食品微生物學第六章詳解演示文稿現在是1頁\一共有135頁\編輯于星期三優選食品微生物學第六章現在是2頁\一共有135頁\編輯于星期三傳統食品微生物檢測：以分離、純化、培養為基礎現代食品微生物檢測：新理論、新技術遺傳學特性、細胞組分、數值分類快速、靈敏、特異現在是3頁\一共有135頁\編輯于星期三第一節食品中微生物數量的檢測方法檢測食品中微生物總數的方法：1）活細胞的標準平板計數法（Standardplatecount,SPC）2）最近似數測定法（mostprobablenumber,MPN）現在是4頁\一共有135頁\編輯于星期三檢測食品中微生物總數的方法：3）染色還原技術估算具有還原能力的各種細胞的總數4）顯微鏡直接計數法（DMC）現在是5頁\一共有135頁\編輯于星期三一、傳統的SPC方法活細胞的標準平板計數法（Standardplatecount,SPC）菌落總數計數法“活菌”標準方法意義：判定食品被微生物污染的程度及衛生質量，也可觀察微生物在食品中生長繁殖的動態。現在是6頁\一共有135頁\編輯于星期三菌落總數：在一定條件下（需氧、溫度、時間、pH…)每克（每毫升）食品檢驗所生長出來的CFU（菌落形成單位）。現在是7頁\一共有135頁\編輯于星期三國標規定：在需氧條件下：細菌NA37℃48h霉菌酵母PDA25~28℃5天現在是8頁\一共有135頁\編輯于星期三測定方法

檢測樣品的處理稀釋傾注（涂布）瓊脂平板計數報告現在是9頁\一共有135頁\編輯于星期三（一）樣品采集1、采樣原則：代表性防止污染2、采樣的種類：大樣一整批樣品中樣200g小樣分析的樣品（檢樣）25g現在是10頁\一共有135頁\編輯于星期三3、采樣方法：

無菌操作采樣用具必須無菌盡量采集有包裝的食品粉末狀樣品邊取樣邊混合液體樣品邊振搖邊混合冷凍食品保持冷凍狀態非冷凍食品保存在0~5℃

現在是11頁\一共有135頁\編輯于星期三4、采樣數量和部位：

200g/件乳制品一瓶（個、罐、聽）糧三層五點（表、中、下）油重點采取表層及底層油5、采樣標簽：名稱來源數量編號時間..（二）送檢從采樣到實驗室越快越好

不得超過3h現在是12頁\一共有135頁\編輯于星期三（三）樣品的處理和稀釋1）取樣無菌操作25g放入225mL滅菌生理鹽水的無菌瓶內（1：10稀釋液）2）均勻混合均質器現在是13頁\一共有135頁\編輯于星期三3）稀釋4）傾注1ml1ml1ml1ml9ml9ml9ml9ml1ml1ml1ml1ml1ml1ml現在是14頁\一共有135頁\編輯于星期三5）傾注平板

稀釋液移入平皿后，將46℃~的營養瓊脂培養基注入平皿約15mL,轉動平皿。空白對照現在是15頁\一共有135頁\編輯于星期三6）倒置

培養瓊脂凝固后，翻轉平板細菌37℃48h~霉菌28℃5天現在是16頁\一共有135頁\編輯于星期三（四）菌落計數法

肉眼觀察放大鏡TTC（氯化三苯基四氮唑)顯色（五）菌落計數的報告報告單位：cfu/g(mL)1、平板菌落數的選擇：30~3002、稀釋度的選擇：現在是17頁\一共有135頁\編輯于星期三（五）菌落計數的報告3、菌落數的報告：100以內時按實數報告大于100時兩位有效數字1640016000現在是18頁\一共有135頁\編輯于星期三涂布平板法

先倒平板待凝固后，吸取0.1ml稀釋液于平板表面上，用滅菌涂布棒在整個平板上均勻涂布，培養觀察。現在是19頁\一共有135頁\編輯于星期三涂布法的優缺點可檢測到熱敏性菌體菌落形態比較明顯更適合于嚴格的好氧菌沒有傾注法簡便，易出現菌落重疊、混雜現象現在是20頁\一共有135頁\編輯于星期三二、旋轉接種法（Spiralplatemethod）

1970年FDA原理：接種針將樣品液以螺旋方式從平板中央往外連續接種。接種量：0.05mL現在是21頁\一共有135頁\編輯于星期三優點：可測定50~500000cfu/mL的菌數樣品不需事先稀釋不需做2個重復接種速度快結果可人工計數，也可用激光計數器計數人力與物力花費成本低廉測定結果與傳統方法相關性高現在是22頁\一共有135頁\編輯于星期三缺點：設備投資較高含顆粒樣品容易堵塞管道如果樣品的帶菌量超出范圍則結果準確性降低對瓊脂平板表面要求高現在是23頁\一共有135頁\編輯于星期三菌落計數的其它方法膜過濾MPN染色還原計數法DMC現在是24頁\一共有135頁\編輯于星期三三、膜過濾SPC方法的改良過濾膜的孔徑0.45um收集菌體提高檢出率直接顯微計數膜過濾與熒光染色方法結合現在是25頁\一共有135頁\編輯于星期三直接熒光膜技術計數法（DEFT）

DirectEpifluorescentFilterTechnique現在是26頁\一共有135頁\編輯于星期三DEFT—微菌落計數

僅用于活細胞的檢測原理：食品勻液經DEFT膜過濾，膜放在培養基表面，恒溫培養至微菌落長出，顯微鏡觀察G-3hG+6h現在是27頁\一共有135頁\編輯于星期三快速檢測技術特殊濾膜（0.5um）過濾樣品液濾膜經啶橙染色紫外光顯微鏡觀察活細胞橙色熒光死細胞綠色熒光20~30min現在是28頁\一共有135頁\編輯于星期三四、最近似數測定法（MPN）

選擇3個稀釋梯度的稀釋液，每種稀釋液接種3管（5管）裝有培養基的試管中培養，根據實驗結果查MPN檢索表，得到樣品中微生物數量。現在是29頁\一共有135頁\編輯于星期三

1915年McCrady發明MPN的優點：方法相對簡單與SPC相比，相似率較高用選擇性培養基可檢測特殊的微生物類群測定大腸菌群數量的方法現在是30頁\一共有135頁\編輯于星期三

MPN的缺點：需要大量的玻璃器皿（特別是5試管實驗）不能觀察微生物菌落的形態準確性不高現在是31頁\一共有135頁\編輯于星期三1、大腸菌群（coliformgroup）

領域用語與糞便污染有關的細菌定義：一群需氧及兼性厭氧，在37℃經24h能分解乳糖產酸、產氣的革蘭氏陰性無芽胞桿菌。

現在是32頁\一共有135頁\編輯于星期三主要包括：大腸埃希氏菌屬（Escherichia）檸檬酸桿菌屬（Citrobacter）克雷氏菌屬（Klebsiella）產氣腸桿菌屬（Enterobacter）非典型大腸桿菌典型大腸桿菌現在是33頁\一共有135頁\編輯于星期三目前，大腸菌群已被我國和許多國家用作食品質量評價的指示菌。一般認為，大腸菌群都是直接或間接來自人與溫血動物的糞便。

現在是34頁\一共有135頁\編輯于星期三2、檢測大腸菌群的意義

糞便污染食品的指示菌大腸菌群數的高低，表明糞便污染的程度和對人體健康危害性的大小腸道致病菌污染食品的指示菌

大腸菌群數的高低，表明腸道致病菌存在的可能性大小（并非一定平行！）

現在是35頁\一共有135頁\編輯于星期三3、大腸菌群檢測方法與檢驗結果

檢驗結果：用每100mL（g）樣品中大腸菌群最近似數來表示，簡稱大腸菌群MPN.檢測方法：乳糖發酵試驗、分離培養、證實試驗見GB4789.3-1994現在是36頁\一共有135頁\編輯于星期三五、染色還原計數法一種估計活性微生物數量的方法。原理：活細胞內含有還原酶，可把特定的染料從一種顏色還原為另外一種顏色。現在是37頁\一共有135頁\編輯于星期三亞甲基藍（蘭色）白色刃天青（暗蘭色）粉紅色或白色染色還原的時間與樣品中微生物濃度成反比兩種染料：現在是38頁\一共有135頁\編輯于星期三應用：乳品工業上原料乳中的微生物檢測優點：簡便、快捷和經濟缺點：不同的微生物還原能力不同，給估算帶來了一定的困難。不適用于含有還原酶的食品應用及優、缺點現在是39頁\一共有135頁\編輯于星期三六、顯微直接計數法

（Directmicroscopecount,DMC）一定量的食品（0.001mL）顯微鏡載玻片（1cm2）烘干、固定、脫脂、染色復式顯微鏡計數換算現在是40頁\一共有135頁\編輯于星期三DMC方法的優點快捷、簡便能對細胞形態進行分析載玻片易保存，作參考可使用熒光技術增強效果現在是41頁\一共有135頁\編輯于星期三DMC方法的缺點僅適于檢含大量菌體的樣品準確性差易造成操作人員的疲勞現在是42頁\一共有135頁\編輯于星期三七、棉拭子涂抹法

表層微生物的檢測應用于食品、公共場所現在是43頁\一共有135頁\編輯于星期三方法：1）無菌棉拭子蘸取滅菌生理鹽水（10mL試管）均勻涂抹樣品表面一定面積（5cmX5cm，1cmX1cm）后，放回試管中，及時送檢；現在是44頁\一共有135頁\編輯于星期三2）試管振蕩，使微生物懸浮于稀釋液中；3）按SPC方法進行梯度稀釋、培養、計數。

此外，紙片法……現在是45頁\一共有135頁\編輯于星期三第二節物理、化學、分子和免疫方法現在是46頁\一共有135頁\編輯于星期三一、物理方法阻抗測定法微量量熱法現在是47頁\一共有135頁\編輯于星期三（一）阻抗測定法（impedance）

1899年G.N,Stewart估算20世紀70年代應用阻抗：交流電路中導電物質對電流所起的阻礙和抵抗作用，可由電導和電容計算。現在是48頁\一共有135頁\編輯于星期三原理：微生物可使培養基中電惰性底物，如碳水化合物、蛋白質等營養物質代謝成為電活性產物（乳酸鹽或氨等）當微生物生長繁殖時，培養基中的電惰性分子即為許多電活性分子所取代，從而使培養基的電導性增大，培養基的阻抗降低。現在是49頁\一共有135頁\編輯于星期三檢測時間（detectiontime)樣品接種后從開始培養到阻抗值發生急劇變化的時間。與原始菌數成反比Bactomer細菌計數器準確率93%10~100個5h~現在是50頁\一共有135頁\編輯于星期三（二）微量量熱法（Microcalorimetry）細菌生長時產生熱量測定微小溫度變化的儀器—量熱計批次型：早期應用流動型：靈敏、快速現在是51頁\一共有135頁\編輯于星期三二、化學方法（一）熱穩定性核酸酶（DNAse）

S.aureusG（+）凝固酶（+）產腸毒素菌株95%產熱穩定性核酸酶耐高溫現在是52頁\一共有135頁\編輯于星期三原理：檢測食品中熱穩定性核酸酶的含量，可以精確計算出金黃色葡萄球菌的數量。現在是53頁\一共有135頁\編輯于星期三

分光光度法

熱穩定性核酸酶是S.aureus生長的標志凝固酵素是產腸毒素菌株的標志現在是54頁\一共有135頁\編輯于星期三（二）ATP的測定生命體的主要能源細胞中ATP含量恒定ATP測定計數法的原理根據ATP可與從熒火蟲中提取的熒光素酶作用發光，發光的總光量與ATP的量成正比。現在是55頁\一共有135頁\編輯于星期三

光強度推算出細菌細胞數液體發光分光計照度計結果與SPC法一致10~25min現在是56頁\一共有135頁\編輯于星期三ATP檢測法的應用：

檢測微生物數量的快速方法醫學：尿樣的檢驗環境衛生：表面微生物的測定現在是57頁\一共有135頁\編輯于星期三（三）輻射測量法（Radiometric）原理

利用細菌在代謝碳水化合物時產生CO2的原理，把微量元素標記到葡萄糖或其他糖類分子中。放射能計數器現在是58頁\一共有135頁\編輯于星期三放射物的種類C-14葡萄糖C-14甲酸鹽C14-谷氨酸鹽放射量與菌數成正比檢測C-14所需的時間與食品中微生物的含量成反比。現在是59頁\一共有135頁\編輯于星期三應用醫學：“吹口氣，查胃病”30min食品：微生物含量高5~6h微生物含量低更廠現在是60頁\一共有135頁\編輯于星期三三、食品微生物的指紋識別和鑒定

“指紋”概念由于每種微生物的化學組分（DNA、蛋白質）結構、性能有差別及其特異性代謝產物等通過分析技術出現的特征性的圖譜現在是61頁\一共有135頁\編輯于星期三（一）血清學方法特殊的抗體鑒定同源抗原G-菌體（O）抗原鞭毛（H）抗原熱穩定性好熱穩定性差現在是62頁\一共有135頁\編輯于星期三抗原（Antigen，Ag）Antigensaremacromoleculesthatelicitanimmuneresponseinthebody.Antigenscanbeproteins

polysaccharides

conjugatesoflipidswithproteins(lipoproteins)andpolysaccharides(glycolipids).現在是63頁\一共有135頁\編輯于星期三Antibodiesareimmunesystem-relatedproteinscalledimmunoglobulins（Ig）.Eachantibodyconsistsoffourpolypeptides–twoheavychainsandtwolightchainsjoinedtoforma"Y"shapedmolecule.抗體（Antibody，Ab）現在是64頁\一共有135頁\編輯于星期三Structureofantibody現在是65頁\一共有135頁\編輯于星期三（二）噬菌體（phage）類型原理：根據噬菌體和它的宿主細菌之間的特殊關系，用已知的噬菌體鑒定其特定的宿主細菌。現在是66頁\一共有135頁\編輯于星期三（三）分子生物學方法基因探針技術DNA擴增法限制性片段長度多態性技術脈沖場凝膠電泳現在是67頁\一共有135頁\編輯于星期三1.基因探針技術探針（Probe）：經過標記的一段短核苷酸，用于檢測與之同源的核苷酸序列。Probeisashortlabellednucleotideusedtodetecthomologousnucleotidesequence.現在是68頁\一共有135頁\編輯于星期三Lengthofprobe：

20-1000bpTypeofprobe：

Oligonucleotideprobes（20-40bp）SinglestrandedDNAprobes（200-500bp）DoublestrandedDNAprobes

RNAprobesorRiboprobes現在是69頁\一共有135頁\編輯于星期三

Radioactive：32P、35S、3H、14CDigoxigenin（Dig）BiotinFluorescentdyeChoiceofLabelling：

Non-radioactive：現在是70頁\一共有135頁\編輯于星期三UnknownDNA現在是71頁\一共有135頁\編輯于星期三Colony

hybridization現在是72頁\一共有135頁\編輯于星期三可檢測的細胞數量：106-107

必須進行細胞富集！

探針檢測的靈敏度與檢測時間細胞數量為108，檢測需要10-12h現在是73頁\一共有135頁\編輯于星期三2.DNA擴增法（1）多聚酶鏈反應PolymeraseChainReaction，PCR1985年，美國PE-Cetus公司人類遺傳學研究室的KaryMullis發明1993年，Mullis獲得諾貝爾化學獎現在是74頁\一共有135頁\編輯于星期三PCR的基本原理DNA的結構DNAdoublehelix現在是75頁\一共有135頁\編輯于星期三DNA的復制DNAsemi-conservedreplication現在是76頁\一共有135頁\編輯于星期三現在是77頁\一共有135頁\編輯于星期三現在是78頁\一共有135頁\編輯于星期三三步曲：變性（Denaturation）退火（Annealling）延伸（Extension）一個循環（cycle）一般進行25-30個循環PCR反應的三步曲與五要素現在是79頁\一共有135頁\編輯于星期三Step1：雙鏈DNA熱變性（94℃）；Step2：引物與模板單鏈DNA退火（55℃）；Step3：DNA的聚合延伸反應（72℃）；Step4：擴增的雙鏈DNA再次熱變性（返回Step1）。現在是80頁\一共有135頁\編輯于星期三五要素：●模板DNA（template）●引物（Primer）●DNA聚合酶（Polymerase）●緩沖液（Buffer，Mg++）●脫氧核糖核苷三磷酸（dNTPs）現在是81頁\一共有135頁\編輯于星期三現在是82頁\一共有135頁\編輯于星期三循環次數與產物的量實際：Nf=N0（1+Y）N其中Y為擴增效率理論：Nf=N0X2N

其中N為循環次數，N0為起始拷貝數，Nf為最終拷貝數現在是83頁\一共有135頁\編輯于星期三PCR擴增產物的瓊脂糖凝膠電泳現在是84頁\一共有135頁\編輯于星期三Denaturing94oCTemperature100055Time5’3’3’5’現在是85頁\一共有135頁\編輯于星期三PCRDenaturing94oCTemperature100055Time3’5’5’3’Heat現在是86頁\一共有135頁\編輯于星期三Denaturing94oCAnnealingPrimers55oCExtension72oCTemperature100055Time3’5’5’3’5’5’Denaturing94oC現在是87頁\一共有135頁\編輯于星期三Denaturing94oCDenaturingng94oCAnnealingPrimers55oCExtension72oCTemperature100055Time30x3’5’5’3’HeatHeat5’5’5’現在是88頁\一共有135頁\編輯于星期三Denaturing94oCDenaturing94oCAnnealingPrimers55oCExtension72oCTemperature100055Time30x3’5’5’3’5’5’5’5’5’5’現在是89頁\一共有135頁\編輯于星期三PCRProductsWithEachThermalCycle0CyclesNumber1382412416532664現在是90頁\一共有135頁\編輯于星期三（2）隨機擴增的多態性DNA

RandomAmplifiedPolymorphicDNA

（RAPD）DevelopedbyWilliamsetal.(1990)using10baseprimerstogeneraterandomfragmentsfromtemplateDNAsRAPDfragmentscanbeseparatedandusedasgeneticmarkersorakindofDNAfingerprint現在是91頁\一共有135頁\編輯于星期三Tworelatedtechniques:

1.ArbitraryPrimedPCR(AP-PCR)WelshandMcClelland(1990)longerprimers(18-25bases)2.DNAAmplificationFingerprinting(DAF)Caetano-Anollesetal.(1991)veryshortprimers(8bases)現在是92頁\一共有135頁\編輯于星期三ComponentsofPCRandRAPDRAPD1.Buffer(Mg++)–usuallyhighMg++concentration2.TemplateDNA1shortprimer(10bases)annealstoanyspecificpartofthetemplateDNA4.dNTPs5.TaqPCR1.Buffer(Mg++)2.TemplateDNA2PrimersthatflankthefragmentofDNAtobeamplifieddNTPs5.Taq現在是93頁\一共有135頁\編輯于星期三TwomodificationsmadetotypicalthermalcyclingwhenRAPDisbeingdone:Annealingtemperaturesaregenerallyverylow,around36°C-ThisallowsveryshortprimerstoannealtotemplateDNAMorethermalcyclesareused,typically45-Thiscompensatesfortheinefficiencywhichresultsfromusingsuchshortprimers.現在是94頁\一共有135頁\編輯于星期三TemplateDNAPrimerbindstomanylocationsonthetemplateDNAOnlywhenprimerbindingsitesarecloseandorientedinoppositedirectionsotheprimerspointtowardeachotherwillamplificationtakeplaceRAPD現在是95頁\一共有135頁\編輯于星期三TemplateDNAPrimerspointawayfromeachother,soamplificationwon’thappenRAPD現在是96頁\一共有135頁\編輯于星期三TemplateDNAPrimerspointinthesamedirection,soamplificationwon’thappenRAPD現在是97頁\一共有135頁\編輯于星期三TemplateDNAPrimerstoofarapart,soamplificationwon’thappen>2,000basesRAPD現在是98頁\一共有135頁\編輯于星期三TemplateDNAPrimersarejusttherightdistanceapart,sofragmentisamplified100-1,500basesRAPD現在是99頁\一共有135頁\編輯于星期三MM2345678910RAPD產物的電泳圖譜現在是100頁\一共有135頁\編輯于星期三PCRMachine現在是101頁\一共有135頁\編輯于星期三3.限制性片段長度多態性技術（RFLP）RestrictionFragmentLengthPolymorphism（1）限制性內切酶

(Restrictionendonuclease）保護細菌不受外來DNA侵入來自細菌的一種內切酶現在是102頁\一共有135頁\編輯于星期三限制性內切酶的特點：識別4-8bp特定序列(sitespecific)兩股DNA上各產生一個切口回文序列(palindromesequence)5’-GTTACATGAGATCACGGATTC-3’3’-CAATGTACTCTAGTGCCTAAG-5’現在是103頁\一共有135頁\編輯于星期三產生粘性末端(cohesiveend,stickyend)5’-GTTACATGAG3’-CAATGTACTCTTAAEcoRI5’-TTACATGC3’-AATGTACGGCMspIAATTCACGGATTC-3’GTGCCTAAG-5’CGGACGGAT-3’CTGCCTA-5’5’-GTTACATGAG3’-CAATGTACTCTTAAAATTCACGGATTC–3’GTGCCTAAG-5’5’-TTACATGC3’-AATGTACGGCCGGACGGAT-3’CTGCCTA-5’現在是104頁\一共有135頁\編輯于星期三5’-ACGGATTCGTT3’-TGCCTAAGCAAHpaI5’-AACTGTCGG3’-TTGACAGCCHaeIIIAACGTTACATGA

3’TTGCAATGTACT

5’CCAGGCTG-3’GGTCCGAC-5’產生平末端(bluntend)5’-ACGGATTCGTT3’-TGCCTAAGCAAAACGTTACATGA

3’TTGCAATGTACT

5’5’-AACTGTCGG3’-TTGACAGCCCCAGGCTG-3’GGTCCGAC-5’現在是105頁\一共有135頁\編輯于星期三（2）限制性圖譜

(Restrictionmap）現在是106頁\一共有135頁\編輯于星期三（3）限制性片段長度多態性

(RFLP）現在是107頁\一共有135頁\編輯于星期三現在是108頁\一共有135頁\編輯于星期三4.脈沖場凝膠電泳技術PulsedFieldGelElectrophoresis（PFGE）現在是109頁\一共有135頁\編輯于星期三現在是110頁\一共有135頁\編輯于星期三四、免疫學方法精確性(Accurate)靈敏性(Sensitive)特異性(Specific)現在是111頁\一共有135頁\編輯于星期三（一）熒光抗體法（FA）（Fluorescenceantibody）1942年創立，在食品和醫學微生物中應用廣泛。原理：抗體與熒光物質結合而帶有熒光，與相應抗原結合后，在熒光顯微鏡下可以觀察，也可計數。現在是112頁\一共有135頁\編輯于星期三熒光素：異硫氰酸熒光素（FITC）若丹名B（RhodamineB）現在是113頁\一共有135頁\編輯于星期三（二）沙門氏菌1-2實驗（1-2Test）原理：血清學原理,即抗原抗體結合形成肉眼可見的免疫帶。一種檢測有動力的沙門氏菌的方法現在是114頁\一共有135頁\編輯于星期三在一個特殊的含兩個容器的塑料設備中進行：一個容器中裝有選擇性液體培養基，另一個中裝有非選擇性運動性培養基（半固體），并含有鞭毛抗體。恒溫培養時，運動性沙門氏菌經選擇性培養后進入非選擇性培養基，并與其中的抗體結合形成免疫帶。現在是115頁\一共有135頁\編輯于星期三Inoculationchamber現在是116頁\一共有135頁\編輯于星期三優點：將血清學反應和生化增菌過程結合起來，特異性強；不需特殊實驗室條件，簡便；8-14小時內得出結果，快速。缺點：不能檢測非運動型沙門氏菌，免疫條帶的判斷有主觀因素。現在是117頁\一共有135頁\編輯于星期三（三）酶聯免疫吸附劑測定

EnzymeLinkedImmunosorbentAssay1971年Engvall和Perlmann（ELISA）canmeasureantibodiesorantigensinexpensive,rapid,quantitative,specificsensitive(pg/ml)expensiveequipmentnotrequiredcanbeautomated現在是118頁\一共有135頁\編輯于星期三ELISA的基礎是抗原或抗體的固相化及抗原或抗體的酶標記。結合在固相載體表面的抗原或抗體仍保持其免疫學活性，酶標記的抗原或抗體既保留其免疫學活性，