蛋白組學二維電泳第1頁，共25頁，2023年，2月20日，星期二第二章二維電泳與蛋白質分離一、蛋白質的提取與樣品制備二、二維等電聚焦-SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳維等電聚焦電泳三、膠上蛋白質檢測技術第2頁，共25頁，2023年，2月20日，星期二蛋白質染色方法膠內：考馬斯亮藍R-250(CBBR-250)、CBBG-250、銀染、負染、熒光染料染色以及放射性同位素標記等轉移到膜（PVDF、硝酸纖維素膜）上：酰胺黑(AmidoBlack)、麗春紅S(PonceauS)第3頁，共25頁，2023年，2月20日，星期二（一）考染（考馬氏亮藍染色）1、考馬氏亮藍與蛋白質反應機理

考馬氏亮藍（Coomassiebrilliantblue）是一類三苯基甲烷衍生物。分為R-250（紅蘭色）、R-350（紅蘭色）、G-250（藍綠色），它們與蛋白質結合生成深藍色復合物，在464-595nm有吸收峰（595nm最大），且在比較寬的范圍內（15-20μg

）掃描峰的面積與蛋白質量成線性關系，因此可在595nm對蛋白質進行定量檢測，而且在一定pH條件下，這種染料-蛋白質復合物被完全解聚。

2、考染機理

膠體內染料和溶液中自由擴散染料間形成平衡后，溶液中少量自由染料穿透凝膠基質，有選擇性地對蛋白質進行染色，而膠體態的染料排阻在膠外，阻止了背景的生成。膠內蛋白質染色的關鍵是讓蛋白質染色，而膠體不染色。第4頁，共25頁，2023年，2月20日，星期二CoommassieBrilliantBlueG-250第5頁，共25頁，2023年，2月20日，星期二3、考染程序考染程序至少600多種，主要變換是將以下程序中的醋酸換成三氯乙酸、磷酸或高氯酸，但三氯乙酸易使谷氨酸羧基側鏈不可逆酯化，造成肽譜數據復雜化。

（1）固定：凝膠浸泡于50%乙醇+10%冰醋酸水溶液中，至少1h，可過夜。

（2）染色：凝膠浸泡于染色液中至少2h。染色液組成：45%甲醇+10%冰醋酸+0.25%考馬氏亮藍G-250，混均過濾。

（3）脫色：多次更換脫色液，直至背景脫凈，稍稍提高溫度可加快脫色。脫色液組成：25%乙醇+8%冰醋酸。

（4）保存：凝膠脫色后水洗掃描備份，用保鮮膜包裹，一個月內進行質譜鑒定；長時間保存需將蛋白點切下，進一步脫色后貯于-80℃。第6頁，共25頁，2023年，2月20日，星期二4、考染特點

（1）可以獲得無背景或低背景的圖譜；

（2）染色過程需24-48h，所需時間較長；

（3）靈敏度不高，為100-10ng，只能檢測10-100ng的蛋白質，低豐度的蛋白質難以顯色。第7頁，共25頁，2023年，2月20日，星期二（二）銀染1、原理：堿性銀氨（Ag(NH3)2+）染色法和酸性硝酸銀（AgNO3）染色法。

酸性硝酸銀染色法的原理是一個照相的過程，凝膠在酸性環境下與硝酸銀溫育，銀離子附與蛋白質表面，然后在堿性環境下里用福爾馬林還原成金屬銀。

堿性銀氨染色法的原理是用氨水來形成銀氨復合物，銀氨復合物與膠內SDS-蛋白質復合物結合，然后在酸性條件下用福爾馬林將銀氨還原成金屬銀。第8頁，共25頁，2023年，2月20日，星期二2、特點（1）酸性銀染染色背景淺、容易控制，對酸性蛋白質的染色靈敏度稍高，堿性銀染靈敏度稍高，但背景深、不容易控制。

（2）相對于考染，靈敏度高，可達200pg。

（3）但由于存在戊二醛的特異性反應，對下一步的酶切肽譜提取存在困難；增敏過程蛋白質被部分提取至膠外。第9頁，共25頁，2023年，2月20日，星期二3、程序1.分析型銀染（不能用于質譜鑒定）

(1)水洗膠5min；

(2)40%乙醇，10%乙酸固定1hr；

(3)5%乙醇，5%乙酸固定過夜；

(4)水洗20min兩遍；

(5)5%戊二醛

1hr；

(6)水洗30min四遍；

(7)250mL新鮮配制的銀氨液(1mLNaOH與5mL飽和氨水混合再加10mL20%AgNO3)/膠45min；

(8)水洗3min三遍；

(9)1.5mL1%檸檬酸、125μL37%甲醛/膠顯色；

(10)5%乙酸停顯10min；

(11)水洗10min三遍。第10頁，共25頁，2023年，2月20日，星期二2.快速銀染（和質譜鑒定相匹配）第11頁，共25頁，2023年，2月20日，星期二（三）負染1、特點

（1）負染能提高SDS膠上蛋白質的回收率，常用有銅染、鋅-咪唑染等。負染色結果在凝膠表面產生半透明背景，而凝膠顯示黑色背景或相應底色，蛋白質以透明形式被檢測出來，而且蛋白質被很好地保存下來。

（2）顯色過程僅需5-15min

（3）蛋白質易從膠上取出，一般用EDTA絡合金屬離子就可轉移出蛋白質。

（4）靈敏度15ng

2、原理（鋅-咪唑染料）

咪唑存在時，自由或弱結合的鋅離子以鋅-咪唑形式沉淀下來，而大部分鋅離子因與蛋白質結合牢固而留在膠上，從而導致半透明背景上的空白區域，這就是負染過程。第12頁，共25頁，2023年，2月20日，星期二人肝癌細胞系MHCC97的部分雙向凝膠電泳鋅染圖譜第13頁，共25頁，2023年，2月20日，星期二鋅染程序(1)水洗1min；(2)0.2mol/L咪唑、0.1%SDS溶液10min；(3)0.2mol/L氯化鋅1min；(4)水洗5sec三遍；第14頁，共25頁，2023年，2月20日，星期二（四）熒光染色（Cy3和Cy5）1、原理：利用熒光染料對蛋白質進行標記，在光激發下產生熒光，通過掃描得到圖象。比如用甲基Cy3與甲基Cy5兩種染料分別對兩個不同蛋白樣品進行熒光標記，并在一塊2-DE膠上進行運行，由于兩種染料激發波長不同，掃描時可得到兩張有差異的圖象，因此可用于差異蛋白質組學研究。

2、特點

（1）靈敏度250pg與銀染相近，但線性范圍高于銀染。

（2）蛋白質被熒光共價修飾，改變了移動性能，降低了溶解性，導致質譜鑒定出現偏差。

（3）不同樣品由于所含蛋白質可被熒光修飾的功能基團數不一樣，靈敏度變化不一樣。第15頁，共25頁，2023年，2月20日，星期二二維電泳熒光檢測RedCy3GreenCy5第16頁，共25頁，2023年，2月20日，星期二（五）SYPRORuby熒光染色基于釕的金屬螯合染料檢測靈敏度0.5－1ng染色速度快，15min可完成線性動態范圍廣需要紫外或激光檢測系統和質譜檢測兼容第17頁，共25頁，2023年，2月20日，星期二總結染色方法靈敏度線性范圍與質譜兼容性費用硬件要求考染10ng3++++銀染200pg7+++負染15ng3++++熒光標記250pg104

+++++++++++第18頁，共25頁，2023年，2月20日，星期二二維電泳的圖象分析第19頁，共25頁，2023年，2月20日，星期二圖象分析對雙向電泳圖譜上的這些蛋白質點進行檢測、定量、比較、分析和歸類主要包括：圖象采集圖象分析：蛋白質點檢測、背景消除、蛋白點匹配、歸一化處理、數據輸出數據庫的建立第20頁，共25頁，2023年，2月20日，星期二圖象采集（imagecollection）透射掃描方式光密度掃描：考染、銀染、負染激光誘導熒光掃描：熒光染色第21頁，共25頁，2023年，2月20日，星期二蛋白點檢測（spotdetection）蛋白點定位、點形狀、點豐度參數設定：最模糊的點、最小的點、最大的點和膠的背景第22頁，共25頁，2023年，2月20日，星期二背景消減（backgroundsubtraction）凝膠染色（銀染和考染）很難保證沒有背景需要將背景去除，才能得到真正的蛋白質點的豐度人工消除邊界最低強度消減（沿檢測點邊界，取強度最低的點為背景）邊界平均象素值消減（取被檢測點邊界的平均強度為背景）非點模式第23頁，共25頁，2023年，2月20日，星期二歸一化處理（norma