流式細胞術分析及應用1.流式細胞術的原理流式細胞術的應用流式細胞術的數據處理流式細胞術的樣品制備主要內容2.流式細胞儀(FlowCytometer):是集光電子物理，光電測量，計算機，細胞熒光化學，單抗技術為一體的高科技細胞分析儀。流式細胞術(FlowCytometry):利用流式細胞儀對處于快速流動的細胞或生物顆粒進行多參數、快速（每秒可達1000-10000個）的定量分析和分選（純度可達99%以上）的技術。一、流式細胞術的原理3.現代流式細胞儀包括液流系統聚焦細胞以供檢測光學系統

激發和收集光信號電子系統將光信號轉化為電信號，并使其數字化以供計算機分析

4.液流系統液流系統將樣本懸液聚焦在光源的中心處5.SampleFlowinOpticalCuvetteSampleLaminar

FlowLowSampleFlowRate12mL/minSheathSheathSampleLaminar

FlowSheathSheathOpticalCuvetteHighSampleFlowRate60mL/min6.樣品和鞘液流7.InjectorTipFluorescencesignalsFocusedlaserbeamSheathfluid8.流式細胞儀的光學系統激光(Laser)是一種相干光源，它能提供單一波長、單一方向、同步的穩定光照。激光波長:臺式機為固定波長488nm,635nm，大型機波長譜線寬包括325，457.9，488,514.5，520.8，530.9，568.3，633，647nm光收集系統是由若干組透鏡，濾波片，小孔組成，將產生的光信號引導至檢測器。9.流式細胞儀的光信號散射光信號熒光信號10.1.散射光信號前向角散射光（FSC,ForwardScatter）

入射激光的同向散射光信號

細胞相對大小及其表面積。側向角散射（SSC,SideScatter）

入射激光90角的散射光信號

細胞粒度及細胞內相對復雜性。11.前向角散射光——FSCFALSSensorLaser12.側向角散射光——SSCFALSSensor90LSSensorLaser13.散射光散射光能被用來區分不同細胞群體的基本形態上的差異

- 通常使用“散點圖”來看散射光信號

- 散點圖上的一個點就代表一個細胞顆粒的數據14.散點圖——DotPlotlysedwholeblood15.2.熒光信號熒光素吸收激光能量熒光素將吸收能量釋放，轉換為 振動能和熱能 釋放較入射光波長更長的光量子熒光素與特異抗體結合熒光抗體與細胞抗原結合越多，產生的熒光信號越強

16.Fluorochromespecification17.Compensation18.二、流式細胞術的應用細胞表型分析胞內蛋白的檢測細胞周期分析細胞因子測定分選細胞內鈣離子測量……19.1.細胞表型分析20.2.胞內蛋白的檢測21.22.3.細胞周期的檢測23.CFSE（羧基熒光素二醋酸鹽琥珀酰亞胺脂）

24.4.細胞凋亡的檢測25.1、熒光信號的面積：對熒光光通量進行積分2、DNA指數(DI)：相對DNA含量=樣品G0/G1細胞DNA含量平均數標準二倍體DNA量的平均數3、異倍體：非二倍體，包括近二倍體、四倍體、多倍體、非整倍體26.凋亡細胞的特點在形態上，早期細胞核固縮，染色體邊集在核膜內側顯新月體形、核碎裂；細胞漿和細胞器密度增高、細胞體積變小；細胞膜皺折卷曲，但早期細胞膜的完整性未受到破壞凋亡細胞的FSC降低，SSC增加。細胞壞死時，細胞腫脹，FSC增大，SSC也增大27.AnnexinVAssay

28.AnnexinV/PI雙染活細胞為（AnnexinV-/PI-）壞死細胞為（AnnexinV+/PI+）凋亡細胞（AnnexinV+/PI-）29.AnnexinVAssay----能夠區分死亡與凋亡30.5、細胞因子測定++Antigen(cytokines)FluorescenceDetectorantibodyCapturebeads

CaptureantibodyBeads31.BeadsProvideaFlexiblePlatformMultiplesizesBeadsprovideanexpandableassayplatformforusewithaflowcytometerDifferentintensitiesDifferentcolorswithdifferentintensities32.MultiplexedBeadsShadesofacolorAntibodycoupledbeads,emittingatdistinctFL3intensitiesVariousanalytesAntibodycoupledPElabel,emittingatFL2intensityproportionaltoanalyteconc.33.Example6-beadassayIL-8IL-1bIL-6IL-10TNFIL-12Capture

BeadsLysateorSupernatantSampleDetectorAntibodiesWashAnalyzeonflowcytometer34.CBAStandardcurves35.6、細胞分選488nmlaser+-ChargedPlatesSinglecellssortedintotesttubesFALSSensorFluorescencedetector36.37.

細胞分選38.三、流式細胞數的數據處理2.43.44.compensation45.46.分析軟件常用軟件FlowJo

47.Gating1.52.四、流式細胞術的樣品制備單細胞懸液，避免任何細胞沉積被檢細胞或顆粒大小0.2－40um樣品中至少20000個細胞，濃度105-106個/毫升53.抗體的選擇首選直接標記抗體熒光分子PE最強，適用于弱表達抗原

FITC最便宜，適用于強表達抗原間接標記：效果有時不太好54.實驗對照的設計空白對照：陰性對照：常用同型抗體對照單色分析：設同型抗體對照多色分析：同型對照，單陽性對照（單標）同型對照(Isotype)：使用與抗體相同種屬來源、相同亞型、相同劑量和相同的免疫球蛋白及亞型的免疫球蛋白，用于檢測由于抗體非特異性結合而產生的背景染色。陽性對照：檢測陰性時55.表面分子檢測樣品制備將細胞樣本制成單細胞懸液，注意懸液內不能有粘集，團塊，盡量避免多的細胞碎片。調整細胞濃度為5104-1×105個，用PBS洗兩次，用100ulPBS重懸細胞。加入適量Fc受體阻斷劑（與抗體匹配的動物的血清或IgG），4℃避光放置30分鐘。加入適量的特異性表面標記熒光抗體或獨特型對照抗體，4℃避光放置30分鐘。用PBS洗兩遍，用200ul固定液重懸細胞，上機檢測。56.胞內分子檢測的樣品制備收集細胞，調至1×106細胞/毫升。4%固定液重懸細胞，常溫或4℃