫酶，再切高溫酶；若buffer不同，用分步單酶切。參照NEB雙酶切表選擇buffer。考察兩個酶在建議的buffer中的活性，一般認為活性75%及以上是可取的。不同buffer的酶用分步單酶切代替雙酶切。即酶1切乙醇沉淀酶2切，再膠回收。分步酶切質粒時，若兩個酶切位點是緊臨的，則需考慮留出足夠的保護堿基。三、酶切----TTGATGAATTCCTGCAGCCC--------AACTACTTAAGGACGTCGGG----EcoRIPstI現在是18頁\一共有40頁\編輯于星期日酶的星活力：

在非標準條件下切割非特異序列產生非特異片段。產生星活力的原因：甘油>5%；pH>8.0；乙醇殘留…應對方法：嚴格按照NEB產品目錄（buffer、適合的酶量、溫度、時間1~8h）三、酶切現在是19頁\一共有40頁\編輯于星期日注意事項----愛惜、珍惜每一點酶！加酶時才去取酶，始終保持酶在冰上，加完酶迅速放回-20℃！酶必須深埋入-20℃的冰盒！（清理冰霜）舊酶用完后“涮”管子；保持同一種酶只有一管。新酶用前離心（甩）一下。蓋子和標簽一一對應，不要蓋錯。三、酶切現在是20頁\一共有40頁\編輯于星期日四、膠回收瓊脂糖凝膠（Agarose）

Agarose濃度分離范圍0.7%0.8~12kb1.0%0.5~10kb1.2%0.4~7kb緩沖液:TAE

貯液：50X工作：1X制0.8%膠：0.8gAgarose100ml1XTAE本實驗室常用：0.8%(500bp~10kb)低濃度膠2%(<1.5kb)高濃度膠微波化膠降溫加5μlEB現在是21頁\一共有40頁\編輯于星期日電壓：5V/cm本實驗室：膠回收用90V；檢測用120V。電泳方向：

DNA向正極泳動；EB向負極泳動。（跑過的膠的剩孔不宜直接再用）DNA染料EB：高度靈敏的熒光染色劑302nm366nm紫外可嵌入DNA堿基間的三環平面基團1EB/2.5個堿基加入：①直接加入膠中；②電泳后染色。配置：貯液10mg/ml；工作0.5ug/ml。5ulEB/100ml膠紫外透射反射儀：長波360nm回收用短波254nm四、膠回收現在是22頁\一共有40頁\編輯于星期日Loadingbuffer（6X）配制6Xloadingbuffer：0.25%溴酚蘭0.25%二甲苯青30%甘油or40%蔗糖6XTAEddH2O上樣時5ulDNA+1ulloadingbuffer作用：①增加密度，使DNA沉降；②指示前沿在0.8%Agarose，溴酚蘭約相當于0.5kb的DNA位置；二甲苯青約相當于5kb的DNA位置。四、膠回收現在是23頁\一共有40頁\編輯于星期日Marker四、膠回收現在是24頁\一共有40頁\編輯于星期日回收膠：配新膠（厚度適中）；換新電泳緩沖液。切膠時盡量少帶空膠清洗刀片四、膠回收現在是25頁\一共有40頁\編輯于星期日回收方法：液氮凍融法QIAGEN膠回收試劑盒Roche羅氏Transgene全氏Notes：1.溶膠后涼至室溫，加1V的異丙醇有助于提高回收效率。2.溶膠液重復過柱2~3次。3.最后洗脫DNA之前稍微干燥一下柱子。4.洗脫DNA用35~50ulMillipore水，如有必要可重復洗。四、膠回收現在是26頁\一共有40頁\編輯于星期日跑膠檢測兩個片段的濃度連接反應兩個片段的比例：摩爾比vector:insert=1:3即:=1:3例如設需要vector為xul，跑膠估測濃度80ng/3ul，大小為5.2kb；需要insert為yul，跑膠估測濃度120ng/3ul，大小為1kb。則:=1:3

五、連接nginsertkbinsertngvectorkbvector80x

5.2120y

1現在是27頁\一共有40頁\編輯于星期日連接酶E.coliDNAligaseT4噬菌體DNAligase√保存:-20℃冰上最多5~10min!!現用現取，用完立即放回！T4buffer：250mMTris·Cl(pH7.6)50mMMgCl25mMATP5mMDTT25%PEG8000五、連接現在是28頁\一共有40頁\編輯于星期日反應體系T4buffer:0.5ulvector:xulinsert:yulT4ligase:0.4ul

25℃1h,then4℃1h.（T4連接酶4~25℃均可）T4連接酶效率很高，不需要懷疑。五、連接x+y=4.1ul現在是29頁\一共有40頁\編輯于星期日六、轉化受體菌：JM109超級感受態----轉化效率高；生長快。70L感受態細胞中加入5LDNA，混勻，冰浴30min；42℃熱激90秒，快速將管轉移到冰上冷卻3～5min；加入800L液體LB培養基，混勻，37℃搖床慢搖（100~110rpm）45min使細菌復蘇，并表達質粒編碼的抗生素抗性基因；3000rpm離心10min。移除750ul左右的上清，輕柔重懸細胞，將其涂布到含相應抗生素（Amp）的LB平板上。37℃倒置培養，10~16h后可出現菌落。（如檢查氨芐青霉素抗性，用轉化細胞鋪平板時細菌密度應較低，培養時間不應超過20h，否則會出現對氨芐青霉素敏感的衛星菌落）。*若轉化質粒，第4步不用離心，直接取10~50ul細胞涂板。現在是30頁\一共有40頁\編輯于星期日七、小提質粒離心收集菌體，盡量除盡培養基；加100L冰預冷的溶液Ⅰ，Vortex劇烈振蕩；加200L新配制的溶液Ⅱ，加150L冰預冷的溶液Ⅲ，溫和顛倒5次；12000rpm離心5min，轉移上清到新管中；加2倍體積的無水乙醇沉淀DNA；12000rpm離心7min，倒掉上清；70%乙醇洗滌沉淀，吸盡上清，干燥；用30~50L含RNaseA的ddH2O溶解沉淀。（如果是過夜搖菌，則最后用50L。如果是白天搖菌，則用30L。）現在是31頁\一共有40頁\編輯于星期日八、質粒的鑒定PCR：P插入片段酶切鑒定測序（Invitrogen公司。可測菌液/質粒/PCR產物）現在是32頁\一共有40頁\編輯于星期日酶切鑒定：酶的選擇載體和插入片段上都有的酶可判斷出片段插入方向（靠近片段一側）酶切產生的條帶數為2~3條，不宜太多不宜有<500bp的小條帶優選價格便宜的酶：EcoRV;EcoRI…鑒定用MBI的酶；5或10ul體系；0.3ul酶八、質粒的鑒定現在是33頁\一共有40頁\編輯于星期日九、大提質粒50ml菌液分裝到24個離心管，分兩次離心收集菌體，盡量除盡培養基；加100L冰預冷的溶液Ⅰ，Vortex劇烈振蕩；加200L新配制的溶液Ⅱ，加150L冰預冷的溶液Ⅲ，溫和顛倒5次；12000rpm離心5mi