金屬銅離子與蛋白質內容：研究的目的及意義銅與血清白蛋白銅與血紅蛋白銅蛋白和銅酶研究目的及意義在真核生物體內，銅元素參與體內的許多生化反應，如作為電子傳遞鏈中的供體或受體；參與細胞內的呼吸；維持鐵的代謝平衡；用于色素、神經遞質的合成；作為氧化還原酶參與體內的抗氧化過程。但體內銅離子濃度過高時會產生毒性，改變細胞內的氧化還原狀態；與某些氨基酸殘基的側鏈發生非特異反應，導致蛋白質的錯誤折疊；與其它物質競爭酶的活性中心，干擾酶的正常功能；產生活性氧損害機體的DNA、蛋白質和脂類物質。所以，研究銅離子與生物分子的作用有重要意義。人血清白蛋白主要應用于臨床、新陳代謝和遺傳方面的研究，而牛血清白蛋白常常作為蛋白模型進行體外研究，如用于細胞培養，抗體載體等。BSA分子由583個氨基酸殘基組成。而HSA比BSA多2個氨基酸，即585個氨基酸殘基組成。兩者的差異在于BSA缺失HSA氨基酸序列116位和585位的殘基。熒光光譜法由于血清白蛋白含有色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸殘基,從而能發出熒光。在這些基團中Trp起主要作用,Tyr次之,Phe很弱可忽略，所以，一般認為蛋白質的熒光主要來自色氨酸的貢獻。當金屬離子與血清白蛋白結合后,可引起蛋白質或少數金屬離子(稀土離子)熒光的改變,由此可進行定性、定量研究蛋白質構象的變化。常用熒光猝滅法測定金屬離子與蛋白質的結合數和結合常數,用共振能量轉移法測定金屬離子與蛋白質分子中色氨酸殘基之間的距離。熒光淬滅可以分為靜態淬滅和動態淬滅。能降低熒光體發光強度的分子稱為猝滅劑。基態熒光分子與猝滅劑之間通過弱的結合生成復合物,且該復合物使熒光完全猝滅的現象稱為靜態猝滅。而激發態熒光分子與猝滅劑碰撞使其熒光猝滅則稱為動態猝滅。研究發現Cu2+能夠明顯猝滅BSA自身的特征熒光光譜,并且這種猝滅作用隨著Cu2+的濃度的增大而增強。由于BSA自身的特征熒光主要是其色氨酸殘基(Trp)產生的,表明隨著Cu2+濃度的增加,BSA的骨架結構發生了較大變化,使Trp暴露出來,造成BSA的熒光猝滅,猝滅機理主要為靜態猝滅。N-端三肽鏈(HSA為Asp1-Ala2-His3,BSA為Asp1-Thr2-His3)公認是Cu2+(Ⅱ)的強結合位點。通常金屬離子與Asp1的α-NH:和His3的咪唑基N及2個去質子肽氮(加上軸向的Asp1的羧基)配位,形成平面四邊形(四方錐)構型。N-端三肽鏈能夠結合金屬離子的原因應該是在于His咪唑基N的配位能力,還有三肽鏈的靈活易變,可以折疊圍繞金屬離子形成所需的特定空間構型。銅離子與血紅蛋白1.血紅蛋白簡介血紅蛋白（Hemoglobin,簡稱Hb）在體內擔任的功能是輸送氧氣，它能把從肺攜帶的氧經由動脈血運送給組織，又能攜帶組織代謝所產生的二氧化碳經靜脈血送到肺再排出體外。血紅蛋白化學式為C3032H4816O812N780S8Fe4其分子量約為64500，是含有4個肽鏈的四聚體。它是由四個亞基構成，分別為兩個α亞基和兩個β亞基，血紅蛋白的每個亞基由一條肽鏈和一個血紅素分子構成。血紅素與血紅蛋白結構當血紅蛋白不與氧結合的時候，有一個水分子從卟啉環下方與亞鐵離子配位結合，而當血紅蛋白載氧的時候，就由氧分子頂替水的位置。血紅素與它周圍的疏水性氨基酸殘基依靠范德華力保持確定的空間構象。銅離子與血紅蛋白相互作用血紅蛋白在280nm附近有一個吸收峰，這是由于蛋白質中芳香族氨基酸共軛鍵的紫外吸收所致，在400nm附近有一個索瑞(soret)吸收峰，這是血紅素卟啉環的π~π*躍遷帶，為強吸收峰。測試牛血紅蛋白醋酸緩沖液在加入銅離子醋酸緩沖液前后的紫外光譜發現，在血紅蛋白溶液中加入銅離子后，不論加入的銅離子濃度有多大，在280nm處的吸收峰均消失，而其400nm附近的強吸收峰則隨著銅離子濃度的增大降低越來越明顯(下圖左)，表明銅離子濃度越大，對蛋白質π~π*躍遷帶的破壞性越大。由此推測，Cu2+的加入，破壞了血紅蛋白中芳香族的共軛結構；而血紅素400nm處的soret吸收峰隨著時間的變化逐漸減弱,于是，在不含銅離子的2μmol/L血紅蛋白溶液中滴加不同濃度的Fe2+，發現隨著Fe2+的加入，400nm處的吸收峰增強。表明400nm處的吸收峰是血紅素Fe2+形成的卟啉環的特征吸收峰。血紅蛋白在370nm處無明顯的吸收峰，當銅離子加入后，此處吸收峰明顯增強。當反應進行了9小時后，形成了一個很寬的吸收帶，推測是Cu2+取代Fe2+后與血紅素卟啉環所形成銅絡合物的吸收峰。左：銅離子、鐵離子與血紅蛋白反應的紫外光譜圖右：銅離子與血紅蛋白反應16小時的紫外光譜圖最后采用電化學微分脈沖伏安法研究了Cu2+與Fe2+間的作用過程，進一步證實了紫外光譜得到的結論。亞鐵血紅素離子以鐵為中心體，形成6配位的正八面體弱場。按晶體場理論，Cu2+外層電子的3d9結構比Fe2+的3d6結構更容易形成穩定的配合物，導致Cu2+在與血紅素中的Fe2+進行競爭配位反應時獲得優勢，使得銅離子取代了血紅素中的亞鐵離子，從而使得體系的電化學性質及紫外光譜圖都發生了一定程度的變化。銅蛋白質參與生物體內的電子傳遞、氧化還原、氧的輸送以及活化過程。銅蛋白質按其光譜性質可分為三類:Ⅰ型銅,600nm附近有非常強的吸收,具有小的超精細偶合常數;Ⅱ型銅,具有一般銅(Ⅱ)配合物相近的分子吸光系數和超精細偶合常數;Ⅲ型銅,兩個銅原子彼此呈反強磁性相互作用,在330nm附近存在強吸收。按活性結構中含銅原子的個數又可分為單核、雙核和多核銅蛋白。含銅電子傳遞蛋白--Ⅰ型銅蛋白目前已知的Ⅰ型銅蛋白都是參與電子傳遞反應的銅蛋白，該類蛋白一般呈深藍色，所以也稱藍銅蛋白。根據晶體結構，I型銅蛋白中銅的配位環境為N2SS*，即兩個His側鏈上的咪唑氮原子、一個Cys側鏈上的硫原子和一個Met側鏈上的硫原子參與銅的配位，形成一個扭曲的四面體結構。Ⅰ型銅蛋白—質體藍素質體藍素存在于植物和藻類的葉綠體中，在光合作用下，從細胞色素接受電子再傳遞給葉綠體。質體藍素的分子質量約為11000D，氧化還原電位為370mV左右。它的活性中心的銅處于變形的四面體構型，由兩個His側鏈上的咪唑氮原子、一個Cys側鏈上的硫原子和一個Met側鏈上的硫原子與銅配位。氧化型質體藍素的結構基本上不隨pH變化而變化，而還原型質體藍素的結構隨pH變化而變化，當pH較低時，His87發生質子化，而且其咪唑環發生旋轉不再與銅離子配位。Ⅱ型銅蛋白--銅鋅超氧化物歧化酶與Ⅰ型銅蛋白相比，Ⅱ型銅蛋白活性中心在譜學上有幾點變化：(1)銅的氧化還原電位向正的方向移動；(2)與銅配位的原子由硫變為氮或氧，銅采取典型的四方錐配位構型；(3)電子光譜中吸收強度減弱；(4)電子自旋光譜中超精細偶合常數變大。Ⅱ型銅蛋白中的銅一般處于配位不飽和狀態，即留有空位，從而可以結合底物分子，并進行催化反應。代表蛋白：銅鋅超氧化物歧化酶（銅鋅SOD），它能有效地催化分解超氧負離子，是一種很好的抗氧化劑，起到保護生物體的作用。Cu2Zn2－SOD中含有兩個相同的亞基，其中每個亞基中含有一個Cu2+和一個Zn2+，他們通過一個組氨酸側鏈上的咪唑基團橋聯。兩個亞基之間主要是通過非共價鍵的疏水作用締合在一起。銅鋅SOD銅鋅SOD中每個銅離子與四個組氨酸側鏈上的咪唑氮原子配位，形成一個變形的四邊形，還有一個水分子在軸向上與銅離子配位，使銅離子為五配位的變形四方錐構型。每個鋅離子為四配位的變形四面體構型，由三個組氨酸側鏈的咪唑氮原子和一個天冬氨酸的羧基氧原子與鋅離子配位而成。在這個酶中,Cu2+可能決定了酶的催化特異性，而Zn2+則可能起到穩定蛋白質結構的作用。但全酶的活性需要兩只協同作用。含銅氧載體--Ⅲ型銅蛋白Ⅲ型銅蛋白的主要特點是在其活性中心含有兩個銅離子，并且兩個銅離子之間存在強的相互作用。典型代表有血藍蛋白和酪氨酸酶。血藍蛋白是一種氧載體，存在于蝸蟲、章魚等甲殼類和軟體類動物的血液中。還原型血藍蛋白還原型血藍蛋白的活性中心含有兩個一價銅離子，每個銅離子與三個組氨酸側鏈的咪唑氮原子配位，兩個銅離子之間未發現橋聯配體。兩個銅離子之間的空腔正好容納一個氧分子。氧化型血藍蛋白中盡管銅離子為二價d9構型，但由于兩個二價銅離子之間存在很強的反鐵磁相互作用，以致在室溫條件下，該雙核銅活性中心呈抗磁性。氧分子結合到血藍蛋白后，以過氧負離子狀態存在酪氨酸酶酪氨酸酶存在于哺乳動物中，具有兩種不同的