（優選）病原學免疫學及生化檢測現在是1頁\一共有51頁\編輯于星期五使用油鏡時，需在玻片上滴加香柏油。這是因為油鏡的放大倍數較高，而透鏡很小，光線通過不同密度的介質物體（玻片→空氣→透鏡）時，部分光線會發生折射而散失，進入鏡筒的光線少，視野較暗，物體觀察不清。如在透鏡與玻片之間滴加和玻璃折射率（n=1.52）相仿的香柏油（n=1.515），則使進入油鏡的光線增多，視野亮度增強，物象清晰。現在是2頁\一共有51頁\編輯于星期五一、微生物分類微生物雖然個體微小，但具有一定的形態結構和生理功能，所以按其結構和組成的差異分為三大類1、非細胞型微生物：體積微小，能通過濾菌器，只能在活細胞內生長繁殖，如病毒、噬菌體；2、原核細胞型微生物：僅有原始核，無核仁和核膜，缺乏完整的細胞器，如細菌、放線菌、支原體、衣原體；3、真核細胞型微生物：細胞核的分化程度較高，有核膜、核仁和染色體，胞質內有完整的細胞器，如霉菌、酵母菌、藻類等。現在是3頁\一共有51頁\編輯于星期五二、細菌生長繁殖的條件1、充足的營養。水、碳源、氮源、無機鹽和生長因子。2、合適的酸堿度。大多數為中性或弱堿性，即PH7.2-7.6。個別細菌在較堿性的培養基中生長良好。3、適宜的溫度。分為嗜冷菌、嗜熱菌、嗜溫菌。4、必要的氣體環境。主要是氧與二氧化碳。現在是4頁\一共有51頁\編輯于星期五三、細菌群體的生長繁殖分期1、遲緩期。此期中細菌體積增大，代謝活躍但不分裂，菌數并不增多。此期長短不一，從數小時到數天不等，視菌種、菌齡與接種菌量和營養物質的不同而異。2、對數生長或指數期。此期中細菌生長迅速，以恒定的速度進行分裂繁殖，菌數以幾何級數增長，增長極快。研究細菌的性狀最好選用此期的細菌。3、穩定期。對數期后，細菌繁殖速度逐漸下降，細菌繁殖數與死亡數幾近相等，活菌數保持穩定。4、衰亡期。活菌數急劇減少。現在是5頁\一共有51頁\編輯于星期五現在是6頁\一共有51頁\編輯于星期五四、細菌的染色1、分為單染法、復染法、特殊染色法、負染色法、熒光染色體法等。單染法：只用一種染液，可顯示細菌的形態與排列，不能顯示細菌的結構與染色反應的特性。原理：由于細菌在中性環境中一般帶負電荷，所以通常采用堿性染料如美藍、堿性復紅、結晶紫、孔雀綠、番紅等進行染色。這類染料解離后，染料離子帶正電荷，使細菌著色。現在是7頁\一共有51頁\編輯于星期五復染法：用兩種以上不同顏色的染料進行染色，除可觀察細菌的形態、排列、大小外，還能將細菌染成不同的顏色。常用的革蘭氏染色法和抗酸染色法即為復染法。現在是8頁\一共有51頁\編輯于星期五2、革蘭氏染色法2.1原理：依據的是細菌的細胞壁組成成分和結構的不同，革蘭氏陽性菌的細胞壁肽聚糖層厚，交聯而成的肽聚糖網狀結構致密，經乙醇處理發生脫水作用，使孔徑縮小，通透性降低，結晶紫與碘形成大分子復合物保留在細胞內而不被脫色，結果使細胞呈現紫色。而革蘭氏陰性菌肽聚糖層薄，網狀結構交聯少，而且類脂含量較高，經乙醇處理后，類脂被溶解，細胞壁孔徑變大，通透性增加，結晶紫與碘的復合物被溶出細胞壁，因而細胞被染色，再經番紅復染后細胞呈紅色。現在是9頁\一共有51頁\編輯于星期五2.2試劑：2.2.1堿性染料草酸銨結晶紫液；2.2.2媒染劑碘液，其作用是增強染料與菌體的親和力，加強染料與細胞的結合；2.2.3脫色劑乙醇，將染料溶解，使被染色的細胞脫色。利用不同細菌對染料脫色的難易程度不同，而加以區分；2.2.4復染液番紅溶液，目的是使經脫色的細菌重新染上另一種顏色，以便與未脫色菌進行比較。現在是10頁\一共有51頁\編輯于星期五2.3操作過程標本經固定后，先用結晶紫染色、再加碘液媒染、然后用乙醇脫色，最后用沙黃或復紅復染。2.4意義依據革蘭氏染色可將細菌分為陽性和陰性兩大類。由于陽性、陰性細胞壁等結構上的差別可造成對抗生素的敏感性不同，臨床上依據此，可選擇性針對用藥。現在是11頁\一共有51頁\編輯于星期五1.涂片固定2.單染—結晶紫染液第一次染色

1min

現在是12頁\一共有51頁\編輯于星期五3.媒染—碘-碘化鉀溶液浸濕30S4.脫色—95%乙醇溶液進行顏色洗脫5.復染—紅色的藩紅染液第二次染色

現在是13頁\一共有51頁\編輯于星期五2.5注意事項2.5.1制片是染色的關鍵，載片要清潔，不得沾污油脂，菌株才能涂布均勻。注意初次涂片時，取菌量不應過大，以免造成菌體重疊。2.5.2注意水流不得直接沖在涂菌處，以免將菌體沖掉。2.5.3脫色是革蘭氏染色的關鍵，必須掌握乙醇的脫色程度。若脫色過度則陽性菌被誤染為陰性菌，而脫色不夠時陰性菌被誤染為陽性菌。（拉絲試驗——未斷裂DNA螺旋）現在是14頁\一共有51頁\編輯于星期五現在是15頁\一共有51頁\編輯于星期五革蘭氏染色

1884年丹麥醫師Gram所發明現在是16頁\一共有51頁\編輯于星期五紫色者為G＋菌，紅色者為G—菌細菌呈現第一次染色的效果紫色，革蘭氏陽性菌（紫陽G＋）；呈現第二次染色的效果紅色；稱革蘭氏陰性菌（紅陰G-）現在是17頁\一共有51頁\編輯于星期五現在是18頁\一共有51頁\編輯于星期五五、細菌的培養和分離大多數細菌可以用人工方法培養，但必須根據不同細菌采取各自適宜的條件，如無菌技術、接種和分離方法、培養基和培養條件等1、樣品處理標本采集是否符合要求，直接影響細菌的檢測結果，因此要求除糞、痰、咽拭子等標本，其他樣本均應以無菌技術采集。標本盛于無菌容器內，根據目的菌的種類采用不同的方法采集，標本采集后及時冷藏送檢。現在是19頁\一共有51頁\編輯于星期五2、無菌技術2.1細菌學檢驗必須隨時防止污染和病原菌的擴散，為達到此目的而采取的技術就是無菌技術或無菌操作，在進行細菌培養檢查過程中，無論是標本采集或培養操作，均需嚴格執行無菌操作技術。2.2所用器具、培養基等必須嚴格滅菌，使用過程中不得與未經消毒物品接觸，忌長時間暴露于空氣手中，有蓋的應迅速蓋上。2.3滅菌的試管、玻璃等在打開蓋后及關閉前，口部應在火焰上通過1-2次，以殺滅可能從空氣中落入的雜菌；接種環或接種針每次使用前后，均應在火焰上燒灼滅菌，金屬棒或玻璃棒部分亦須轉動通過火焰3次。現在是20頁\一共有51頁\編輯于星期五2.4進行細菌檢驗的全過程應在無菌室、接種罩或生物安全柜內進行。2.5檢驗時忌用手接觸標本及已滅菌的器材內部，也勿用口吹以防其他雜菌混入培養物中。2.6打開瓶塞及試管塞時，應將塞子上端夾持于手指間適當位置，不得將棉塞任意放置別處。現在是21頁\一共有51頁\編輯于星期五3、接種、分離及結果觀察接種細菌應用接種環（針）來蘸取細菌標本，進行接種，其程序可分為：滅菌接種環冷卻蘸取細菌標本進行接種接種環滅菌5個程序。現在是22頁\一共有51頁\編輯于星期五細菌的接種與分離技術

平板分區劃線法每劃完一區，要將接種環滅菌

2斜面接種法--常用于雙糖管接種3液體接種法--糖類微量生化管4穿刺法-----常用于半固體接種5傾注平板法--自來水細菌計數6涂布接種法--紙片法藥敏試驗現在是23頁\一共有51頁\編輯于星期五現在是24頁\一共有51頁\編輯于星期五現在是25頁\一共有51頁\編輯于星期五現在是26頁\一共有51頁\編輯于星期五六、生化反應1、各種細菌具有各自獨特的酶系統，因而在代謝過程中所產生的分解和合成的代謝產物也不同，這些分解或合成代謝產物又各有不同的生化特點，利用此生化特點來檢查代謝產物以鑒別細菌的方法，稱為生化反應。2、生化反應主要分為糖類的代謝試驗、蛋白質和氨基酸的代謝試驗、有機酸鹽和銨鹽的利用試驗、呼吸酶類試驗及其他酶類試驗。現在是27頁\一共有51頁\編輯于星期五2.1碳水化合物的代謝試驗

糖、醇、苷發酵試驗

糖細菌→生長分解糖產酸PH↓現在是28頁\一共有51頁\編輯于星期五不同微生物分解利用糖類的能力有很大差異，或能利用或不能利用，能利用者，或產氣或不產氣。可用指示劑及發酵管檢驗。現在是29頁\一共有51頁\編輯于星期五淀粉水解試驗某些細菌可以產生分解淀粉的酶，把淀粉水解為麥芽糖或葡萄糖。淀粉水解后，遇碘不再變藍色。現在是30頁\一共有51頁\編輯于星期五O/F（葡萄糖）試驗細菌分解葡萄糖時利用分子氧—氧化型(O)無氧降解—發酵型(F)不分解葡萄糖—產堿型(-)一管加石臘油FO堿現在是31頁\一共有51頁\編輯于星期五ONPG試驗

鄰-硝基酚＋β-半乳糖（黃色）β-半乳糖苷酶

細菌＋鄰-硝基-半乳糖

陽性-黃色陰性對照-無色現在是32頁\一共有51頁\編輯于星期五本試驗可同時觀察乳糖和蔗糖發酵產酸或產酸產氣（變黃）；產生硫化氫（變黑）。葡萄糖被分解產酸可使斜面先變黃，但因量少，生成的少量酸，因接觸空氣而氧化，加之細菌利用培養基中含氮物質，生成堿性產物，故使斜面后來又變紅，底部由于是在厭氧狀態下，酸類不被氧化，所以仍保持黃色。1.下黃上不黃為分解葡萄糖，不分解乳糖2.上下均黃為分解葡萄糖、乳糖3.上下均不黃為非發酵菌4.中間變為黑色為產H2S現在是33頁\一共有51頁\編輯于星期五沙門氏菌的TSI試驗現在是34頁\一共有51頁\編輯于星期五VP、MR試驗

葡萄糖丙酮酸乙酰甲醇→二乙酰＋胍基→紅色VP陽性

肺炎克雷伯菌甲酸、乙酸PH↓＋甲基紅試劑→紅色MR陽性

大腸埃希菌VPMR陽陰陽對現在是35頁\一共有51頁\編輯于星期五V-P試驗某些細菌在葡萄糖蛋白胨水培養基中能分解葡萄糖產生丙酮酸，丙酮酸縮合，脫羧成乙酰甲基甲醇，后者在強堿環境下，被空氣中氧氧化為二乙酰，二乙酰與蛋白胨中的胍基生成紅色化合物，稱V－P（+）反應。現在是36頁\一共有51頁\編輯于星期五甲基紅（MethylRed）試驗腸桿菌科各菌屬都能發酵葡萄糖，在分解葡萄糖過程中產生丙酮酸，進一步分解中，由于糖代謝的途徑不同，可產生乳酸，琥珀酸、醋酸和甲酸等大量酸性產物，可使培養基PH值下降至pH4.5以下，使甲基紅指示劑變紅。現在是37頁\一共有51頁\編輯于星期五2.2蛋白質和氨基酸代謝試驗

★吲哚試驗

細菌＋（色氨酸酶）蛋白胨水吲哚＋柯氏試劑→紅色現在是38頁\一共有51頁\編輯于星期五靛基質（Imdole）試驗某些細菌能分解蛋白胨中的色氨酸，生成吲哚。吲哚的存在可用顯色反應表現出來。吲哚與對二甲基氨基苯醛結合，形成玫瑰吲哚，為紅色化合物。現在是39頁\一共有51頁\編輯于星期五★尿素試驗

＋細菌→NH3、PH↑→紅色尿素陽性尿素現在是40頁\一共有51頁\編輯于星期五尿素酶（Urease）試驗有些細菌能產生尿素酶，將尿素分解、產生2個分子的氨，使培養基變為堿性，酚紅呈粉紅色。1、未接種2、尿素酶陽性3、尿素酶陰性現在是41頁\一共有51頁\編輯于星期五★苯丙氨酸脫氨酶試驗

苯丙氨酸＋細菌→苯丙酮酸＋FeCI3→綠色

現在是42頁\一共有51頁\編輯于星期五★氨基酸脫羧酶試驗

石蠟油葡萄糖溴甲酚紫精aa葡萄糖溴甲酚紫賴aa葡萄糖溴甲酚紫烏aa葡萄糖溴甲酚紫對照管現在是43頁\一共有51頁\編輯于星期五2.3碳源和氮源利用試驗

★枸櫞酸鹽試驗

細菌＋檸檬酸三鈉→Na2CO3PH↑→深藍色

現在是44頁\一共有51頁\編輯于星期五枸椽酸鹽試驗某些細菌能利用枸椽酸鹽作為碳源，及磷酸銨作為氮源，將枸椽酸鹽分解為二氧化碳，培養基反應后成堿性，由于指示劑的作用，培養基變為蘭色。現在是45頁\一共有51頁\編輯于星期五★硝酸鹽還原試驗

細菌＋NO3－----------NO2

NO2＋對氨基苯磺酸（甲液）→對重氮基苯磺酸

對重氮基苯磺酸＋α-萘胺（乙液）→紅色（＋）

NO3－＋細菌＋甲、乙液→無色（-）＋鋅粉（還原劑）紅色為陰性無色為陽性NO3－＋細菌→NO2→N2↑＋NH3↑現在是46頁\一共有51頁\編輯于星期五2.4酶類試驗細菌＋血漿結合凝固酶

纖維蛋白→肉眼可見凝集細菌＋血漿游離凝固酶＋纖維蛋白→血漿凝固

★CAMP試驗

B群鏈球菌產生CAMP因子，促進金葡溶血更好

★凝固酶試驗現在是47頁\一共有51頁\編輯于星期五七、血清學試驗1、基本概念1.1血清學試驗是利用抗原抗體在適宜條件下的體外特異反應，可作為抗原抗體的檢測。1.2抗原：是一種刺激機體引起免疫反應，產生抗體和（或）致敏淋巴細胞，并能在體外與其相應的抗體（或）致敏淋巴細