干細(xì)胞研究及其應(yīng)用1

InearlyOctober,aColoradocouplehasababynamedAdam,whoseumbilicalcordstemcellscouldcurehissix-year-oldsisterMolly'sFanconianemia.2000年十月發(fā)生在美國(guó)Colorado的一個(gè)故事23TwoseparatedblastomeressubjectedtoFISHanalysistocheckthechromosomes5一、干細(xì)胞的概念干細(xì)胞是一類具有自我更新和分化潛能的細(xì)胞。6干細(xì)胞研究成為繼人類基因組大規(guī)模測(cè)序之后最具活力、最有影響和最有應(yīng)用前景的生命學(xué)科研究領(lǐng)域，1999年干細(xì)胞研究被美國(guó)《科學(xué)》雜志評(píng)為1999年度世界十大科學(xué)之冠，2000年干細(xì)胞研究再次被《科學(xué)》雜志評(píng)為該年度世界十大科學(xué)成就之一。

組織工程是以干細(xì)胞研究為基礎(chǔ)發(fā)展起來(lái)，它有望解決臨床上急需的人工組織與器官問(wèn)題，進(jìn)展極為迅速，已經(jīng)成為干細(xì)胞應(yīng)用的主要方向。79101113二、干細(xì)胞的分類按分化潛能大小來(lái)分類:全能干細(xì)胞（Totipotentstemcell

）：它具有形成完整個(gè)體的分化潛能。如受精卵，胚胎干細(xì)胞。在生物發(fā)育學(xué)里，當(dāng)精子和卵子結(jié)合成為受精卵后，一個(gè)受精卵分裂成為二個(gè)完全相同的細(xì)胞，二個(gè)細(xì)胞分裂成為四個(gè)細(xì)胞、八個(gè)細(xì)胞，在此時(shí)期此八個(gè)細(xì)胞中任何一個(gè)細(xì)胞單獨(dú)放入成熟女性子宮中均可發(fā)育成為單獨(dú)且完整之個(gè)體，此種細(xì)胞即稱為totipotentstemcells。14事實(shí)上，所謂同卵雙胞胎、三胞胎、四胞胎，即為受精卵分裂成二個(gè)或四個(gè)totipotentstemcells后，每個(gè)細(xì)胞單獨(dú)分開(kāi)發(fā)育，故成為雙胞胎或四胞胎，至于三胞胎則為四個(gè)totipotentstemcells中的一個(gè)在發(fā)育過(guò)程中不幸未能成熟之故。Totipotentstemcells時(shí)期大約僅維持四天，即進(jìn)入下一階段之發(fā)育，形成特殊分化細(xì)胞，稱為原始胚囊體（blastocyst）。15Pluripotentstemcells可分化成為特定組織的干細(xì)胞，如血液干細(xì)胞（heamatopoitentstemcells）、神經(jīng)干細(xì)胞（neuralstemcells）、皮膚干細(xì)胞（skinstemcells）等等。這些特定之干細(xì)胞僅能發(fā)育成為特定組織之分化細(xì)胞（end-differentiationcellterminalcells），例如血液干細(xì)胞除可不斷分裂成為相同之血液干細(xì)胞外，亦可接受不同刺激分化成為骨髓細(xì)胞和淋巴細(xì)胞；骨髓細(xì)胞則可進(jìn)一步分化成為紅血球、血小板、嗜中性粒細(xì)胞等。1718專能干細(xì)胞（multipotentstemcell

），這類干細(xì)胞只能向一種類型或密切相關(guān)的兩種類型的細(xì)胞分化，如上皮組織、基底層干細(xì)胞、肌肉中的成肌細(xì)胞等。19根據(jù)干細(xì)胞組織發(fā)生的名稱進(jìn)行分類:胎胎干細(xì)胞造血干細(xì)胞骨髓間質(zhì)干細(xì)胞肌肉干細(xì)胞成骨干細(xì)胞內(nèi)胚層干細(xì)胞視網(wǎng)膜干細(xì)胞胰腺干細(xì)胞21三、胚胎干細(xì)胞221998年美國(guó)有兩個(gè)小組分別培養(yǎng)出了人多能(pluripotent)干細(xì)胞：JamesA.Thomson在Wisconsin大學(xué)領(lǐng)導(dǎo)一個(gè)研究小組從人胚胎組織中培養(yǎng)出了干細(xì)胞株。他們使用的方法是：人卵體外受精后，將胚胎培育到囊胚階段，提取innercellmass細(xì)胞，建立細(xì)胞株。經(jīng)測(cè)試這些細(xì)胞株的細(xì)胞表面marker和酶活性，證實(shí)它們就是胚胎干細(xì)胞。用這種方法，每個(gè)胚胎可取得15－20個(gè)細(xì)胞用于培養(yǎng)。JohnD.Gearhart在JohnsHopkins大學(xué)領(lǐng)導(dǎo)另一個(gè)研究小組也從人胚胎組織中建立了干細(xì)胞株。他們的方法是：從受精后5－9周人工流產(chǎn)的胚胎中提取生殖母細(xì)胞(primordialgermcell)。由此培養(yǎng)的細(xì)胞株，證實(shí)具有多能干細(xì)胞的特征。

2325262930

InduceddifferentiationofhumanES-derivedcellsinculture.31Pluripotentmurineembryonicgermcellsidentifiedbyredstaining32Aculturedishcontaininghundredsofcoloniesofmurineembryonicgermcells.Eachred-stainedspotrepresentsanindividualcolonycomprisedofhundredsorthousandsofstemcells.331.ES細(xì)胞的全能性主要體現(xiàn)在以下幾方面：①形成畸胎瘤。將ES細(xì)胞注入同源動(dòng)物皮下可形成畸胎瘤，包括三個(gè)胚層細(xì)胞；②形成類胚體。培養(yǎng)ES細(xì)胞在非粘附底物中懸浮生長(zhǎng)，或控制增殖細(xì)胞數(shù)目。能夠使之生成類胚體，它是一個(gè)與畸胎瘤相似的多種系混雜的集合體、具有三個(gè)胚層組織；③直系分化。通過(guò)控制ES細(xì)胞生長(zhǎng)環(huán)境，或遺傳操縱特定基因表達(dá)，ES細(xì)胞可直接分化成某特定種系細(xì)胞，例如將神經(jīng)決定基因NeuroD2和NeuroD3轉(zhuǎn)人ES細(xì)胞，可使之分化為神經(jīng)細(xì)胞；④形成嵌合體。將ES細(xì)胞注射到同種動(dòng)物囊胚腔中后，可以形成嵌合體（chimera），ES細(xì)胞可以參與嵌合體各個(gè)器官包括生殖腺的發(fā)育。這是檢驗(yàn)一個(gè)細(xì)胞系是否為ES細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)。342.ES細(xì)胞生物學(xué)特性細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)及核型細(xì)胞的高度分化潛能堿性磷酸酶的表達(dá)胚胎階段特異性細(xì)胞表面抗原的表達(dá)35

ES細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)及核型

(1)各種動(dòng)物的ES細(xì)胞具有與早期胚胎細(xì)胞相似的形態(tài)結(jié)構(gòu)，胞體體積小，核大，有一個(gè)或幾個(gè)核仁。(2)ES細(xì)胞與卵圓柱期（eggcylinderstage）胚胎外胚層和胎兒生殖脊的原始生殖細(xì)胞類似。

(3)細(xì)胞中多為常染色質(zhì)，胞質(zhì)結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，散布著大量核糖體和線粒體，核型正常，保留了整倍體性質(zhì)。正常ES細(xì)胞染色體正常，如發(fā)生異常則其很難發(fā)育分化形成動(dòng)物個(gè)體。

36(4)ES細(xì)胞在體外分化抑制培養(yǎng)中，呈克隆狀生長(zhǎng)，細(xì)胞緊密地聚集在一起，形似鳥(niǎo)巢，細(xì)胞界限不清，克隆周圍有時(shí)可見(jiàn)單個(gè)ES細(xì)胞和分化的扁平狀上皮細(xì)胞。(5)ES細(xì)胞增殖迅速，每18—24h分裂增殖1次。(6)此外，其還可以在體外進(jìn)行選擇、操作、凍存。凍存的細(xì)胞可在需要時(shí)隨時(shí)解凍，繼續(xù)培養(yǎng)不失其原有特性，并且來(lái)自一個(gè)克隆的細(xì)胞具有同樣的特征。37

ES細(xì)胞的高度分化潛能

ES細(xì)胞的全能性是其區(qū)別于成纖維細(xì)胞等體細(xì)胞的顯著特點(diǎn)(1)ES細(xì)胞在體外需在飼養(yǎng)層細(xì)胞上培養(yǎng)才能維持其未分化狀態(tài)，一旦脫離飼養(yǎng)層就自發(fā)地進(jìn)行分化。(2)在單層培養(yǎng)時(shí)細(xì)胞自發(fā)分化成多種細(xì)胞，懸浮培養(yǎng)中：“簡(jiǎn)單類胚體”“囊狀胚體”細(xì)胞分化物。38(3)ES細(xì)胞可進(jìn)行誘導(dǎo)分化*用RA（維甲酸）作誘導(dǎo)90％以上的ES細(xì)胞分化為神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，*聚集培養(yǎng)的ES細(xì)胞誘導(dǎo)分化則可分化為有節(jié)律性收縮的心肌細(xì)胞。*將ES細(xì)胞注射到同源動(dòng)物皮下，可形成組織瘤，其細(xì)胞組成可代表3個(gè)胚層細(xì)胞。*用ES細(xì)胞作核供體進(jìn)行細(xì)胞核移植，可以得到可發(fā)育重構(gòu)胚和動(dòng)物個(gè)體。39

堿性磷酸酶的表達(dá)

許多資料表明，小鼠、大鼠的桑椹胚細(xì)胞和囊胚細(xì)胞均有堿性磷酸酶（AKP）表達(dá)，小鼠的EC細(xì)胞和ES細(xì)胞中均含有豐富的AKP。而在已分化的EC細(xì)胞和ES細(xì)胞中AKP呈弱陽(yáng)性或陰性。豬、兔的桑椹胚和早期囊胚AKP呈陽(yáng)性。因此，AKP常用來(lái)作為鑒定EC細(xì)胞或ES細(xì)胞分化與否的標(biāo)志之一。40胚胎階段特異性細(xì)胞表面抗原的表達(dá)

早期胚胎細(xì)胞表面均表達(dá)胚胎階段特異性表面抗原（SSEA－1）。在胚胎的原始外胚層細(xì)胞、ES細(xì)胞、EC細(xì)胞和原始生殖細(xì)胞的表面均可檢測(cè)到SSEA－1的表達(dá)。小鼠SSEA－1的表達(dá)自8細(xì)胞期開(kāi)始，直到原始外胚層形成期。早期囊胚ICM細(xì)胞全部呈強(qiáng)陽(yáng)性，晚期囊胚中部分ICM呈強(qiáng)陽(yáng)性，部分呈弱陽(yáng)性，少部分為陰性。因此，SSEA也常作為ES細(xì)胞鑒定的一個(gè)標(biāo)志。413.ES細(xì)胞的鑒定--細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)--核型分析--堿性磷酸酶（AKP）染色--SSEA-I免疫熒光標(biāo)記--分化能力檢測(cè)體外分化試驗(yàn)體內(nèi)分化試驗(yàn)嵌合體形成試驗(yàn)核移植試驗(yàn)42

ES細(xì)胞形態(tài)學(xué)鑒定

依ES細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)（胞體體積小，核大、有一個(gè)或幾個(gè)核仁）和生長(zhǎng)特性（呈克隆狀生長(zhǎng)，細(xì)胞緊密聚集，形似鳥(niǎo)巢，界限不清）對(duì)ES細(xì)胞進(jìn)行初步鑒定。43核型分析

ES細(xì)胞具有正常二倍體核型，可用核型分析進(jìn)行檢驗(yàn)44

堿性磷酸酶（AKP）染色

*常用快綠（FastGreenStaining)染色法，

*對(duì)照以已建系ES細(xì)胞（或小鼠的桑椹胚或囊胚）作為陽(yáng)性對(duì)照，

*作用液中不含α-萘酚磷酸鈉為陰性對(duì)照。

*結(jié)果判定陽(yáng)性對(duì)照ES細(xì)胞染成棕色，陰性對(duì)照無(wú)色。小鼠3．5日齡胚胎ICM為強(qiáng)陽(yáng)性。

45

SSEA-I免疫熒光標(biāo)記

第1抗體，SSEA－1（鼠抗ES細(xì)胞單克隆抗體），1:100稀釋；第2抗體，羊抗鼠1：10稀釋;封閉液，羊抗兔lgG。步驟①杜氏PBS洗3次,2％Triton作用20min；②再以杜氏PBS洗3次,封閉液中置20min；③以杜氏PBS洗3次，加第1抗體于4℃過(guò)液；④以杜氏PBS洗3次，加第2抗體于30℃溫箱置30min；⑤再以杜氏PBS洗3次后用甘油PBS封片。樣本在激光共聚焦圖像系統(tǒng)下觀察,結(jié)果依細(xì)胞是否出現(xiàn)熒光作出判斷。46

分化能力檢測(cè)體外分化試驗(yàn)體內(nèi)分化試驗(yàn)嵌合體形成核移植474.胚胎干細(xì)胞的制備(1)直接由動(dòng)物體內(nèi)獲取囊胚再分離ICM的方法，這樣得到的囊胚數(shù)量少，質(zhì)量也可能不高，由此會(huì)影響分離ES細(xì)胞的效率。(2)

卵細(xì)胞去核培養(yǎng)、轉(zhuǎn)入體細(xì)胞核，體外培養(yǎng)，獲得高質(zhì)量的去透明帶囊胚，由此囊胚進(jìn)一步分離得到胚胎干細(xì)胞。484950目前已證明，小鼠、兔、羊。豬、牛等多種動(dòng)物的桑椹胚以前以及囊胚的ICM細(xì)胞具有發(fā)育的全能性，因此桑胚胚或囊胚成為分離ES細(xì)胞的常用材料。ES細(xì)胞的分離早期胚胎的獲取及處理方法原始生殖細(xì)胞的獲取分化抑制物的選擇,包括：飼養(yǎng)層（feederlopr），條件培養(yǎng)基（conditionedmedium，CM）和分化抑制因子（differentiationinhibitoryactivity，DIA）基礎(chǔ)培養(yǎng)基的選擇添加物的選用51胚胎干細(xì)胞（embryonicstemcell，ES細(xì)胞）也可被稱為多能干細(xì)胞（pluripotentstemcell，PSC），是胚胎或原始生殖細(xì)胞經(jīng)體外抑制分化培養(yǎng)后篩選出的具有發(fā)育全能性的細(xì)胞。其可以定向誘導(dǎo)分化為幾乎所有種類的細(xì)胞，甚至形成復(fù)雜的組織和器官，其建系、體外擴(kuò)增、定向誘導(dǎo)分化、調(diào)控機(jī)制、細(xì)胞性能、組織重構(gòu)等方面的研究將在未來(lái)的人體發(fā)育、基因功能、藥物開(kāi)發(fā)、細(xì)胞治療和組織器官替代治療中發(fā)揮重要作用，并成為組織器官移植的新資源5.目前胚胎干細(xì)胞的研究52四、成體干細(xì)胞53

目前研究的成體干細(xì)胞（AdultStemCells）BoneMarrowHeamatopoieticStemCells(HSC)PeripheralBloodStemCells(PBSC)FetalLiverStemCellsUmbilicalCordBloodStemCellsNeuralStemCells

“StudiessuggestthatstemcellsindifferentadulttissuesmaybemoresimilarthanpreviouslythoughtandperhapsinsomecaseshaveadevelopmentalrepertoireclosetothatofEScells.”

Science,Volume288,Number5471,Issueof2Jun2000,pp.1660-166354造血干細(xì)胞HematopoieticStemCells，HSC，55造血干細(xì)胞作為干細(xì)胞研究與應(yīng)用的突破口1.造血細(xì)胞是細(xì)胞增殖分化的最佳模型。2.造血干／祖細(xì)胞及各系血細(xì)胞的表面標(biāo)志較為清楚，細(xì)胞表型特征可進(jìn)行定量分析，且可分選。3.造血干細(xì)胞增殖及向各系分化的重要誘導(dǎo)因子、受體、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、微環(huán)境等因素較為清楚。4.造血細(xì)胞發(fā)揮功能可相對(duì)游離，不需“生物支架”、神經(jīng)、血管、外科移植等復(fù)雜的“下游”工藝，因此便于直接應(yīng)用于臨床。56IsolationofPrimaryandImmortalizedCD34–HematopoieticandMesenchymalStemCellsfromVariousSources

StemCells,Vol.18,No.1,1-9,January200057Previousworkwithmiceandhumanhadshownthatadultbonemarrowstemcellscouldformliver,aswellasbone,cartilage,tendon,nerveandothertissues.1,NeilTheiseetal.;"LiverfromBoneMarrowinHumans";Hepatology32,11-16,July,2000.2,MalcolmAlisonetal.;"CellDifferentiation:HepatocytesfromNon-HepaticAdultStemCells";Nature406,257,July20,2000.3,SusanOkie,"BoneMarrowStemCellsOfferHopeforLiverTherapies;StudyofTransplantsShowsaTransformation";WashingtonPost,June27,2000.4,Dr.DavidWhitehouse,"Stemcellspromiseliverrepair";BBC,July19,2000.5,NeilTheiseetal.;"Derivationofhepatocytesfrombonemarrowcellsinmiceafterradiation-inducedmyeloablation";Hepatology31,235-240,January,2000.6,BryonPetersenetal.;"Bonemarrowasapotentialsourceofhepaticovalcells";Science284,1168-1170;May14,1999.58五、人類干細(xì)胞研究的應(yīng)用

1.ES系統(tǒng)已經(jīng)成為基因功能研究的有效手段2.ES細(xì)胞系建立后，可從最根本上揭示人及動(dòng)物發(fā)育過(guò)程中的決定基因3.ES細(xì)胞可作為評(píng)價(jià)新藥及化學(xué)產(chǎn)品的毒性及效能的檢測(cè)系統(tǒng)4.ES細(xì)胞有可能成為今后細(xì)胞替代療法和組織器官移植的最佳來(lái)源59人類干細(xì)胞的分離和體外培養(yǎng)成功，包括胚胎干細(xì)胞和特定組織或血液之干細(xì)胞，不僅代表人類生命科學(xué)的一項(xiàng)里程碑，在醫(yī)學(xué)技術(shù)和層次以及生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)上的發(fā)展，更是一項(xiàng)深具潛力和無(wú)限商機(jī)的發(fā)現(xiàn)。干細(xì)胞之應(yīng)用，可分成三大類：一、產(chǎn)生特定細(xì)胞或組織，作為細(xì)胞再生或組織移植和部份更新；二、對(duì)藥物開(kāi)發(fā)和研究產(chǎn)生新的理念，藥物的安全性和有效性可以特定干細(xì)胞進(jìn)行分析和篩選；三、基因表現(xiàn)、人類發(fā)育、疾病發(fā)生、癌癥研究等。60一、產(chǎn)生特定細(xì)胞或組織，作為細(xì)胞再生或組織移植和部份更新：許多疾病的發(fā)生，與細(xì)胞功能的喪失或組織的壞死有關(guān)，例如糖尿病、Parkinson‘s和