轉(zhuǎn)基因技術(shù)操作演示文稿現(xiàn)在是1頁(yè)\一共有30頁(yè)\編輯于星期日轉(zhuǎn)基因技術(shù)操作現(xiàn)在是2頁(yè)\一共有30頁(yè)\編輯于星期日目錄CONTENTS載體及相關(guān)工具結(jié)扎雄鼠顯微注射胚胎移植后代觀察現(xiàn)在是3頁(yè)\一共有30頁(yè)\編輯于星期日載體及相關(guān)工具載體介紹1相關(guān)工具準(zhǔn)備2現(xiàn)在是4頁(yè)\一共有30頁(yè)\編輯于星期日載體簡(jiǎn)介注:此慢病毒質(zhì)粒載體的全長(zhǎng)8860bp。由多種功能元件組成，其中包括5‘端和3’端的長(zhǎng)末端重復(fù)序列(LTR)，含有啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、整合信號(hào)及多聚腺苷化信號(hào)等調(diào)控序列；CMV啟動(dòng)子能夠在宿主細(xì)胞中持續(xù)表達(dá)外源基因的作用，同時(shí)能驅(qū)動(dòng)的綠色熒光蛋白（eGFP）報(bào)告基因eGFP

，可用于感染效率的檢測(cè)；穩(wěn)定篩選標(biāo)記嘌呤霉素抗性基因Puromycin；復(fù)制起點(diǎn)pUCori以及氨芐青霉素抗性基因Amp組件等。現(xiàn)在是5頁(yè)\一共有30頁(yè)\編輯于星期日相關(guān)工具準(zhǔn)備玻璃毛細(xì)吸管（移卵針）制作：1．雙手持毛細(xì)玻璃管，將其中部在酒精燈上進(jìn)行燒灼加熱，當(dāng)玻璃管中部變紅并充分軟化時(shí)，從火焰上離移開(kāi)并快速向兩側(cè)外拉。

2．在火焰上將拉長(zhǎng)后的毛細(xì)玻璃管燒斷，形成兩均等的毛細(xì)吸管。

3．用安瓶切割砂輪切斷毛細(xì)玻璃吸管，留10cm

長(zhǎng)左右。

4．在酒精燈上微微加熱毛細(xì)吸管，使其頭部吸口微縮、光滑。注意，過(guò)熱的溫度可能使吸口封住。現(xiàn)在是6頁(yè)\一共有30頁(yè)\編輯于星期日移卵針現(xiàn)在是7頁(yè)\一共有30頁(yè)\編輯于星期日結(jié)扎雄鼠

5%苯巴比妥鈉2.4ml麻醉6周以上的ICR雄鼠（腹腔注射）；腹部向上呈仰臥狀，剪凈手術(shù)部位被毛，75%酒精從內(nèi)向外消毒手術(shù)部位；剪開(kāi)約1cm切口，分離皮膚、肌肉層；找到輸精管，用絲線(xiàn)結(jié)扎輸精管兩端，剪斷輸精管，用鈍頭鑷子將整個(gè)器官送回腹腔；相同的方法處理另一邊輸精管；依次縫合肌肉層及皮膚切口。現(xiàn)在是8頁(yè)\一共有30頁(yè)\編輯于星期日結(jié)扎雄鼠現(xiàn)在是9頁(yè)\一共有30頁(yè)\編輯于星期日結(jié)扎雄鼠現(xiàn)在是10頁(yè)\一共有30頁(yè)\編輯于星期日轉(zhuǎn)基因動(dòng)物轉(zhuǎn)基因動(dòng)物：轉(zhuǎn)基因動(dòng)物是指將特定的外源基因?qū)雱?dòng)物受精卵或胚胎，使之穩(wěn)定整合于動(dòng)物的染色體基因組并能穩(wěn)定遺傳給后代的一類(lèi)動(dòng)物。

根據(jù)外源基因?qū)氲姆椒ê蛯?duì)象的不同，目前制作轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的方法主要有顯微注射法、反轉(zhuǎn)錄病毒法、胚胎干細(xì)胞(embryonicstemcell，ES細(xì)胞)法、電脈沖法、精子載體導(dǎo)入法等。現(xiàn)在是11頁(yè)\一共有30頁(yè)\編輯于星期日操作流程圖供體鼠超排與種公鼠合籠取胚顯微注射胚胎移植F1代檢測(cè)提取質(zhì)粒載體病毒包裝受體鼠與結(jié)扎鼠合籠現(xiàn)在是12頁(yè)\一共有30頁(yè)\編輯于星期日供體鼠超數(shù)排卵法

PMSG（孕馬血清促性腺激素）和HCG（人促性腺激素）間隔48h腹腔注射，促進(jìn)供體母鼠（B6，6-8周）排卵；注射后與種公鼠（B6，6-8周）合籠交配；同時(shí)將發(fā)情受體母鼠（ICR，6-8周）與結(jié)扎過(guò)的公鼠（ICR,6-8周）合籠交配，制作假孕母鼠模型；檢查陰栓，見(jiàn)栓表示交配成功，準(zhǔn)備下一步處理。現(xiàn)在是13頁(yè)\一共有30頁(yè)\編輯于星期日現(xiàn)在是14頁(yè)\一共有30頁(yè)\編輯于星期日檢查陰栓現(xiàn)在是15頁(yè)\一共有30頁(yè)\編輯于星期日取胚胎

頸椎脫臼處死供體母鼠，打開(kāi)腹腔，取輸卵管壺腹部，置于M2培養(yǎng)液*中；在體視顯微鏡下，與M2培養(yǎng)液*中用眼科鑷撕開(kāi)壺腹部，可見(jiàn)釋放出來(lái)的受精卵；用事先準(zhǔn)備的移卵針吸取受精卵置于新鮮M2培養(yǎng)液中清洗3-4次；放置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中待用。*

為M2培養(yǎng)液中加入了透明質(zhì)酸酶現(xiàn)在是16頁(yè)\一共有30頁(yè)\編輯于星期日現(xiàn)在是17頁(yè)\一共有30頁(yè)\編輯于星期日現(xiàn)在是18頁(yè)\一共有30頁(yè)\編輯于星期日顯微注射凹形載玻片礦物油M2培養(yǎng)液現(xiàn)在是19頁(yè)\一共有30頁(yè)\編輯于星期日顯微注射現(xiàn)在是20頁(yè)\一共有30頁(yè)\編輯于星期日顯微注射

調(diào)節(jié)持卵針、注射針和受精卵細(xì)胞,使之處于同一焦聚平面；持卵針減壓吸住受精卵，含有病毒懸液的注射針?lè)謩e從受精卵上極、下極以及中軸線(xiàn)3個(gè)角度刺入透明帶進(jìn)入卵周隙；

M16培養(yǎng)液培養(yǎng)并觀察存活率和分裂情況。現(xiàn)在是21頁(yè)\一共有30頁(yè)\編輯于星期日顯微注射現(xiàn)在是22頁(yè)\一共有30頁(yè)\編輯于星期日胚胎移植

取見(jiàn)栓的假孕母鼠，麻醉，在背部輸卵管壺腹部處開(kāi)口，暴露出膨大的壺腹部；

用移卵針先吸取一些M2培養(yǎng)液，后吸入一個(gè)小氣泡，再吸入含有受精卵的M2培養(yǎng)液，再接著做一個(gè)小氣泡，吸取一小段M2培養(yǎng)液；用組織鑷夾住卵巢上的脂肪堆，將卵巢、輸卵管及子宮網(wǎng)上拉出體外，在體視顯微鏡下找到膨大的壺腹部，用眼科鑷固定好壺腹部，后用尖利的針頭在靠近卵巢的膨大的壺腹部前刺開(kāi)一個(gè)小口；用移卵針插入小孔，輕輕吹出受精卵直到2個(gè)氣泡完全進(jìn)入輸卵管；將臟器放回腹腔，縫合。做完移植手術(shù)的小鼠放回籠子，保溫37℃直到清醒。現(xiàn)在是23頁(yè)\一共有30頁(yè)\編輯于星期日現(xiàn)在是24頁(yè)\一共有30頁(yè)\編輯于星期日現(xiàn)在是25頁(yè)\一共有30頁(yè)\編輯于星期日現(xiàn)在是26頁(yè)\一共有30頁(yè)\編輯于星期日M2培養(yǎng)液氣泡含受精卵的M2培養(yǎng)液M2培養(yǎng)液受精卵移卵針氣泡位置圖示現(xiàn)在是27頁(yè)\一共有30頁(yè)\編輯于星期日觀察F1代基因表達(dá)情況代孕母鼠產(chǎn)下F1代后，待F1代沒(méi)有長(zhǎng)出被毛之前，可用藍(lán)光手電筒檢測(cè)小鼠全身有無(wú)綠色熒光表達(dá)，有則表示外源基因隨著載體轉(zhuǎn)入成功；待F1代離乳后（一般在出生后