學必求其心得，業必貴于專精學必求其心得，業必貴于專精學必求其心得，業必貴于專精第一講基因工程和細胞工程［考綱要求]1．基因工程的誕生(Ⅰ)2。基因工程的原理及技術(含PCR技術)(Ⅱ）3.基因工程的應用（Ⅱ）4。蛋白質工程(Ⅰ）5．植物的組織培養(Ⅱ）6.動物細胞培養與體細胞克隆(Ⅱ）7.細胞融合與單克隆抗體（Ⅱ）［知識主干·系統聯網]理基礎建網絡回扣關鍵知識授課提示:對應學生用書第97頁■高考必背--記一記1．基因工程的核心知識點（1)要求用同一種限制酶切割質粒和含有目的基因的片段.其實也可以用不同限制酶切割,只要二者切割后產生相同黏性末端即可。（2)基因工程是否成功表現在目的基因是否成功表達,不能將目的基因導入受體細胞當作基因工程成功的標志.(3）啟動子不是起始密碼子，終止子不是終止密碼子.啟動子和終止子位于DNA分子上，其作用和轉錄有關，起始密碼子和終止密碼子位于mRNA上,其作用與翻譯有關。（4）界定基因治療與基因診斷①基因治療：將正常基因導入有基因缺陷的細胞中,使該基因的表達產物發揮功能，以達到治療的目的-—其原理為“基因重組"及“基因表達"。②基因診斷：制作特定DNA探針與病人樣品DNA混合，分析雜交帶情況—-其原理為“DNA分子雜交”.2．轉基因植物的培育涉及的生物工程有基因工程、植物組織培養(植物細胞工程）；轉基因動物的培育涉及的生物工程有基因工程、動物細胞工程、胚胎移植.■易混易錯——判一判1．判斷下列有關基因工程敘述的正誤(1)借助抗生素抗性基因可將含胰島素基因的受體細胞篩選出來.(2015·重慶卷）（√）(2）啟動子和終止密碼子均在胰島素基因的轉錄中起作用。(2015·重慶卷）（×)（3）轉基因抗蟲棉植株抗蟲效果的鑒定必須通過分子檢測。(×)(4)重組質粒與探針能進行分子雜交是因為DNA分子脫氧核糖和磷酸交替連接。(×)2．判斷下列關于細胞工程敘述的正誤(1)細胞核移植主要在同種動物、同種組織的細胞之間進行.（2015·江蘇卷)（×)（2)乳腺細胞比乳腺癌細胞更容易進行離體培養。（2015·江蘇卷）(×）（3)PEG是促細胞融合劑，可直接誘導植物細胞融合。（2016·江蘇卷)（×)(4)用原生質體制備人工種子，要防止細胞破裂。（2016·江蘇卷）(×)［高頻考點·融會貫通]析考點做題組攻破熱點難點授課提示:對應學生用書第98頁考點一基因工程［真題試做·明考向]1．（2018·高考全國卷Ⅰ）回答下列問題:(1)博耶(H.Boyer)和科恩（S.Cohen）將非洲爪蟾核糖體蛋白基因與質粒重組后導入大腸桿菌細胞中進行了表達。該研究除證明了質粒可以作為載體外，還證明了_____________________________________________________________（答出兩點即可)。（2）體外重組的質粒可通過Ca2＋參與的________方法導入大腸桿菌細胞；而體外重組的噬菌體DNA通常需與________組裝成完整噬菌體后,才能通過侵染的方法將重組的噬菌體DNA導入宿主細胞。在細菌、心肌細胞、葉肉細胞中,可作為重組噬菌體宿主細胞的是________。（3)真核生物基因（目的基因)在大腸桿菌細胞內表達時,表達出的蛋白質可能會被降解.為防止蛋白質被降解,在實驗中應選用________的大腸桿菌作為受體細胞，在蛋白質純化的過程中應添加________的抑制劑.解析：(1)將非洲爪蟾核糖體蛋白基因與質粒重組后導入大腸桿菌中，該過程利用的技術是基因工程。該研究除了證明質粒可作為載體外，還證明了體外重組的質粒可以進入受體細胞，真核生物基因可在原核細胞中表達等。(2)重組質粒導入大腸桿菌細胞可采用Ca2＋參與的轉化方法；體外重組噬菌體要通過將體外重組的噬菌體DNA和外殼蛋白(或噬菌體蛋白）進行組裝獲得；因為噬菌體是專門寄生在細菌中的病毒,所以宿主細胞選用細菌。（3)為防止蛋白質被降解，在實驗中應選用蛋白酶缺陷型的大腸桿菌作為受體細胞；在蛋白質純化過程中，為防止目的蛋白質被降解，需要添加蛋白酶的抑制劑。答案：(1）體外重組的質粒可以進入受體細胞；真核生物基因可在原核細胞中表達(2）轉化外殼蛋白（或答噬菌體蛋白）細菌（3）蛋白酶缺陷型蛋白酶2．(2017·高考全國卷Ⅰ）真核生物基因中通常有內含子，而原核生物基因中沒有，原核生物沒有真核生物所具有的切除內含子對應的RNA序列的機制。已知在人體中基因A（有內含子）可以表達出某種特定蛋白（簡稱蛋白A）.回答下列問題：(1）某同學從人的基因組文庫中獲得了基因A,以大腸桿菌作為受體細胞卻未得到蛋白A,其原因是________________________________________________________________________________________________________________________________________________。（2)若用家蠶作為表達基因A的受體，在噬菌體和昆蟲病毒兩種載體中,不選用________作為載體，其原因是______________________________________________________________。(3）若要高效地獲得蛋白A，可選用大腸桿菌作為受體。因為與家蠶相比，大腸桿菌具有______________（答出兩點即可)等優點.(4）若要檢測基因A是否翻譯出蛋白A，可用的檢測物質是________________(填“蛋白A的基因”或“蛋白A的抗體”）。（5）艾弗里等人的肺炎雙球菌轉化實驗為證明DNA是遺傳物質做出了重要貢獻,也可以說是基因工程的先導，如果說他們的工作為基因工程理論的建立提供了啟示，那么，這一啟示是________________________________________________________________________________________________________________________________________________。解析：（1)人是真核生物,從人的基因組文庫中獲得的基因A有內含子，而受體細胞大腸桿菌是原核生物，原核生物基因中沒有內含子，相應的就沒有切除內含子對應的RNA序列的機制，故無法表達出蛋白A。(2)噬菌體是專一性侵染細菌的病毒，以細菌為宿主細胞，而昆蟲病毒侵染的是昆蟲，以昆蟲為宿主細胞。家蠶屬于昆蟲，故應選用昆蟲病毒作為載體。（3）與家蠶相比，大腸桿菌具有繁殖快、容易培養等優點,故要高效地獲得蛋白A，可選用大腸桿菌作為受體。(4)檢測基因A是否翻譯出蛋白A，可用抗原—抗體雜交法。（5）艾弗里等人的肺炎雙球菌轉化實驗中,S型細菌的DNA可以使R型細菌發生轉化，說明可調控多糖莢膜產生的基因整合到了R型細菌的DNA分子中并成功得以表達。也就是說DNA可以從一種生物個體轉移到另一種生物個體并進行表達,這為基因工程理論的建立提供了啟示。答案:(1）基因A有內含子，在大腸桿菌中，其初始轉錄產物中與內含子對應的RNA序列不能被切除,無法表達出蛋白A(2)噬菌體噬菌體的宿主是細菌，而不是家蠶(3)繁殖快、容易培養(4)蛋白A的抗體(5)DNA可以從一種生物個體轉移到另一種生物個體3。(2017·高考全國卷Ⅱ）幾丁質是許多真菌細胞壁的重要成分，幾丁質酶可催化幾丁質水解。通過基因工程將幾丁質酶基因轉入植物體內，可增強其抗真菌病的能力.回答下列問題:（1)在進行基因工程操作時，若要從植物體中提取幾丁質酶的mRNA，常選用嫩葉而不選用老葉作為實驗材料，原因是______________。提取RNA時,提取液中需添加RNA酶抑制劑,其目的是____________________________________________________________________。(2)以mRNA為材料可以獲得cDNA，其原理是____________________________________________________________________________________________________________。（3）若要使目的基因在受體細胞中表達，需要通過質粒載體而不能直接將目的基因導入受體細胞，原因是____________________________________________________(答出兩點即可).（4）當幾丁質酶基因和質粒載體連接時，DNA連接酶催化形成的化學鍵是________________________________________________________________________。(5)若獲得的轉基因植株（幾丁質酶基因已經整合到植物的基因組中)抗真菌病的能力沒有提高,根據中心法則分析，其可能的原因是___________________________________________.解析：(1)在進行基因工程操作時，若要從植物體中提取幾丁質酶的mRNA，常選用嫩葉而不選用老葉作為實驗材料，原因是相對于老葉而言嫩葉組織細胞更容易被破碎。提取RNA時，提取液中需添加RNA酶抑制劑，其目的是防止RNA降解.(2）以mRNA為材料獲得cDNA的原理是在逆轉錄酶的作用下，以mRNA為模板按照堿基互補配對的原則可以合成cDNA。(3）若要使目的基因在受體細胞中表達,需要通過質粒載體而不能直接將目的基因導入受體細胞，原因是目的基因無復制原點且目的基因無表達所需啟動子。（4)DNA連接酶催化形成的化學鍵是磷酸二酯鍵。（5）若獲得的轉基因植株不具備所期望的性狀表現,根據中心法則分析，其可能的原因是目的基因的轉錄或翻譯異常。答案：（1）嫩葉組織細胞易破碎防止RNA降解(2)在逆轉錄酶的作用下，以mRNA為模板按照堿基互補配對的原則可以合成cDNA（3）目的基因無復制原點;目的基因無表達所需啟動子（4）磷酸二酯鍵（5）目的基因的轉錄或翻譯異常4．（2017·高考全國卷Ⅲ）編碼蛋白甲的DNA序列（序列甲)由A、B、C、D、E五個片段組成，編碼蛋白乙和丙的序列由序列甲的部分片段組成,如圖1所示.回答下列問題:(1）現要通過基因工程的方法獲得蛋白乙,若在啟動子的下游直接接上編碼蛋白乙的DNA序列(TTCGCTTCT……CAGGAAGGA),則所構建的表達載體轉入宿主細胞后不能翻譯出蛋白乙，原因是_____________________________________________________________________________________________________________________________________________。（2）某同學在用PCR技術獲取DNA片段B或D的過程中,在PCR反應體系中加入了DNA聚合酶、引物等,還加入了序列甲作為________，加入了________作為合成DNA的原料。（3）現通過基因工程方法獲得了甲、乙、丙三種蛋白,要鑒定這三種蛋白是否具有刺激T淋巴細胞增殖的作用，某同學做了如下實驗：將一定量的含T淋巴細胞的培養液平均分成四組，其中三組分別加入等量的蛋白甲、乙、丙，另一組作為對照,培養并定期檢測T淋巴細胞濃度,結果如圖2。①由圖2可知:當細胞濃度達到a時，添加蛋白乙的培養液中T淋巴細胞濃度不再增加，此時若要使T淋巴細胞繼續增殖,可采用的方法是________。細胞培養過程中,培養箱中通常要維持一定的CO2濃度，CO2的作用是____________________________________________。②僅根據圖1、圖2可知,上述甲、乙、丙三種蛋白中,若缺少________(填“A"“B”“C”“D"或“E”）片段所編碼的肽段,則會降低其刺激T淋巴細胞增殖的效果。解析：(1）若在啟動子的下游直接接上編碼蛋白乙的DNA序列（TTCGCTTCT……CAGGAAGGA)，則轉錄出的mRNA上缺少起始密碼子，故不能翻譯出蛋白乙。(2）使用PCR技術獲取DNA片段時，應在PCR反應體系中添加引物、耐高溫的DNA聚合酶、模板、dNTP作為原料。(3)T淋巴細胞濃度之所以不再增加，是因為細胞間出現接觸抑制,因此若要使T淋巴細胞繼續增殖,需要對貼滿瓶壁的細胞使用胰蛋白酶處理，然后分瓶培養，即細胞傳代培養.細胞培養過程中，培養箱中通常要維持一定的CO2濃度，以維持培養液的pH。據圖分析，蛋白丙與對照接近說明B、D片段對于T淋巴細胞增殖不是非常重要，蛋白甲和乙對T淋巴細胞的增殖都有較大影響，甲、乙兩種蛋白中共同的片段是C,所以缺少C片段會降低其刺激T淋巴細胞增殖的效果。答案：(1)編碼乙的DNA序列起始端無ATG，轉錄出的mRNA無起始密碼子(2)模板dNTP(3）①進行細胞傳代培養維持培養液的pH②C[融會貫通·析考點]1．比較記憶基因工程的三種工具限制酶DNA連接酶載體作用切割目的基因和載體拼接DNA片段,形成重組DNA攜帶目的基因進入受體細胞作用部位兩個核苷酸之間的磷酸二酯鍵－作用特點(條件）①識別雙鏈DNA分子的某種特定核苷酸序列②在特定位點切割①E·coliDNA連接酶只能連接黏性末端②T4DNA連接酶能連接黏性末端和平末端①能在宿主細胞內穩定存在并大量復制②有一個至多個限制酶切割位點③具有特殊的標記基因2.熟記基因工程的四個操作步驟（1）目的基因“三種獲取方法”①從基因文庫中獲取(基因組文庫、cDNA文庫）；②利用PCR技術擴增：其實質是在體外對目的基因進行大量復制。用PCR儀控制溫度：變性（90～95℃）→復性（55～60℃)→延伸(70③通過DNA合成儀用化學方法人工合成（用于核苷酸序列已知，且核苷酸數目較少的基因)、利用mRNA反轉錄法合成。(2)基因表達載體的構建—-基因工程操作的核心①基因表達載體的組成②構建過程（3)將目的基因導入受體細胞生物種類植物細胞動物細胞微生物細胞常用方法農桿菌轉化法、基因槍法、花粉管通道法等顯微注射技術感受態細胞法(Ca2＋處理法)受體細胞體細胞受精卵原核細胞（4）目的基因的檢測與鑒定的“兩個水平”3．PCR技術(1)原理:DNA復制，即：eq\x(\a\al(雙鏈,DNA））eq\o(，\s\up7（加熱,雙螺旋結構解體),\s\do5（緩慢冷卻，分離的DNA鏈重新結合）)eq\x(\a\al(單鏈，DNA）)(2)PCR反應過程過程說明圖解變性當溫度上升到90℃以上時，雙鏈復性溫度下降到50℃左右，兩種引物通過堿基互補配對與兩條單鏈延伸72℃左右時，TaqDNA聚合酶有最大活性，可使DNA新鏈由5′端向3(3）結果：上述三步反應完成后,一個DNA分子就變成了兩個DNA分子，隨著重復次數的增多，DNA分子就以2n的形式增加。PCR的反應過程都是在PCR擴增儀中完成的。4．圖解記憶蛋白質工程［方法技巧·會應用］1．限制酶及其切點的分析(1)一個至多個限制酶切點:作為載體必須具有一個至多個限制酶切點，以便與外源基因連接。(2）每種酶一個切點：每種酶的切點最好只有一個.因為每種限制酶只能識別單一切點，若載體上有一個以上的該酶切點，則切割重組后可能丟失某些片段，若丟失的片段含復制原點區，則進入受體細胞后便不能自主復制。一個載體若只有某種限制酶的一個切點，則酶切后既能把環打開接納外源DNA片段，又不會丟失自己的片段.2．DNA的粗提取與鑒定的方法步驟［鞏固提升·練題組]?題組一基因工程的工具及操作程序的考查5．（2018·廣東深圳調研）葉綠體轉基因技術是將外源基因整合到葉綠體基因組中，該技術能有效改良植物的品質。請回答下列問題:（1)轉基因技術的核心步驟是________________,完成該步驟所需要的酶有___________。(2）將植物體細胞處理得到原生質體，再通過________或________法，將目的基因導入原生質體，使原生質體再生細胞壁之后,通過________技術培養可得到相應的轉基因幼苗。(3)來自原核生物中有重要價值的外源基因，無需改造和修飾就可在葉綠體中高效表達，據此分析,原因是________________________________________________________________。(4）對大多數高等植物而言，與傳統的細胞核轉基因相比，葉綠體轉基因更穩定,其遺傳方式________(填“遵循”或“不遵循”)孟德爾分離定律，不會隨________(填“花粉”或“卵細胞”)傳給后代，從而保持了________(填“父本"或“母本”）的遺傳特性。解析：（1）轉基因技術的操作分四步：獲取目的基因，構建基因表達載體，將目的基因導入受體細胞，目的基因的檢測和鑒定，其中構建基因表達載體是核心步驟,需要用到限制酶和DNA連接酶。（2)將目的基因導入原生質體，可以用農桿菌轉化法、基因槍法。原生質體再生細胞壁之后，通過植物組織培養技術培養可得到相應的轉基因幼苗.（3)外源基因無需改造和修飾就可在葉綠體中高效表達，原因是葉綠體DNA與原核生物DNA結構類似。(4)葉綠體轉基因屬于細胞質基因,不遵循孟德爾分離定律，受精卵的細胞質幾乎全部來自于卵細胞，所以葉綠體轉基因不會隨花粉傳給后代，從而保持了母本的遺傳特性。答案：(1)構建基因表達載體限制酶和DNA連接酶(2)農桿菌轉化法基因槍植物組織培養（3）葉綠體DNA與原核生物DNA結構類似(4）不遵循花粉母本6．（2018·高考全國卷Ⅱ）某種熒光蛋白（GFP）在紫外光或藍光激發下會發出綠色熒光,這一特性可用于檢測細胞中目的基因的表達。某科研團隊將某種病毒的外殼蛋白（L1）基因連接在GFP基因的5′末端，獲得了L1。GFP融合基因（簡稱為甲)，并將其插入質粒P0，構建了真核表達載體P1，其部分結構和酶切位點的示意圖如下，圖中E1～E4四種限制酶產生的黏性末端各不相同。回答下列問題:（1)據圖推斷，該團隊在將甲插入質粒P0時，使用了兩種限制酶，這兩種酶是________。使用這兩種酶進行酶切是為了保證________，也是為了保證____________________________.（2)將P1轉入體外培養的牛皮膚細胞后,若在該細胞中觀察到了綠色熒光，則說明L1基因在牛的皮膚細胞中完成了________和________過程。（3)為了獲得含有甲的牛，該團隊需要做的工作包括：將能夠產生綠色熒光細胞的________移入牛的________________中、體外培養、胚胎移植等。(4）為了檢測甲是否存在于克隆牛的不同組織細胞中，某同學用PCR方法進行鑒定，在鑒定時應分別以該牛不同組織細胞中的________(填“mRNA”“總RNA”或“核DNA”）作為PCR模板。解析：（1）由題意可知，L1基因和GFP基因合成了L1.GFP融合基因（簡稱為甲)，題圖中顯示了四個酶切位點，當將L1。GFP融合基因插入質粒P0時,可用E1和E4限制酶進行酶切,用這兩種酶進行酶切不會破壞甲的完整性,同時能保證甲按照正確的方向與載體連接.（2）若在牛皮膚細胞中觀察到了綠色熒光,則說明L1.GFP融合基因得到表達，即目的基因在受體細胞中通過轉錄和翻譯合成了熒光蛋白。（3)為了獲得含有甲的牛，可將含有目的基因的細胞的細胞核移入牛的去核卵母細胞中，然后進行體外培養、胚胎移植等。(4)利用PCR技術擴增目的基因，可以檢測目的基因是否存在。PCR擴增的模板是DNA。答案：（1)E1和E4甲的完整甲與載體正確連接（2)轉錄翻譯(3）細胞核去核卵母細胞(4)核DNA?題組二基因工程的應用及蛋白質工程的考查7．近年興起的CRISPR。Cas技術被用于預防和治療多種人類遺傳病。該技術的核心是一段具有特定序列的RNA(CRISPRRNA)及與該RNA結合在一起的Cas蛋白。回答下列問題：(1)治療人類遺傳病最有效的手段是基因治療,通常又分為____________和____________兩種類型。（2)用該技術治療遺傳病的基本過程是:根據遺傳病致病基因的序列設計一段RNA(即CRISPRRNA),將該RNA與Cas蛋白結合形成復合體,并導入患者細胞中,導入方法與外源基因導入人體細胞相似,可采用________法；進入細胞后的復合體在RNA的指引下按照________原則準確地結合在致病基因部位，而Cas蛋白則對致病基因進行切割。由此可見，Cas蛋白應該是一種____________酶。(3)對于患遺傳病的個體來說，不可能對每個細胞都注射該復合體，因此,研究人員選用____________為運載體，從而使復合體在運載體的協助下能夠大量主動進入人體細胞，但在使用前需要對運載體進行________處理，以保證其安全性。該運載體進入人體細胞的方式通常是____________.解析：(1)基因治療分為體內基因治療和體外基因治療兩種類型。(2）將目的基因導入動物細胞最有效的方法是顯微注射法；進入細胞后的復合體在RNA的指引下按照堿基互補配對原則準確地結合在致病基因部位;Cas蛋白可對致病基因進行切割，由此可見，Cas蛋白應該是一種限制性核酸內切酶.（3)利用動物病毒侵染動物細胞的特性，可選用動物病毒作為運載體,從而使復合體在運載體的協助下能夠大量主動進入人體細胞，但在使用前需要對運載體進行滅毒（或減毒）處理，以保證其安全性。該運載體進入人體細胞的方式通常是胞吞。答案：(1)體內基因治療體外基因治療(2）顯微注射堿基互補配對限制性核酸內切（3)動物病毒滅毒(或減毒)胞吞8．科學家通過利用PCR定點突變技術改造Rubisco酶基因，提高了光合作用過程中Rubisco酶對CO2的親和力,從而顯著提高了植物的光合作用速率.請回答下列問題：(1）PCR過程所依據的原理是____________________，利用PCR技術擴增目的基因的前提是要有一段已知目的基因的核苷酸序列,以便根據這一序列合成________；擴增過程需要加入________________________酶.（2）啟動子是一段有特殊結構的DNA片段，其作用是___________________________________________________________________________________________________。目的基因能在不同生物體內正常表達原來的蛋白質，說明整個生物界________________________。PCR定點突變技術屬于________________的范疇。（3）可利用定點突變的DNA構建基因表達載體。常用________________將基因表達載體導入植物細胞,還需用到植物細胞工程中的________________________技術，來最終獲得轉基因植物。解析：（1)PCR依據的原理是DNA雙鏈復制,在用PCR技術擴增目的基因前要依據一段已知目的基因的脫氧核苷酸序列合成引物；擴增過程需要加入耐高溫的DNA聚合（或TaqDNA聚合)酶。(2)啟動子是RNA聚合酶識別和結合部位,可驅動基因轉錄出mRNA；因生物界共用一套遺傳密碼,所以目的基因可以在不同細胞內表達合成相同蛋白質。（3）常用農桿菌轉化法將基因表達載體導入植物細胞，借助于植物組織培養技術,獲得轉基因植物。答案:（1）DNA雙鏈復制引物耐高溫的DNA聚合(或TaqDNA聚合)(2)RNA聚合酶識別和結合部位,可驅動基因轉錄出mRNA共用一套密碼子蛋白質工程(3)農桿菌轉化法植物組織培養考點二細胞工程［真題試做·明考向］1．(2018·高考全國卷Ⅲ)2018年《細胞》期刊報道，中國科學家率先成功地應用體細胞對非人靈長類動物進行克隆,獲得兩只克隆猴—-“中中”和“華華”.回答下列問題:（1)“中中"和“華華”的獲得涉及核移植過程,核移植是指____________________。通過核移植方法獲得的克隆猴，與核供體相比，克隆猴體細胞的染色體數目________（填“減半”“加倍”或“不變”）。（2)哺乳動物的核移植可以分為胚胎細胞核移植和體細胞核移植，胚胎細胞核移植獲得克隆動物的難度________(填“大于"或“小于”）體細胞核移植,其原因是________________________________________________________________________。（3)在哺乳動物核移植的過程中,若分別以雌性個體和雄性個體的體細胞作為核供體，通常，所得到的兩個克隆動物體細胞的常染色體數目________（填“相同”或“不同”),性染色體組合________(填“相同”或“不同”）。解析：（1)核移植是指將動物的一個細胞核,移入一個已去掉細胞核的卵母細胞中，形成重組細胞.重組細胞形成的早期胚胎可移植到受體子宮內進一步發育，最終分娩得到克隆動物。因為染色體在細胞核中，所以克隆動物體細胞的染色體數目與提供細胞核的個體的體細胞相同.(2)由于動物的胚胎細胞分化程度低，恢復全能性相對容易，而動物的體細胞分化程度高，恢復全能性十分困難，因此，動物體細胞核移植的難度明顯高于胚胎細胞核移植。（3）哺乳動物雌雄個體的體細胞中,細胞核內常染色體的數目是相同的，性染色體組合是不同的。若分別以雌性個體和雄性個體的體細胞作為核供體，則得到的克隆動物的體細胞中常染色體的數目相同，性染色體組合不同.答案：（1)將動物的一個細胞核，移入一個已去掉細胞核的卵母細胞中不變（2）小于胚胎細胞分化程度低，恢復全能性相對容易(3)相同不同2．(2016·高考全國卷Ⅱ)如圖表示通過核移植等技術獲得某種克隆哺乳動物（二倍體）的流程.回答下列問題：(1）圖中A表示正常細胞核，染色體數為2n，則其性染色體的組成可為________。過程①表示去除細胞核,該過程一般要在卵母細胞培養至適當時期再進行，去核時常采用________的方法。②代表的過程是__________。（2)經過多次傳代后，供體細胞中________的穩定性會降低。因此，選材時必須關注傳代次數。(3）若獲得的克隆動物與供體動物性狀不完全相同,從遺傳物質的角度分析其原因是________________________________________________________________________________________________________________________________________________。(4)與克隆羊“多莉（利)”培育成功一樣，其他克隆動物的成功獲得也證明了________________________________________________________________________。解析：（1)核移植技術中，供體可以是雌性也可以是雄性，因此,A的性染色體組成可為XX或XY；去核的方法是顯微操作,將早期胚胎移入代孕個體的技術是胚胎移植。(2）動物細胞傳代培養至10～50代時，部分細胞的遺傳物質(核型)可能會發生變化，因此,核移植技術中的供體細胞應為傳代培養10代以內的細胞。（3）克隆動物的遺傳物質來源于兩個個體，其核基因來自于供體，細胞質基因來自于受體(卵母細胞)，細胞質基因也會影響克隆動物的性狀.(4)克隆動物的成功獲得證明了動物已分化的體細胞的細胞核具有全能性。答案：(1)XX或XY顯微操作胚胎移植（2)遺傳物質(3)卵母細胞的細胞質中的遺傳物質會對克隆動物的性狀產生影響（4）動物已分化體細胞的細胞核具有全能性3．（2014·高考新課標全國卷Ⅰ）某研究者用抗原(A）分別免疫3只同種小鼠（X、Y和Z)，每只小鼠免疫5次，每次免疫一周后測定各小鼠血清抗體的效價（能檢測出抗原抗體反應的血清最大稀釋倍數），結果如圖所示。若要制備雜交瘤細胞,需取免疫后小鼠的B淋巴細胞(染色體數目40條)，并將該細胞與體外培養的小鼠骨髓瘤細胞（染色體數目60條）按一定比例加入試管中,再加入聚乙二醇誘導細胞融合，經篩選培養及抗體檢測,得到不斷分泌抗A抗體的雜交瘤細胞。回答下列問題：(1）制備融合所需的B淋巴細胞時，所用免疫小鼠的血清抗體效價需達到16000以上,則小鼠最少需要經過________次免疫后才能有符合要求的。達到要求后的X、Y、Z這3只免疫小鼠中，最適合用于制備B淋巴細胞的是________小鼠,理由是______________________________________________________________________________________________。（2)細胞融合實驗完成后，融合體系中除含有未融合的細胞和雜交瘤細胞外，可能還有____________________________，體系中出現多種類型細胞的原因是_________________________________________________________________________________________。（3）雜交瘤細胞中有________個細胞核，染色體數目最多是________條。（4）未融合的B淋巴細胞經多次傳代培養后都不能存活，原因是_____________________。解析:(1）由圖可知，要想獲得血清抗體效價達到16000以上的小鼠，小鼠至少需要經過4次免疫后才能有符合要求的.達到要求后的X、Y、Z3只小鼠中，由于Y小鼠的血清抗體效價最高,顯著高于其他兩只小鼠,因此最適合用于制備B淋巴細胞。(2）由于細胞融合是隨機的，且融合率達不到100%,不同種類的細胞膜均可以相互融合,因此可出現B淋巴細胞與B淋巴細胞融合、骨髓瘤細胞與骨髓瘤細胞融合的情況.（3)雜交瘤細胞形成后，小鼠的免疫B淋巴細胞核與其骨髓瘤細胞核會融合形成一個細胞核.小鼠的B淋巴細胞（染色體數目40條）和骨髓瘤細胞(染色體數目60條)融合后，染色體數量是兩者之和，即為100條。(4）由于B淋巴細胞不能無限增殖,經多次傳代培養后,不可能達到無限細胞系水平,因而都不能存活。答案：(1)4YY小鼠的血清抗體效價最高（2)B淋巴細胞相互融合形成的細胞、骨髓瘤細胞相互融合形成的細胞細胞融合是隨機的，且融合率達不到100％（3)1100(4)細胞不能無限增殖［融會貫通·析考點］一、植物細胞工程1．理清植物細胞工程兩大技術(1）植物組織培養的條件①植物組織培養的關鍵②植物激素的使用生長素/細胞分裂素的比值作用效果比值高時促進根分化、抑制芽形成比值低時促進芽分化、抑制根形成比值適中促進愈傷組織形成③光照的使用：脫分化階段不需要給予光照，再分化階段需要給予光照，以利于葉綠素的形成。(2）植物體細胞雜交的關鍵①酶解法-—用纖維素酶和果膠酶去除細胞壁。②促融劑—-聚乙二醇。③雜種細胞的形成標志——新細胞壁的形成.④培養雜種植株的技術——植物組織培養.⑤雜種植株培育成功的原理——細胞具全能性。2．有關植物細胞工程的關鍵問題(1）植物細胞A和植物細胞B雜交獲得的雜種細胞的類型有三種：AA型、BB型、AB型,符合要求的只有AB型，需要進行篩選。(2)雜種植株遺傳物質的變化:雜種植株的變異類型屬于染色體變異,雜種植株的染色體數通常是兩親本細胞染色體數目之和,雜種植株屬于異源多倍體.3．辨析3種細胞-—雜種細胞、重組細胞和雜交細胞(1)雜種細胞:植物體細胞雜交過程中，兩種細胞去掉細胞壁之后形成的原生質體融合,融合的原生質體出現細胞壁之后形成的細胞叫雜種細胞。（2）重組細胞：體細胞的細胞核移植到去核卵母細胞之后形成的細胞叫重組細胞。(3)雜交細胞：動物細胞融合形成的細胞常稱為雜交細胞。二、動物細胞工程1．動物細胞工程條件、酶及措施(1)營養條件:加入動物血清、血漿等；通入氧氣以滿足代謝的需要；通入二氧化碳以維持培養液的pH.（2)胰蛋白酶的兩次使用：首先用胰蛋白酶處理動物的器官或組織，以制備單細胞懸液;培養過程中發生接觸抑制時，同樣要用胰蛋白酶使細胞分散開.(3)避免雜菌污染的措施：培養液及培養用具滅菌處理，加入一定量的抗生素，定期更換培養液.2．克隆動物培育流程圖克隆動物的技術手段有動物細胞培養、核移植、早期胚胎培養和胚胎移植.動物體細胞核移植技術的關鍵點：(1）受體細胞：去核的卵母細胞.（2）用去核的卵母細胞作為受體細胞的原因：營養豐富；體積大，易操作；含有刺激細胞核恢復分裂能力的物質.3．動物細胞融合的原理、方法及應用（1)原理：細胞膜的流動性.(2)促融方法:滅活的病毒、物理法、化學法。（3)應用：制備單克隆抗體。4．理清單克隆抗體制備的過程(1)3種細胞特點不同①B淋巴細胞：能分泌抗體，不能大量增殖。②骨髓瘤細胞：能大量增殖,不能分泌抗體。③雜交瘤細胞：既能分泌抗體，又能大量增殖。(2)2次篩選目的不同①第1次：獲得能分泌抗體的雜交細胞.②第2次：獲得能分泌所需特異性抗體的雜交瘤細胞。[方法技巧·會應用]1．植物體細胞雜交分析(1）植物體細胞雜交的終點是培育成雜種植株,而不是形成雜種細胞就結束。雜種植株具備兩種植物的遺傳特征，原因是雜種植株中含有兩種植物的遺傳物質。(2)該技術在育種上應用時最大的優點是能克服遠緣雜交不親和的障礙。（3）目前還不能讓雜種植物完全按人們的需要去表達親代的優良性狀。2．單克隆抗體制備過程中兩次篩選分析第一次篩選：利用特定選擇培養基篩選,獲得雜交瘤細胞，即AB型細胞（A為B細胞，B為骨髓瘤細胞）,不需要A、B、AA、BB型細胞.第二次篩選：利用多孔板法和抗原—抗體雜交法篩選,獲得產生特定抗體的雜交瘤細胞。3．界定“克隆"動物與“試管”動物[鞏固提升·練題組]?題組一植物細胞工程及應用的考查4．（2018·安徽蕪湖質檢)下圖為A、B兩種二倍體植物體細胞雜交過程示意圖,請據圖回答：(1)步驟①的方法是________。步驟②常用的化學試劑是________，之后________(填“是”或“否"）需要篩選。（2）在利用雜種細胞培育成為雜種植物的過程中，運用的技術手段是________________________，其中步驟④是________。植物體細胞雜交的目的是獲得新的雜種植物，與A、B兩種植物相比，該雜種植物是新物種的原因是__________________。(3）培育該雜種植物的過程中，遺傳物質的傳遞是否遵循孟德爾遺傳規律?為什么？________________________________________________________________________。解析：(1)圖為植物體細胞雜交過程示意圖,其中①表示去壁獲取原生質體的過程,常用酶解法，即用纖維素酶和果膠酶處理；②表示人工誘導原生質體融合，常用的化學試劑是聚乙二醇（PEG)，誘導后形成的兩兩融合的原生質體有三種，所以需要進行篩選。(2)圖中③表示再生出新細胞壁的過程，雜種細胞通過植物組織培養技術培育成為雜種植物，過程④表示脫分化，⑤表示再分化過程。圖中獲得的雜種植物與A、B兩種植物間均存在生殖隔離，所以是新物種.(3)圖示為植物體細胞雜交過程,沒有經過不同配子的結合,所以不屬于有性生殖，因此該過程中遺傳物質的傳遞不遵循孟德爾遺傳規律。答案：(1）酶解法聚乙二醇是(2)植物組織培養技術脫分化該雜種植株與A、B兩種植物間均存在生殖隔離（3)不遵循，該過程不屬于有性生殖5．（2018·福建廈門模擬）細胞工程是一門新興的生物工程技術.在動、植物的育種，藥物提取,藥物生產等領域的應用十分廣泛。利用所學知識回答以下關于細胞工程的相關問題。(1)采用植物細胞工程育種的方法如下：eq\b\lc\\rc\｝（\a\vs4\al\co1（甲細胞，乙細胞))eq\o（→,\s\up7（處理)，\s\do5(）)eq\b\lc\{\rc\}（\a\vs4\al\co1(甲原生質體，乙原生質體））eq\o(→,\s\up7(誘導)，\s\do5(））雜種細胞→愈傷組織eq\o(→,\s\up7（篩選),\s\do5(）)胚狀體eq\o（→,\s\up7（選擇)，\s\do5（)）目的植株①以胚狀體為材料,經過人工薄膜包裝得到的人工種子,在適宜條件下同樣能夠萌發成幼苗,與天然種子培育相比，人工種子的培育具有哪些顯著的優點？________________________________________________________________（答出兩點）。②甲、乙原生質體經誘導融合完成的標志是________________。利用雜種細胞采用植物組織培養技術可以培育成雜種植株，該技術的核心步驟是_______________和____________.(2）已知西湖龍井含有的茶堿是植物細胞的代謝產物，具有提神、抗衰老功效。可用植物組織培養來實現茶堿的工業化生產。①若利用植物組織培養技術，可將龍井茶葉細胞培養到________階段，然后從________（填細胞器)中提取茶堿。②如果想獲得脫毒的龍井茶苗，可以切取一定大小的________等進行組織培養。解析：圖中不同物種的甲、乙細胞首先經過酶解法去壁處理，得到甲、乙兩種原生質體，經物理或者化學方法誘導融合，得到雜種細胞(新生細胞壁形成為標志),再經過組織培養過程，得到雜種植株。(1）①以胚狀體為材料，經過人工薄膜包裝得到的人工種子，在適宜條件下同樣能夠萌發成幼苗,與天然種子相比，人工種子具有的優點有：生產不受季節限制、不會出現性狀分離、能保持優良品種的遺傳特性、方便貯存和運輸等。②甲、乙原生質體經誘導融合完成的標志是形成新的細胞壁.植物組織培養技術包括脫分化和再分化兩個核心步驟.（2)①若利用植物組織培養技術，可將龍井茶葉細胞培養到愈傷組織階段，愈傷組織呈高度液泡化，然后從其液泡中提取茶堿。②莖尖、根尖和芽尖等分生區部位含有少量的病毒或不含病毒,因此如想獲得脫毒的龍井茶苗，可以切取一定大小的莖尖（根尖和芽尖也可)等進行組織培養。答案：（1）①生產不受季節、氣候和地域的限制；一般不會出現性狀分離、能保持優良品種的遺傳特性②形成新的細胞壁脫分化再分化(2）①愈傷組織液泡②莖尖（或根尖、芽尖）?題組二動物細胞工程及其應用的考查6．（2018·廣東佛山質檢)癌胚抗原(CEA）是某些癌細胞表面產生的一種糖蛋白，臨床上通過制備CEA的單克隆抗體來診斷癌癥。回答下列問題：（1）制備CEA的單克隆抗體時，首先將________注入小鼠體內，使小鼠產生免疫反應。然后從產生免疫反應小鼠的脾臟中獲取________細胞,將其與骨髓瘤細胞融合，該融合過程所利用的基本原理是________________。因為融合率不是100％，且融合過程具有________性，所以要對融合后的細胞進行篩選.篩選出的雜交瘤細胞還要經過多次篩選，最終獲得__________________________(答兩個特點）的雜交瘤細胞。(2）獲得雜交瘤細胞后，將其注射到小鼠腹腔內增殖或________，之后從中提取大量CEA抗體。CEA單克隆抗體的主要優點有________________________________________（答三個)。（3)CEA單克隆抗體與抗癌藥物偶聯后，可以使抗癌藥物定向作用于癌細胞，該過程所利用的免疫學原理為_______________________________________________________________。解析：（1）制備CEA的單克隆抗體時，首先將癌胚抗原注入小鼠體內，使小鼠產生免疫反應。然后從產生免疫反應小鼠的脾臟中獲取B淋巴細胞,細胞融合的原理為細胞膜具有一定的流動性.細胞融合過程具有隨機性,因此需要篩選出雜交瘤細胞。篩選出的雜交瘤細胞還要經過多次篩選最終獲得既能產生CEA(特異性)抗體，又能無限增殖的雜交瘤細胞。(2）單克隆抗體最主要的優點為特異性強、靈敏度高并可大量制備。(3)“生物導彈”是單抗上連接抗癌藥物，通過抗體和相應抗原(癌細胞)特異性結合,利用抗癌藥物或毒素殺傷和破壞癌細胞。答案：（1）癌胚抗原(CEA)B淋巴(或漿）細胞膜具一定的流動性隨機既能產生CEA（特異性)抗體，又能無限增殖（2)在體外培養特異性強、靈敏度高、可大量生產(3）抗原和抗體的特異性結合7．如圖是某實驗室做的通過動物纖維母細胞等獲得單克隆抗體的實驗研究。據圖回答相關問題:(1)過程①實施前需將誘導基因與________相連接構建________，在導入小鼠成纖維細胞時一般采用________法導入，此步驟中用到的工具酶有________________________________。（2)過程②的實質是________.甲細胞是________細胞，乙細胞是________細胞。（3)過程③一般用________誘導，丙細胞的特點是__________________________________________________________________________________________________________.解析:（1)基因工程操作過程中需要將目的基因與運載體連接構建基因表達載體，將目的基因導入動物細胞常用顯微注射法.基因工程中的工具酶是限制酶和DNA連接酶。（2）過程②是干細胞的分化過程,實質是基因的選擇性表達。由圖可知，病毒注入小鼠體內獲得的乙細胞是漿細胞(已免疫的B細胞)，所以甲是骨髓瘤細胞。（3)誘導動物細胞融合用滅活的病毒或PEG,丙細胞是雜交瘤細胞，其特點是既能迅速大量繁殖，又能產生專一的抗體.答案：(1）載體基因表達載體顯微注射限制酶、DNA連接酶（2）基因的選擇性表達骨髓瘤B(淋巴）（3）滅活的病毒(或聚乙二醇）既能迅速大量繁殖,又能產生專一的抗體［課堂加固訓練］練模擬做典題提高解題能力授課提示:對應學生用書第103頁1．（2018·湖南郴州質檢）利用基因工程技術培育馬鈴薯新品種，目前已經取得豐碩成果.請根據教材所學知識回答下列問題：(1）馬鈴薯易患多種疾病，導致其產量不高.通過導入抗病基因并使其表達可以提高馬鈴薯產量，基因工程中使用最多的抗病基因是______________________________和病毒的復制酶基因.（2）馬鈴薯是雙子葉植物，常用________________（方法)將目的基因導入馬鈴薯受體細胞中。構建好的基因表達載體基本結構包括目的基因、標記基因、________、________、________等五部分.（3)科學家還培育出抗除草劑的轉基因馬鈴薯，其設計方法：修飾除草劑作用的靶蛋白，使其對除草劑________(填“敏感”或“不敏感"），或使靶蛋白過量表達，植物吸收除草劑后仍能________。（4）將目的基因導入受體細胞后，還需對轉基因植物進行________________.解析：(1)在基因工程中，使用最多的抗病基因是病毒外殼蛋白基因和病毒的復制酶基因。(2）常用農桿菌轉化法將目的基因導入馬鈴薯等雙子葉植物的受體細胞中。構建好的基因表達載體的基本結構包括目的基因、標記基因、終止子、啟動子和復制原點等五部分。(3)培育抗除草劑的轉基因馬鈴薯，需通過修飾，使除草劑作用的靶蛋白對除草劑不敏感，或使靶蛋白過量表達，使植物吸收除草劑后仍能正常代謝。（4）將目的基因導入受體細胞后,還需對轉基因植物進行目的基因的檢測與鑒定。答案：(1)病毒外殼蛋白基因(2）農桿菌轉化法啟動子終止子復制原點（3）不敏感正常代謝(4）目的基因的檢測與鑒定2．大腸桿菌pUC18質粒是基因工程中常用的運載體，某限制酶在此質粒上的唯一酶切位點位于LacZ基因中,如果沒有插入外源基因,LacZ基因便可表達出β半乳糖苷酶,當培養基中含有IPTG和Xgal時,Xgal便會被β半乳糖苷酶水解成藍色，大腸桿菌將形成藍色菌落，反之，則形成白色菌落.如圖表示利用此質粒實施基因工程的主要流程.(1)已獲得的目的基因可利用________技術進行擴增。（2)目的基因插入質粒構建重組質粒的過程中，需要DNA連接酶恢復____________鍵。(3)將試管Ⅰ中的物質和大腸桿菌共同置于試管Ⅱ的目的是________;大腸桿菌需事先用Ca2＋進行處理，目的是____________________________________________________________。（4)將試管Ⅱ中的菌液接種于選擇培養基上培養，培養基中應含有大腸桿菌必需的營養物質,如________________________和生長因子，還應加入IPTG、Xgal以及氨芐青霉素,其中加入氨芐青霉素的作用是篩選出__________。(5）若觀察到培養基上出現________色菌落，則說明大腸桿菌中已成功導入了重組質粒。如果作為受體細胞的大腸桿菌也含有LacZ基因，則不利于重組質粒的篩選，原因是________________________________________________________________________。答案：(1)PCR（2)磷酸二酯(3）進行轉化使大腸桿菌細胞處于感受態(4）碳源、氮源、無機鹽、水導入pUC18質粒的大腸桿菌(5）白無論大腸桿菌是否導入重組質粒，均會呈現藍色菌落3．動植物細胞工程在農業生產、醫藥衛生等領域有著廣泛的用途。回答下列問題:(1）在將兩種植物細胞進行雜交之前，需要用________________酶進行處理,若將處理后的細胞放入較高濃度的蔗糖溶液中，會發生________________。誘導兩種植物細胞融合可以采用物理或化學的方法進行,常用的物理方法有________________（寫2種即可）。(2）融合的細胞形成愈傷組織,在愈傷組織的培養過程中，當生長素和細胞分裂素的比值________(填“高”或“低”）時，有利于叢芽的分化；通過上述過程獲得雜種植株依據的原理是________________________________________________________________________。（3)在制備單克隆抗體的過程中，融合的結果是出現多種不同的雜交細胞，需要在特定的培養基上進行篩選，從而得到________細胞.單克隆抗體與傳統方法獲得的抗體相比，具有________________________________________________________________________的特點，因此廣泛用于疾病的診斷等方面.解析:(1）植物體細胞雜交過程有兩個關鍵,一個是在將植物細胞進行雜交之前，必須去除細胞壁，該過程需要用到纖維素酶和果膠酶；另外一個是誘導原生質體的融合,方法包括物理法(離心、振動、電刺激)和化學法(聚乙二醇）。將處理后的細胞放入較高濃度的蔗糖溶液中，會發生滲透作用.（2)在愈傷組織的培養過程中，當生長素和細胞分裂素的比值低時，有利于叢芽的分化;通過題述過程獲得雜種植株依據的原理是細胞膜具有一定流動性和植物細胞具有全能性。(3)用特定的選擇培養基篩選出雜交瘤細胞，該雜交細胞既能夠大量增殖又能產生特異性抗體。與傳統方法獲得的抗體相比，單克隆抗體具有特異性強、靈敏度高、可大量制備的特點.答案：(1)纖維素酶和果膠滲透作用離心、振動、電激(2）低細胞膜的流動性、植物細胞具有全能性（3)雜交瘤特異性強、靈敏度高、可大量制備4．(2018·遼寧沈陽模擬）如圖為某單克隆抗體制備過程示意圖。請回答下列問題：(1）經過程①和過程②，細胞全能性的變化情況分別是________(填“變大”“變小”或“不變"）。（2)X細胞和Y細胞融合成Z細胞依據的原理是________.過程③需要在________培養基上培養。通過過程④得到的抗體的主要優點是________________。(3)在臨床試驗中，將抗癌細胞的單克隆抗體與________________、化學藥物或細胞毒素相結合制成“生物導彈”，注入體內，借助單克隆抗體的________作用將藥物帶到癌細胞所在位置并將其殺死。（4)圖中單克隆抗體的制備和克隆羊“多利"產生的過程中，都必須用到的動物細胞工程技術是____________________.在克隆技術倫理方面，我國政府的態度是_________________.解析：（1）據圖可知①相當于脫分化過程，獲得的誘導干細胞全能性較大，細胞分裂能力強；②過程是定向誘導分化過程，形成特定的組織細胞，該過程細胞全能性減小.（2)③過程為細胞融合過程,依據的原理是細胞膜的流動性；X細胞和Y細胞融合后，在培養基上有5種細胞，為獲得雜交瘤細胞，應將③過程獲得的細胞放在選擇培養基上進行培養；通過④過程獲得的單克隆抗體與普通抗體相比，具有特異性強、靈敏度高，并可以大量制備的優點.（3）將單克隆抗體與放射性同位素、化學藥物或細胞毒素相結合，制成“生物導彈”，注入病人體內，可以在原位殺死癌細胞，該過程利用了單克隆抗體的特異性識別癌細胞的作用（導向作用).(4）圖中單克隆抗體制備過程和克隆羊培育過程，都必須用到的動物細胞工程技術手段是動物細胞培養；在克隆技術倫理方面,我國政府的態度是禁止生殖性克隆人，不反對治療性克隆.答案：（1）變大、變小（2）細胞膜的流動性選擇特異性強、靈敏度高，并可以大量制備(3）放射性同位素導向(4)動物細胞培養禁止生殖性克隆人,不反對治療性克隆[限時規范訓練]練思維練規范練就考場滿分單獨成冊對應學生用書第155頁1．請回答以下有關基因工程的問題：（1)基因工程中切割DNA的工具酶是________。DNA連接酶根據其來源不同,分為________和________.（2）利用PCR技術擴增目的基因的前提是要有一段已知目的基因的核苷酸序列，以便根據這一序列合成________。（3）____________________是基因工程的核心步驟.啟動子是________識別和結合的部位，它能驅動基因轉錄出mRNA。(4)將目的基因導入植物細胞采用最多的方法是________。(5)要檢測轉基因生物的DNA上是否插入了目的基因，采用的方法是________技術。解析：（1)切割DNA的工具酶是限制性核酸內切酶（限制酶）。DNA連接酶根據來源不同分為E·coliDNA連接酶和T4DNA連接酶。(2）利用PCR技術擴增目的基因的前提是要有一段已知目的基因的核苷酸序列以便合成引物.(3)基因工程的核心步驟是構建基因表達載體.啟動子是RNA聚合酶識別和結合的部位.(4)目的基因導入植物細胞常用的方法是農桿菌轉化法。(5)檢測轉基因生物的DNA上是否插入了目的基因，需要采用DNA分子雜交技術。答案:（1)限制性核酸內切酶(限制酶）E·coliDNA連接酶T4DNA連接酶(順序可顛倒)（2)引物(引物對）（3)基因表達載體的構建RNA聚合酶(4)農桿菌轉化法（5)DNA分子雜交2．油菜中油酸為不飽和脂肪酸,能降低人體血液的膽固醇含量，減少人體患心血管病的風險.F基因控制合成的油酸酯氫酶催化油酸形成飽和脂肪酸，轉反義F基因油菜能提高菜籽油的油酸含量.請分析回答下列問題:（1)從油菜細胞的染色體DNA獲取F基因后進行大量擴增的方法為________。利用該方法擴增目的基因的前提是________________。(2）構建反義F基因表達載體時，需要用到的工具酶有________________；農桿菌可用來將反義F基因表達載體導入油菜細胞，從分子角度分析，其具有的特點是________________________________________________________________________。構建反義F基因表達載體時沒有設計標記基因，其可能的原因是________________________________________________________________________。(3）Le啟動子為種子特異性啟動子，將F基因反向連接在Le啟動子之后構建了反義F基因。檢測轉反義F基因油菜細胞內F基因轉錄的mRNA含量，結果表明，因雜交形成雙鏈RNA,細胞內F基因的mRNA水平下降。由此推測，反義F基因的轉錄抑制了F基因的________(填“復制”“轉錄”或“翻譯”)過程.若F基因轉錄時，兩條單鏈（a1、a2）中a1為轉錄的模板鏈，則反義F基因轉錄時的模板鏈為________。解析:（1)PCR技術是一項在生物體外復制特定DNA片段的核酸合成技術，采用該技術能在短時間內獲得大量目的基因,在擴增目的基因之前要利用一段F基因的核苷酸序列合成特定的引物。(2）構建基因表達載體時，首先需要用限制酶切割含有目的基因的外源DNA分子和運載體，其次還需要用DNA連接酶將目的基因與運載體連接形成重組DNA分子；因農桿菌的Ti質粒上的T－DNA可轉移至受體細胞，并且整合到受體細胞染色體的DNA上，故農桿菌轉化法為常用的將目的基因導入植物細胞的方法；標記基因表達產物,可能會對食品安全構成威脅，所以構建反義F基因表達載體時沒有設計標計基因，這樣不會產生標記基因表達產物，有利于食品安全.(3）mRNA是翻譯的模板，轉反義F基因油菜細胞內F基因轉錄的mRNA含量下降，可見反義F基因的轉錄抑制了F基因的翻譯過程。F基因轉錄形成的RNA能與反義F基因轉錄形成的RNA互補配對，若F基因轉錄時，兩條單鏈（a1、a2)中a1為轉錄的模板鏈，推測反義F基因轉錄時的模板鏈為a2。答案：（1)PCR技術有一段F基因的核苷酸序列（2)限制酶、DNA連接酶其Ti質粒上的T－DNA可轉移至受體細胞,并且整合到受體細胞染色體的DNA上無標記基因表達產物，有利于食品安全（3）翻譯a23．克隆豬成功率較低,與早期胚胎細胞異常凋亡有關。Bcl2基因是細胞凋亡抑制基因，用PCR技術可以檢測該基因轉錄水平，進而了解該基因與不同胚胎時期細胞凋亡的關系。克隆豬的培育及該基因轉錄水平檢測流程如圖。請回答:(1)圖中重組細胞的細胞核來自________細胞,早期胚胎移入受體子宮繼續發育，經桑椹胚、囊胚和________胚最終發育為克隆豬。（2）在PCR過程中可檢測出cDNA中Bcl2cDNA的分子數，進而計算總mRNA中Bcl2mRNA的分子數，從而反映出Bcl2基因的轉錄水平.①圖中X表示________過程.②在PCR過程中利用________技術可檢測出cDNA中Bcl2cDNA的分子數。(3）該過程所涉及的現代生物技術有早期胚胎培養、胚胎移植、________和________。（4)目前使用的供體細胞一般都選擇傳代10代以內的細胞，原因為________________________________________________________________________。解析：(1)圖中卵母細胞是受體細胞，良種豬的體細胞是供體細胞提供細胞核，形成重組細胞;早期胚胎發育經桑椹胚、囊胚和原腸胚，最終形成克隆豬。（2）①mRNA→cDNA的過程表示反轉錄過程。②在PCR過程中利用DNA分子雜交技術可檢測出cDNA中Bcl2cDNA的分子數。（3)據圖分析，該過程利用的技術有早期胚胎培養、胚胎移植、動物細胞培養和核移植技術。（4）供體細胞一般都選擇傳代10代以內的細胞，原因是傳代10代以內的細胞能保持正常的二倍體核型.答案:（1)體原腸（2)①反轉錄②DNA分子雜交(3）動物細胞培養核移植技術（4)傳代10代以內的細胞保持正常的二倍體核型4．為增加油菜種子的含油量，科研人員將酶D基因與位于葉綠體膜上的轉運肽基因相連，導入油菜細胞并獲得了轉基因油菜品種.(1)研究人員采用PCR技術獲取酶D基因和轉運肽基因，該技術是利用________的原理，使相應基因呈指數增加.所含三種限制酶(XbaⅠ、ClaⅠ、SacⅠ）的切點如圖所示，則用________和________處理兩個基因后，可得到酶D基因和轉運肽基因的融合基因。(2）將上述融合基因插入上圖所示Ti質粒的________中,構建基因表達載體并導入農桿菌中。為了獲得含融合基因的單菌落，應進行的操作是______________________________。隨后再利用液體培養基將該單菌落菌株振蕩培養，可以得到用于轉化的侵染液.(3）剪取油菜的葉片放入侵染液中一段時間的目的是______________________________，進一步篩選后獲得轉基因油菜細胞,提取上述轉基因油菜的mRNA，在逆轉錄酶的作用下獲得cDNA,再依據________的DNA片段設計引物進行擴增，對擴增結果進行檢測，可判斷融合基因是否完成________.最后采用抗原-抗體雜交法可檢測轉基因油菜植株中的融合基因是否成功表達.解析：（1）采用PCR技術擴增目的基因，利用的是DNA雙鏈復制的原理。轉運肽基因、酶D基因具有相同的酶切位點ClaⅠ,故用ClaⅠ和DNA連接酶處理兩個基因后可得到兩基因相連的融合基因.（2)利用農桿菌轉化法導入目的基因，需要將目的基因插入農桿菌Ti質粒的T-DNA中，所以構建基因表達載體需要將上述的融合基因插入Ti質粒的T-DNA中.重組Ti質粒上有四環素抗性基因,所以篩選含有融合基因的單菌落需要將獲得的農桿菌接種在含有四環素的固體培養基上培養，再利用液體培養基將篩選得到的單菌落菌株振蕩培養，可以得到用于轉化的侵染液.(3)受體細胞是植物細胞時通常采用農桿菌轉化法，故需剪取油菜的葉片放入侵染液中一段時間，利用農桿菌將融合基因導入油菜細胞。若融合基因完成轉錄，則提取轉基因油菜的mRNA，再逆轉錄獲得cDNA，cDNA可以在融合基因的引物作用下進行擴增，故可通過檢測擴增結果判斷融合基因是否完成轉錄。答案：(1）DNA雙鏈復制ClaⅠDNA連接酶(2）T.DNA將獲得的農桿菌接種在含四環素的固體培養基上培養(3)利用農桿菌將融合基因導入油菜細胞融合基因轉錄5．人外周血單核細胞能合成白細胞介素2(IL2）。該蛋白可增強機體免疫功能，但在體內易被降解。研究人員將IL2基因與人血清白蛋白（HSA）基因拼接成一個融合基因，在酵母菌中表達出具有IL2生理功能且不易降解的IL2HSA融合蛋白，技術流程如圖。請回答：(1)圖中③過程的模板是________,表達載體1中的位點________應為限制酶BglⅡ的識別位點，才能成功構建表達載體2。(2）表達載體2導入酵母菌后，融合基因轉錄出的mRNA中,與IL2蛋白對應的堿基序列不能含有__________，才能成功表達出IL2HSA融合蛋白。啟動子是________識別和結合的部位，有了它才能驅動基因轉錄出mRNA。（3）培養人外周血單核細胞時，需要將溫度控制在________℃，此外還需要通入________________(氣體)。（4）應用____________技術可檢測酵母菌是否表達出IL2HSA融合蛋白。(5）如果基因表達載體2導入的是優質奶牛的受精卵細胞，經胚胎培養后移入受體母牛子宮內可以存活的生理學基礎是_____________________________________________________.答案：(1）IL2的cDNAa(2）終止密碼子RNA聚合酶（3）37無菌的95%空氣和5％CO2(4)抗原—抗體雜交（5)母牛子宮對外來胚胎基本上不發生免疫排斥反應6．(2018·廣東肇慶模擬）“今又生"是我國為數不多的首創基因治療藥物之一，其本質是利用腺病毒和人P53基因(抑癌基因)拼裝得到的重組病毒。人的P53蛋白可對癌變前的DNA損傷進行修復,使其恢復正常,或誘導其進入休眠狀態或細胞凋亡，阻止細胞癌變。“今又生”的載體采用第一代人5型腺病毒,其致病力很弱，其基因不整合到宿主細胞的基因組中，無遺傳毒性;載體經基因工程改造后，只對細胞實施一次感染,不能復制，不會污染。請回答下列問題：（1)在“今又生"的生產中,為了獲得更高的安全性能,在載體一般應具備的條件中，科學家選擇性地放棄了一般載體都應具有的________________特點。檢測P53基因的表達產物，可以采用________________________技術。（2）如果要大量擴增P53基因，一般采用PCR技術，該技術中需使用一種特殊的酶：________________________。與體內DNA復制相比較，PCR反應要在______________中才能進行，并且要嚴格控制________條件。（3)如果要獲得胚胎干細胞進行研究,則胚胎干細胞可來源于囊胚的________________，或胎兒的原始性腺;在培養時，細胞充滿培養皿底部后停止分裂,這種現象稱為________。如果想繼續培養則需要重新用________處理，然后分瓶繼續培養,這樣的培養過程通常被稱為傳代培養。解析：(1)根據題干信息“載體經基因工程改造后，只對細胞實施一次感染，不能復制”可知，在“今又生”的生產中，為了獲得更高的安全性能,科學家選擇性地放棄了具有復制原點的載體.檢測目的基因是否表達產生蛋白質可采用抗原—抗體雜交技術。(2）PCR技術是在較高溫度下進行的，因此該技術中需使用熱穩定DNA聚合酶；與體內DNA復制相比較,PCR反應要在一定的緩沖溶液中才能進行,并且要嚴格控制溫度等條件.(3)胚胎干細胞來源于囊胚的內細胞團或胎兒的原始性腺；在培養時,細胞充滿培養皿底部后停止分裂，這種現象稱為接觸抑制.如果想繼續培養則需要重新用胰蛋白酶處理，然后分瓶繼續培養,這樣的培養過程通常被稱為傳代培養。答案:（1)自我復制抗原—抗體雜交（2）熱穩定DNA聚合酶(Taq酶）一定的緩沖溶液溫度（3）內細胞團接觸抑制胰蛋白酶7．應用植物組織培養技術,不僅可實現種苗的快速繁殖，培育無病毒植株,也可加快作物及苗木育種。下面是培育柑橘耐鹽植株的實驗流程:莖段→eq\a\vs4\al（愈傷,組織）eq\o(→，\s\up7(處理1:先用γ射線照射)，\s\do5(處理2：后在培養基中加入物質X)）eq\a\vs4\al（挑選生，長的愈,傷組織）→耐鹽植株回答下列問題：（1)愈傷組織是由離體的莖段經________________過程形成的,此時愈傷組織細胞_______________（填“具有”或“不具有")細胞的全能性。(2）對愈