實(shí)驗(yàn)八凝膠過(guò)濾法分離蛋白質(zhì)第1頁(yè)/共22頁(yè)實(shí)驗(yàn)八凝膠過(guò)濾法分離蛋白質(zhì)凝膠過(guò)濾即凝膠過(guò)濾層析(gelfiltrationchromatography)分子排阻層析(molecularexclusionchromatography)分子篩層析(molecularsievechromatography)凝膠滲透層析(gelpermeationchromatography)第2頁(yè)/共22頁(yè)一．目的要求：學(xué)習(xí)和掌握凝膠過(guò)濾層析分離蛋白質(zhì)的原理與方法。

第3頁(yè)/共22頁(yè)二．原理當(dāng)不同大小的蛋白質(zhì)混合物流經(jīng)凝膠層析柱時(shí):比凝膠網(wǎng)孔大的分子不能進(jìn)入珠內(nèi)網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，而被排阻在凝膠珠之外，隨著溶劑在凝膠珠之間的孔隙向下移動(dòng)；比網(wǎng)孔小的分子能不同程度地自由出入凝膠珠的內(nèi)外。大分子物質(zhì)先被洗脫出來(lái)，小分子物質(zhì)后被洗脫出來(lái)。第4頁(yè)/共22頁(yè)Sephadex按交聯(lián)度大小分8種型號(hào)，G值代表不同交聯(lián)度。

SephadexG-10，15，25，50，75，100，150，200數(shù)字表示每克干膠膨脹時(shí)吸水量的10倍。SephadexG-25代表每克干膠膨脹時(shí)可以吸水2.5克。第5頁(yè)/共22頁(yè)常用Sephadex分離范圍第6頁(yè)/共22頁(yè)

瓊脂糖第7頁(yè)/共22頁(yè)三、器材與試劑1×20cm層析柱、葡聚糖凝膠Sephadex-50、蒸餾水、三角鐵架、

4mg/ml藍(lán)色葡聚糖溶液、6mg/ml細(xì)胞色素C溶液、2mg/ml重鉻酸鉀溶液。第8頁(yè)/共22頁(yè)四、實(shí)驗(yàn)操作1、凝膠溶脹取SephadexG-5015g，加500ml蒸餾水室溫溶脹一天（或沸水浴中溶脹1小時(shí)）。待溶脹平衡后，傾去上層清液，包括細(xì)顆粒，然后再放些蒸餾水?dāng)噥y，靜置使凝膠下沉，再傾去上層清液，至無(wú)細(xì)顆粒為止。第9頁(yè)/共22頁(yè)實(shí)驗(yàn)操作2、裝柱取1×20cm層析柱一根，底部出口套上乳膠塑料管，向?qū)游鲋鶅?nèi)加蒸餾水趕走在層析柱下過(guò)濾層的死體積和接口處的氣泡，在蒸餾水高度約占層析柱內(nèi)部總體積的1/3時(shí)，關(guān)閉下端出口。自頂部緩緩加入Sephadex-50懸液，待底部凝膠沉積1-2cm時(shí)，再打開(kāi)出口，凝膠加至離層析柱頂部約3cm即可。用蒸餾水過(guò)柱幾遍，以穩(wěn)定床體積(不能讓凝膠表面露出水面)。在裝柱過(guò)程中，凝膠柱內(nèi)若有氣泡和分離斷層現(xiàn)象時(shí)，可用玻棒攪動(dòng)消除這些現(xiàn)象或重新裝柱，裝柱結(jié)束后其凝膠表面應(yīng)平整第10頁(yè)/共22頁(yè)實(shí)驗(yàn)操作

3、加樣：取4mg/ml藍(lán)色葡聚糖溶液、6mg/ml細(xì)胞色素C溶液、2mg/ml重鉻酸鉀溶液各6滴混合，即為上柱樣品。將出口打開(kāi)，使表面的蒸餾水流出，直至恰好與表面相平（不可使床面干掉），關(guān)緊出口，用滴管將上述樣品緩緩地加到床表面。打開(kāi)出口，讓樣品進(jìn)入床內(nèi)，直至樣品全部進(jìn)Sephadex凝膠柱，關(guān)緊出口。滴加蒸餾水使之成2cm水柱。不要使平整的床表面攪動(dòng)第11頁(yè)/共22頁(yè)實(shí)驗(yàn)操作4、洗脫和收集調(diào)節(jié)蠕動(dòng)泵流速，使得進(jìn)水速度0.3ml/min。打開(kāi)出口，讓柱內(nèi)液體緩慢流出,流速0.3ml/min，取小試管20支，每管收集1ml，觀察兩種顏色出現(xiàn)的管號(hào)。不能讓凝膠表面露出水面第12頁(yè)/共22頁(yè)實(shí)驗(yàn)操作5、繪制洗脫曲線。

第13頁(yè)/共22頁(yè)五、注意事項(xiàng)接頭不漏氣，連接用的小乳膠管不要有破損，否則造成漏氣、漏液裝柱要均勻，不要過(guò)松也不要過(guò)緊，最好也在要求的操作壓下裝柱，流速不宜過(guò)快，避免因此而壓緊凝膠。但也不要過(guò)慢，使柱裝得太松，導(dǎo)致層析過(guò)程中，凝膠床高度下降。始終保持柱內(nèi)液面高于凝膠表面，否則水分揮發(fā)，凝膠變干。

第14頁(yè)/共22頁(yè)六、思考題根據(jù)實(shí)驗(yàn)中遇到的各種問(wèn)題，總結(jié)做好本實(shí)驗(yàn)的經(jīng)驗(yàn)與教訓(xùn)，完成實(shí)驗(yàn)報(bào)告。比較幾種蛋白質(zhì)分離方法的特點(diǎn)

第15頁(yè)/共22頁(yè)附錄：HPLC高壓液相色譜第16頁(yè)/共22頁(yè)附錄：凝膠過(guò)濾常用填料1：葡聚糖凝膠（Polydextran），商品名稱是Sephadex2：

聚丙稀酰胺凝膠（Polyacrylamide）3：瓊脂糖凝膠第17頁(yè)/共22頁(yè)葡聚糖凝膠（Sephadex）Sephadex不溶于溶劑，親水性強(qiáng)，能迅速在水和電解質(zhì)溶液中膨脹，在堿性的環(huán)境中穩(wěn)定。

Sephadex的分離范圍與填料粒經(jīng)和交聯(lián)度密切相關(guān)。第18頁(yè)/共22頁(yè)Superdex屬于葡聚糖以共價(jià)結(jié)合到交聯(lián)多孔瓊脂糖珠體上的球形凝膠，流速快、反壓低。

第19頁(yè)/共22頁(yè)聚丙稀酰胺凝膠（Polyacrylamide）Polyacrylamide合成凝膠，商品名Bio-GelP，干粉顆粒狀。化學(xué)性質(zhì)不活潑，極端的pH會(huì)被水解，水解后產(chǎn)生的COOH-具有離子交換的性質(zhì)，因此pH值應(yīng)盡量控制在2-10之間。P后面的數(shù)字乘以1000為最大過(guò)濾限度。第20頁(yè)/共22頁(yè)瓊脂糖凝膠Agarosegel是一種大孔凝膠，主要用于像核酸或病毒這些分子量400,000以上的物質(zhì)。顆粒軟，50度以上會(huì)融化，需低溫的環(huán)境中進(jìn)行層析。Agarose做成beads后不能再脫水干燥，所以濕態(tài)中保存。商品名Sepharos