許多生命活動(dòng)是以蛋白質(zhì)分子的結(jié)合和解離來(lái)實(shí)現(xiàn)的，細(xì)胞的各種重要生理活動(dòng)，細(xì)胞對(duì)外界環(huán)境及內(nèi)環(huán)境作用的反應(yīng)等，均是以蛋白質(zhì)間相互作用為紐帶，形成信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)。第一頁(yè)，共23頁(yè)。穩(wěn)定相互作用形成蛋白質(zhì)復(fù)合體

（proteincomplex）瞬時(shí)相互作用（enzyme-substrate）生物學(xué)效應(yīng)穩(wěn)定的相互作用與瞬間的相互作用共同構(gòu)成蛋白質(zhì)相互作用的內(nèi)涵。第二頁(yè)，共23頁(yè)。蛋白質(zhì)相互作用關(guān)系的復(fù)雜性，超出任何個(gè)人或特定機(jī)構(gòu)的研究能力。如何研究蛋白質(zhì)相互作用？第三頁(yè)，共23頁(yè)。酵母蛋白質(zhì)相互作用聯(lián)絡(luò)圖人蛋白質(zhì)相互作用聯(lián)絡(luò)圖如此復(fù)雜的相互作用，哪些是有相關(guān)功能的？哪些是“噪音”？第四頁(yè)，共23頁(yè)。蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用研究方法酵母雙雜交系統(tǒng)(Yeasttwo-hybridsystem,Y2H)串聯(lián)親和純化(Tandemaffinitypurification,TAP)免疫共沉淀(Co-immunoprecipitation,Co-IP)雙分子熒光互補(bǔ)(Bimolecularfluorescencecomplementation,BiFC)熒光共振能量轉(zhuǎn)移(Fluorescenceresonanceenergytransfer,FRET)第五頁(yè)，共23頁(yè)。酵母雙雜交系統(tǒng)(Y2H)很多真核生物的轉(zhuǎn)錄因子如酵母Gal4由兩個(gè)具有不同功能的結(jié)構(gòu)域組成：轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域(Transcriptionalactivationdomain,AD)和DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(DNAbindingdomain,BD)。BD可識(shí)別DNA上的特異序列，并使轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域定位于所調(diào)節(jié)的基因的上游，AD可和轉(zhuǎn)錄復(fù)合體的其他成分作用，啟動(dòng)它所調(diào)節(jié)的基因的轉(zhuǎn)錄。lacZUASADBDlacZ第六頁(yè)，共23頁(yè)。兩種待檢測(cè)蛋白(X、Y)分別和AD、BD

融合表達(dá),X與Y之間的相互作用就可以將BD和AD在空間結(jié)構(gòu)上重新聯(lián)結(jié)為一個(gè)整體而與報(bào)告基因的上游激活序列（upstreamactivationsequence）結(jié)合，進(jìn)而發(fā)揮激活轉(zhuǎn)錄的功能，使受調(diào)控的報(bào)告基因得到表達(dá)。lacZUASADYBDXlacZ第七頁(yè)，共23頁(yè)。第八頁(yè)，共23頁(yè)。優(yōu)點(diǎn)：簡(jiǎn)便、易用、費(fèi)用低廉，能檢測(cè)到瞬時(shí)或較弱的蛋白質(zhì)相互作用；缺點(diǎn)：較高的假陽(yáng)性，不能真實(shí)反映蛋白質(zhì)在自身細(xì)胞中的相互作用，表達(dá)的融合蛋白最終要運(yùn)送到酵母細(xì)胞核，而有些蛋白可能具有其他亞細(xì)胞定位信號(hào)肽等。第九頁(yè)，共23頁(yè)。蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用研究方法酵母雙雜交系統(tǒng)(Yeasttwo-hybridsystem,Y2H)串聯(lián)親和純化(Tandemaffinitypurification,TAP)免疫共沉淀(Co-immunoprecipitation,Co-IP)雙分子熒光互補(bǔ)(Bimolecularfluorescencecomplementation,BiFC)熒光共振能量轉(zhuǎn)移(Fluorescenceresonanceenergytransfer,FRET)第十頁(yè)，共23頁(yè)。串聯(lián)親和純化(TAP)基因構(gòu)建：在目標(biāo)蛋白的一端依次導(dǎo)入鈣調(diào)蛋白結(jié)合肽、TEV蛋白酶切位點(diǎn)和蛋白標(biāo)簽(如蛋白A、寡聚組氨酸肽段等)，進(jìn)而在宿主細(xì)胞中進(jìn)行融合表達(dá)，在生理?xiàng)l件下形成與目標(biāo)蛋白相互作用的蛋白復(fù)合物。第十一頁(yè)，共23頁(yè)。串聯(lián)親和純化分離純化：第一步利用與蛋白標(biāo)簽具有親和作用的色譜柱結(jié)合標(biāo)簽；第二步洗脫后采用TEV蛋白酶斷裂TEV蛋白酶切位點(diǎn)；第三步利用與鈣調(diào)蛋白結(jié)合肽具有親和作用的鈣調(diào)蛋白色譜柱結(jié)合鈣調(diào)蛋白標(biāo)簽；第四步洗脫蛋白，進(jìn)一步進(jìn)行鑒定。第十二頁(yè)，共23頁(yè)。串聯(lián)親和純化優(yōu)點(diǎn)：能減少非特異性蛋白結(jié)合，能保留蛋白復(fù)合物在細(xì)胞內(nèi)的修飾和結(jié)合狀態(tài)。缺點(diǎn)：需要較多的樣本材料來(lái)提取蛋白，價(jià)格比較昂貴,不能高效檢測(cè)到瞬時(shí)或較弱的蛋白質(zhì)相互作用。第十三頁(yè)，共23頁(yè)。蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用研究方法酵母雙雜交系統(tǒng)(Yeasttwo-hybridsystem,Y2H)串聯(lián)親和純化(Tandemaffinitypurification,TAP)免疫共沉淀(Co-immunoprecipitation,Co-IP)雙分子熒光互補(bǔ)(Bimolecularfluorescencecomplementation,BiFC)熒光共振能量轉(zhuǎn)移(Fluorescenceresonanceenergytransfer,FRET)第十四頁(yè)，共23頁(yè)。兩種蛋白在細(xì)胞內(nèi)發(fā)生相互作用時(shí)會(huì)形成兩種蛋白的復(fù)合物，這樣就可以先用一種蛋白的抗體把免疫復(fù)合物沉淀下來(lái)，然后用另一種蛋白的抗體進(jìn)行Westernblotting檢測(cè)。免疫共沉淀第十五頁(yè)，共23頁(yè)。免疫共沉淀優(yōu)點(diǎn)：可以保留蛋白質(zhì)的修飾和結(jié)合狀態(tài)，同時(shí)所需的樣本量較少,實(shí)驗(yàn)成本較低，減少了純化步驟，能檢測(cè)到瞬時(shí)和較弱的蛋白相互作用；缺點(diǎn)：Co-IP特異性較低，洗脫混合物中往往含有較多的非特異結(jié)合蛋白。因此，Co-IP檢測(cè)到的潛在相互作用蛋白需要通過(guò)BiFC、FRET等其他方法進(jìn)一步驗(yàn)證。第十六頁(yè)，共23頁(yè)。蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用研究方法酵母雙雜交系統(tǒng)(Yeasttwo-hybridsystem,Y2H)串聯(lián)親和純化(Tandemaffinitypurification,TAP)免疫共沉淀(Co-immunoprecipitation,Co-IP)雙分子熒光互補(bǔ)(Bimolecularfluorescencecomplementation,BiFC)熒光共振能量轉(zhuǎn)移(Fluorescenceresonanceenergytransfer,FRET)第十七頁(yè)，共23頁(yè)。原理是將熒光蛋白分成兩個(gè)無(wú)獨(dú)立功能的片段，分別與需要檢測(cè)的蛋白X和蛋白Y融合表達(dá)，如果bait融合蛋白和prey融合蛋白存在相互結(jié)合作用，而這種結(jié)合促使熒光蛋白的兩個(gè)片段相互作用發(fā)出熒光。雙分子熒光互補(bǔ)技術(shù)第十八頁(yè)，共23頁(yè)。優(yōu)勢(shì)：能簡(jiǎn)單方便地通過(guò)觀察熒光鑒定蛋白質(zhì)相互作用，不依賴外源的熒光素或顯色劑等，能檢測(cè)到瞬時(shí)或者較弱的相互作用，并且可提供亞細(xì)胞定位信息。缺陷：融合蛋白的相互結(jié)合和熒光發(fā)生有一定時(shí)間延遲，一些融合蛋白的結(jié)合是不可逆的，不能實(shí)時(shí)反應(yīng)蛋白質(zhì)的結(jié)合和分離情況。第十九頁(yè)，共23頁(yè)。蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用研究方法酵母雙雜交系統(tǒng)(Yeasttwo-hybridsystem,Y2H)串聯(lián)親和純化(Tandemaffinitypurification,TAP)免疫共沉淀(Co-immunoprecipitation,Co-IP)雙分子熒光互補(bǔ)(Bimolecularfluorescencecomplementation,BiFC)熒光共振能量轉(zhuǎn)移(Fluorescenceresonanceenergytransfer,FRET)第二十頁(yè)，共23頁(yè)。基本原理：分別將bait蛋白、prey

蛋白與相應(yīng)的供體熒光基團(tuán)(如ECFP)和受體熒光基團(tuán)(如EYFP)融合,當(dāng)bait蛋白和prey

蛋白相互結(jié)合作用時(shí),供體基團(tuán)和受體基團(tuán)兩者之間的距離很近(約10nm),供體基團(tuán)的發(fā)射光激發(fā)受體基團(tuán)發(fā)射熒光。常用的供體熒光蛋白和受體熒光蛋白對(duì)有BFP-GFP、BFP-EGFP、CFP-YFP等。熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)第二十一頁(yè)，共23頁(yè)。優(yōu)點(diǎn)：能比較可靠地反映蛋白質(zhì)相互作用時(shí)的