第三章基因組結構的維持與改變現在是1頁\一共有71頁\編輯于星期五

基因組結構維持與改變基因組的相對穩定(維持)是物種生存的需要：依靠復制（模板依賴性）與修復基因組改變是進化的基礎基因組改變的類型：1)突變(mutation)小范圍序列改變單個或幾個核苷酸的替換、插入、缺失來源于DNA復制錯誤或誘變破環。2)重組(recombination)大范圍序列重建同源重組、位點特異性重組、轉座來源于染色體內或染色體間序列的交換。現在是2頁\一共有71頁\編輯于星期五

基因組改變與修復現在是3頁\一共有71頁\編輯于星期五主要內容基因組復制突變與DNA修復重組與轉座現在是4頁\一共有71頁\編輯于星期五第一節基因組復制現在是5頁\一共有71頁\編輯于星期五半保留復制與拓撲結構問題1953年，Watson&Crick提出DNA雙螺旋結構同年，提出復制的可能方式：兩條母鏈均可作為模板來合成新DNA鏈半保留復制DNA雙螺旋結構的難題—拓撲結構問題：復制時兩條鏈如何打開？

現在是6頁\一共有71頁\編輯于星期五DNA復制的三種可能途徑現在是7頁\一共有71頁\編輯于星期五半保留復制的實驗證明—Meselson-Stahl實驗（1）在含有15NH4Cl的培養基中培養大腸桿菌將細菌轉移到正常培養基（含14NH4Cl）分別于細菌分裂一次和兩次后取樣，密度梯度離心現在是8頁\一共有71頁\編輯于星期五半保留復制的實驗證明—Meselson-Stahl實驗（2）細胞中必然存在著一種解決拓撲學問題的方法現在是9頁\一共有71頁\編輯于星期五拓撲異構酶—解旋酶解決了拓撲問題催化斷裂-再連接反應的酶。在DNA分子一條或兩條鏈上形成切口，通過切口解開螺旋。現在是10頁\一共有71頁\編輯于星期五在復制過程中拓撲異構酶解旋DNA雙螺旋現在是11頁\一共有71頁\編輯于星期五以半保留模式為主體的不同復制形式替代復制滾環復制現在是12頁\一共有71頁\編輯于星期五復制過程DNA的復制發生在細胞周期的S期起始延伸終止現在是13頁\一共有71頁\編輯于星期五復制起始—雙向復制基因組中形成兩個復制叉（復制眼），分別以一條鏈為模板，雙向復制每條鏈復制中，DNA合成方向相同：5’到3’兩條鏈復制行進的方向相反現在是14頁\一共有71頁\編輯于星期五基因組結構與復制起點復制起始存在著固定的位點，復制起點(originofreplication)細菌：環形基因組只有單一的復制起點真核生物：線性基因組存在多個復制起點酵母：332個人類：20000個現在是15頁\一共有71頁\編輯于星期五大腸桿菌復制起點復制起點oriC，長約245bp2個重復基序1）9核苷酸5拷貝DnaA蛋白結合位點結合30個DnaA蛋白2）13核苷酸3拷貝富含AT幾個解旋相關蛋白

DnaA,HU,DnaCDnaB解旋酶現在是16頁\一共有71頁\編輯于星期五酵母復制起點自主復制序列ARS，不足200bp含四個具相似序列的亞結構域：A+B1起始識別序列約40bp，為起始識別復合物（ORC)結合部位B3與大腸桿菌復制起點相似結合ARS結合因子（ABF1)，從而使B2的雙螺旋結構解開現在是17頁\一共有71頁\編輯于星期五高等生物復制起點目前仍難以確認將某些復制起始區域轉入復制缺陷性質粒后不能重建復制能力存在酵母ORC蛋白同源基因現在是18頁\一共有71頁\編輯于星期五復制延伸在復制起點形成復制叉母代雙鏈中一條連續復制，稱前導鏈；一條不連續，稱滯后鏈（半不連續）DNA聚合酶引物現在是19頁\一共有71頁\編輯于星期五參與DNA復制的DNA聚合酶細菌5個，其中DNA聚合酶III是復制酶真核生物9個，其中DNA聚合酶δ是復制酶現在是20頁\一共有71頁\編輯于星期五前導鏈連續合成，后滯鏈非連續合成合成方向：5’到3’滯后鏈合成中，最初形成一些短的片段，稱岡崎片段細菌岡崎片段長約1000-2000個核苷酸，真核生物的岡崎片段則短得多，少于200個核苷酸模板依賴性的DNA聚合酶需要引物來啟動單鏈上的DNA合成

現在是21頁\一共有71頁\編輯于星期五非連續合成中的引物與引發酶RNA引物：DNA聚合酶不能作用于無引物的單鏈模板，而RNA聚合酶可以細菌中引發酶（primase）合成4-15bp的引物引發酶不是轉錄酶現在是22頁\一共有71頁\編輯于星期五細菌和真核生物在DNA合成引發中的差異

細菌只需引發酶合成RNA引物真核生物由引發酶和DNA聚合酶α形成復合物合成RNA引物和其后的約20個DNA核苷酸現在是23頁\一共有71頁\編輯于星期五大腸桿菌復制需要多種蛋白的協作拓撲異構酶、解旋酶(DnaB)：解旋DNA聚合酶III：復制引發酶；提供引物單鏈結合蛋白（SSB)：穩定打開的雙鏈

連接酶：連接岡崎片段其它蛋白

現在是24頁\一共有71頁\編輯于星期五大腸桿菌復制中解旋酶的作用DnaB是大腸桿菌中復制相關的主要解旋酶，是一種5’->3’解旋酶它可以沿后滯鏈移動，同時使堿基對斷裂另外兩種3’->5’解旋酶：PriA、Rep拓撲異構酶解除解旋所產生的扭轉張力現在是25頁\一共有71頁\編輯于星期五大腸桿菌復制中單鏈結合蛋白的作用單鏈結合蛋白（SSB），復制中打開的單鏈容易重新結合及降解，SSB是一種缺乏酶活性的蛋白，會結合到多聚核苷酸上防止兩條鏈的重新結合及降解。大腸桿菌SSB是由4個相同的亞基組成。當復制復合物開始復制時，SSB必須與單鏈分離，這一作用由復制介導蛋白（replicationmediatorprotein,RMP）來完成。現在是26頁\一共有71頁\編輯于星期五引發小體（primosome）與復制體（replisome）引發小體,復制起始中，解旋酶結合到起點以后形成引發前復合物，然后引發酶結合，形成引發小體。引物合成后，由DNA聚合酶III二聚體來延伸。DNA聚合酶III二聚體與引物小體結合稱為復制體。現在是27頁\一共有71頁\編輯于星期五大腸桿菌復制中完成滯后鏈合成的方式復制酶DNA聚合酶III不具備5’->3’外切酶活性，到達下一個岡崎片段末端的RNA引物時停止DNA聚合酶I和RNaseH共同作用去除RNA引物，代之以DNA

現在是28頁\一共有71頁\編輯于星期五真核生物中后滯鏈合成的方式RNaseH模型：RNaseH去除引物至其最后一個核苷酸，側翼內切核酸酶(FEN1)去除最后一個核苷酸和部分DNA側翼模型：DNA聚合酶δ和解旋酶使引物與模板間堿基對斷開，并被推成分支，再有FEN1切除分支現在是29頁\一共有71頁\編輯于星期五大腸桿菌基因組復制終止不允許發生的情況現在是30頁\一共有71頁\編輯于星期五存在終止序列：Tus蛋白識別位點Tus蛋白的不同結合方向控制了復制叉是否能夠通過現在是31頁\一共有71頁\編輯于星期五真核生物線性DNA分子末端的維持：所復制的DNA分子可能變短的問題現在是32頁\一共有71頁\編輯于星期五線性DNA分子的末端變短的原因現在是33頁\一共有71頁\編輯于星期五真核生物DNA末端(端粒)由端粒酶合成人類染色體末端的延伸由端粒酶完成染色體末端延伸過程的完成現在是34頁\一共有71頁\編輯于星期五端粒長度和衰老癌癥有關現在是35頁\一共有71頁\編輯于星期五Cell：莊小威揭示端粒功能新機制現在是36頁\一共有71頁\編輯于星期五第二節突變與DNA修復現在是37頁\一共有71頁\編輯于星期五復制中的突變復制中的自發錯誤盡管DNA聚合酶存在校正能力，但是但突變仍不可避免大腸桿菌的復制錯誤率1/107，經修復后基因組復制總錯誤率降至1/1011-10

點突變轉換嘌呤到嘌呤或嘧啶到嘧啶顛換嘌呤到嘧啶或嘧啶到嘌呤插入或缺失出現在編碼區可能導致移碼其它區域可能導致多態性（復制滑移）現在是38頁\一共有71頁\編輯于星期五物理和化學誘變導致突變化學：1）堿基類似物替代標準堿基參與復制5-溴尿嘧啶和2-氨基嘌呤2）脫氨3）烷化4）嵌入溴化乙錠物理：1）紫外輻射形成嘧啶二聚體2）電離輻射3）加熱現在是39頁\一共有71頁\編輯于星期五突變可能不影響基因組存在很多不影響基因組功能的突變沉默突變：1）突變在基因間非調控區域或基因間非編碼區域，對整體基因組功能無影響的突變。可發生在人類基因組的98.5%。2）編碼區的突變不影響編碼蛋白的氨基酸序列，同義突變

現在是40頁\一共有71頁\編輯于星期五點突變對基因編碼區的四種影響同義：突變后，由于密碼子兼并性，而不影響所編碼的氨基酸非同義：引起氨基酸的錯誤編碼無義：引起過早終止通讀：引起無法終止現在是41頁\一共有71頁\編輯于星期五編碼區的插入或缺失突變可能導致不同的影響插入或缺失的核苷酸是3的倍數，僅影響個別氨基酸，因此影響可能較小非3的倍數，將導致移碼現在是42頁\一共有71頁\編輯于星期五非編碼區突變可能影響基因組的功能基因表達調控區域的突變：順式作用元件，如核心啟動子、關鍵調節序列內含子剪接位點的突變：如5’剪接點現在是43頁\一共有71頁\編輯于星期五DNA聚合酶確保DNA復制精確性的機制核苷酸選擇聚合前選擇正確的核苷酸校對3’到5’外切酶活性，聚合后切除錯配的核苷酸現在是44頁\一共有71頁\編輯于星期五四類DNA修復系統直接修復切除修復針對誘變損傷錯配修復針對復制錯誤重組修復現在是45頁\一共有71頁\編輯于星期五人類DNA修復基因現在是46頁\一共有71頁\編輯于星期五切除修復主要修復系統，人類參與蛋白最多的修復系統堿基切除單核苷酸切除15個基因參與核苷酸切除一段核苷酸切除28個基因參與現在是47頁\一共有71頁\編輯于星期五堿基切除修復DNA糖基化酶切除堿基，產生無堿基（AP）位點AP內切核酸酶產生單核苷酸切口DNA聚合酶填補堿基DNA連接酶連接斷裂現在是48頁\一共有71頁\編輯于星期五核苷酸切除與UvrAB修復系統現在是49頁\一共有71頁\編輯于星期五錯配修復中子代DNA的識別針對復制錯誤，所以發生與子代DNA分子一個問題：如何區分子代DNA分子?大腸桿菌中子代新生分子尚未甲基化，從而可以區分甲基化位點：5’-GATC-3’A甲基化5’-CCA/TGG-3’C甲基化現在是50頁\一共有71頁\編輯于星期五錯配修復與Mut修復系統現在是51頁\一共有71頁\編輯于星期五雙鏈斷裂修復比單鏈損傷嚴重可能由電離輻射和化學誘變產生也可能由重組產生也稱為重組修復現在是52頁\一共有71頁\編輯于星期五SOS應答回避是生存的一種方式修復難以進行時繞過主要損傷位點，允許某些復制錯誤保留，繼續復制現在是53頁\一共有71頁\編輯于星期五第三節重組與轉座現在是54頁\一共有71頁\編輯于星期五重組與進化重組，各種包括多聚核苷酸斷裂和再連接的過程。沒有遺傳重組就沒有進化重組使不利和有利的突變得以分離，使適者生存，因此是自然選擇的遺傳學基礎。重組的一般類型----同源重組（一般性重組）位點特異性重組（同源區很短）轉座現在是55頁\一共有71頁\編輯于星期五同源重組（Homologousrecombination）同源重組，也叫一般性重組（generalrecombination）,發生在具有高度序列同源性的DNA片段之間。這些片段可處在不同染色體上，也可以是同一染色體的不同部分。真核生物中，發生于減數分裂時期，負責減數分裂中的互換。現在是56頁\一共有71頁\編輯于星期五同源重組的Holliday模型交換連接分支遷移斷裂Holliday結構分離現在是57頁\一共有71頁\編輯于星期五重組是由于異源雙鏈體DNA間發生斷裂與重連兩條雙鏈DNA分子間的重組關鍵是單鏈的交換交換產生異源雙鏈體DNA片段當雙鏈體DNA的單鏈與相對應的另一雙鏈體中的單鏈發生置換時，會產生一個分叉結構（Holliday結構）分叉遷移使交叉點移動，封閉切口兩次（相互的）交換才能產生一個聯合分子聯合分子可以通過切開相接的鏈來形成兩條分開的雙鏈體分子現在是58頁\一共有71頁\編輯于星期五Holliday結構與重組體的形成重組體是否形成取決于參與交換的鏈在解離過程中是否被切開切開，則水平分離，基因組不是重組體，但包含異源雙鏈體DNA不切開，則垂直分離，產生互相重組的基因組現在是59頁\一共有71頁\編輯于星期五Holliday模型的缺陷與Meselson-Radding修正模式Holliday模型的缺陷：切口是如何出現在兩條分子的同一位置的？單分子切口切口鏈侵入未打開的雙螺旋，形成D-環被取代鏈斷開，形成另一個分子上的切口修正：在兩分子切口形成過程中引入交換的D環現在是60頁\一共有71頁\編輯于星期五大腸桿菌重組系統：1）RecBCD形成單鏈切口

RecBCD具有核酸內切酶活性和解旋酶活性內切酶：于Chi位點切開單鏈chi位點5’-GCTGGTGG-3’解旋酶：使單鏈末端游離現在是61頁\一共有71頁\編輯于星期五大腸桿菌重組系統2)RecA鏈交換DNA聚合酶填補間隙RuvA,B分叉遷移RuvC切除Holliday連接點現在是62頁\一共有71頁\編輯于星期五Holliday模型修正后無法解釋基因轉換配子（AA)X配子（aa)合子（AAaa)單倍體孢子（A或a)正常情況：A/a=1/1基因轉換：A/a不=1/1現在是63頁\一共有71頁\編輯于星期五雙鏈斷裂模型單分子雙鏈斷裂外切酶使斷裂擴大一個3’端侵入未打開的雙螺旋，形成D-環另一個3’端鏈延伸相互移動形成雙交換，即形成兩個Holliday結構現在是64頁\一共有71頁\編輯于星期五兩個Holliday結構的解離可以解釋基因轉換現在是65頁\一共有71頁\編輯于星期五位點特異性重組（site-specificrecombination）同源重組是發生于兩段高度序列同源的DNA區域間，但是這種廣泛同源的區域并不是重組的必要條件，該過程也能由兩個只具有很短相同序列的DNA分子引發。這稱為位點特異性的重組。λDNA整合到大腸桿菌基因組中現在是66頁\一共有71頁\編輯于星期五λDNA整合到大腸桿菌基因組中參與的酶整合通過att位點，λ基因組中的attP位點和大腸桿菌基因組中的attB位點，之間的特異性重組進行。每個結合位點的中心有一個15bp的相同的核心序列