題目：非干細胞樣的肺細胞可形成腫瘤血管內皮細：：RongWang等研究表明，膠質瘤樣干細胞能分化為內皮細胞參與膠質瘤血管的形成，而膠質瘤細胞系卻不能形成內皮細胞。然而，我們的研究表明，在ND/SCID小鼠身上接種非干細胞樣的肺腺癌細胞A549(C133/CD3/CD10)形成的腫瘤血管中有人的內皮細胞產生。非干細胞樣的A549產生的肺癌細胞和內皮細胞均無干細胞相關標記分子CD133和干細胞相關的mir（miA54在體外內皮細胞培養基條件下也能非干細胞樣的肺細胞能轉化成內皮細胞這將提示腫瘤細胞非干細胞樣的A549(CD133-/CD31-/CD105-)是肺細胞克隆(CD133-源性和鼠源性EndoglinPCR產物片段分子量2產物進序所得序列與genbank中人與小鼠的序列比對完全一致(序列見附件)。Westernblot結果顯示，NOD/SCID小鼠皮下接種A549成瘤組織中既有鼠CD105分子的表達也有人CD105分子的表達（圖3。進一步采用免疫組織化學分析發現NOD/SCID小鼠皮下接種A549成瘤組織的血管中有人血管內皮細胞標記分子4圖1流式結果檢查表明非干細胞樣的A549CD133，也

2EndoglinPCR擴增結果電泳圖：1.MarkerI2.EndoglinPCR396bp;3.EndoglinPCR

3EndoglinWesternblot結果圖：1.MarkerI，2.liver:肝細胞作為對照，3.tumor:腫瘤組織，hCD105Endoglin蛋白，mCD105Endoglin圖4ASCID種植 圖4BSCID種植44AA5494BLLC成瘤組織為實驗對照組，顯示信號。為了進一步弄清楚NOD/SCID小鼠皮下接種非干細胞樣的A549成瘤組織FISH核型驗證方法進行分析。FISH檢測結果顯示，磁珠分選獲得的CD31+人血管內皮細胞具有非干細胞樣的肺細胞系A549的核型，非干細胞樣的肺細胞A549和CD31+血管內皮細胞均顯示非整倍體核型，EGFR、MYC和MDM2[2]（紅色信號）和其所在（綠色信號）都有不同程度的擴增，對照組（正常人外周巴細胞）顯示二倍體核型（5NOD/SCID小鼠皮下接種非干細胞樣的A549A549細胞非干細胞樣的A549非干細胞樣的A549細胞株分選CD31+巴細胞圖 FISH核型驗證結果RongWang等研究發現腫瘤組織中內皮細胞可由膠質瘤樣干細胞分化而來[3,4]。microRNA22ntRNA，在細胞的增殖、分化等方A549NOD/SCIDNOD/SCID小miR-302b[5-9]。非干細胞樣的A549細胞樣品標記為A549；從荷瘤NOD/SCIDTumourTable1.TheprimersusingforreversetranscriptionreactionandtativeRT-RTForward6miR-302amiR-302bRPMI-1640培養基(standardmedium)在體CD31RPMI-1640CD31分子的表達(Figure7a)。細胞熒光染色實驗檢胞培養基培養條件下具有形成血管管腔結構的能力。(Figure7c，Figure7d)。圖7：A549是在體外分化為血管內皮細胞檢測結果圖：U293T作為對照細胞，HMEC-1GFPA549為實驗組RongWang等研究表明膠質瘤樣干細胞能分化為內皮細胞參與膠質瘤血管A549是從肺細胞系中篩選出來的非干細胞樣的細胞克隆，這些非干細胞樣的A549能分化為內皮細胞參與肺癌血管的形成。我們的研究結果提示，一些非干腫瘤血管形成的一種新機制如能非干細胞樣的腫瘤細胞向內皮細胞轉化將本研究通過將常規培養的非干細胞樣的人肺癌細胞株9及小鼠肺癌細胞株C，分別接種于NOD/SCID小鼠右側腋下，獲得NOD/SCID小鼠成瘤動物模型.采用-R、免疫組織化學和esternblot方法檢測該成瘤組織中是否有人用FISH核型驗證方法進行分析，獲得的原始經過FISHprogress軟件處理。用流式細胞儀和熒光免疫組織化學方法檢測CD31+細胞，進一步采用Dil-ac-BertoliniG,RozL,PeregoP,etal.HighlytumorigeniclungcancerCD133+cellsdisystem-likefeaturesandaresparedbycistintreatment.ProcNatlAcadSciUSA,2009,106(38):16281–6.BarbaraA.Weir,MicheleS.Woo,GadGetz,etal.Characterizingthecancergenomeinlungadenocarcinoma.Nature,2007,450:893-898.Tumourvascularizationviaendothelialdifferentiationofglioblastomastem-likecells.Nature,2010，468:824-828Glioblastomastem-likecellsgiverisetotumourendothelium.829-S.L.Lin,D.C.Chang,S.Chang-Lin,C.H.Lin,D.T.Wu,D.T.Chen,andS.Y.Ying,Mir-302reprogramshumanskincancercellsintoapluripotentES-cell-likestate.RNA14(2008)2115-24.S.L.Lin,D.C.Chang,C.H.Lin,S.Y.Ying,D.Leu,andD.T.Wu,Regulationofsomaticcellreprogrammingthroughinduciblemir-302expression.NucleicAcidsRes39(2011)1054-65. I.Lip,Y.Elkabetz,M.Hafner,R.Sheridan,A.Mihailovic,T.Tuschl,C.Sander,L.Studer,andD.Be,Genome-wideidentificationofmicroRNAtargetsinhumanEScellsrevealsaroleformiR-302inmodulatingBMPresponse.GenesDev25(2011)2173-86.D.Subramanyam,S.Lamouille,R.L.Judson,J.Y.Liu,N.Bucay,R.Derynck,R.Blelloch,MultipletargetsofmiR-302andmiR-372promotereprogrammingofhumanfibroblaststoinducedpluripotentstemcells.NatBiotechnol29(2011)443-M.Tanemura,K.Mimori,F.Tanaka,T.Saito,J.Nishimura,I.Takemasa,T.Mizushima,M.Ikeda,H.Yamamoto,M.Sekimoto,Y.Doki,andM.Mori,ReprogrammingofmouseandhumancellstopluripotencyusingmaturemicroRNAs.CellStemCell8(2011)633-8.常規培養人非干細胞樣的肺細胞A549及小鼠肺癌細胞株LLC，接種于含10％胎牛的DMEM培養基，37℃，5％CO2培養箱中培養。取指數生長期的A549的量接種于NOD/SCID小鼠右側腋下（實驗組。相同方法將LLC細胞接種于（Invivoexperiments.StudiesinvolvinganimalswereapprovedbythemitteeoftheCatholicUniversitySchoolofMedicineinRome.athymicandSCIDmice(female,4–5weeksofage;CharlesRiver)wereused.Forsubcutaneousxenografts,cellswereresuspended1×106in0.1mlofcoldPBS,mixedwithanequalvolumeofcoldMatrigel(BDBioscience),andinjectedintotheflanksofnudemice.Forintracranialxenografts,2×105cellsin5μlofPBSwereinjectedstereotacticallyontothestriatum.Micewerekilledby16–20weeksaftergraftingtocollecttumourxenografts.Onganciclovirtreatment,nomajortoxicitywasobservedinvitalorgans.）2GFP蛋白的非干細胞樣的肺A549按照說明書利用脂轉染技術將質粒pEGFP-N1轉入人非干細胞樣的肺A54948hG418GFP蛋白的非干細胞樣的肺細胞A549。取保存于液氮中的人A549細胞NOD/SCID小鼠皮射的成瘤組織約100mgTTGGA-3’Endoglin5’-CTGGGTTGTATGGGAGAAGAGG-3’,672min,721min6次；941min，642min,721min6次；態大腸桿菌DH5a，篩選單克隆菌落擴增培養，用TAKARAMiniBESTsmidPurificationKitVer.2.0提取質粒，陽性質粒進行DNA序列測定（英駿生物EndoglinEndogin4、WesternBlotCD105使用Trizol試劑按操作說明對瘤組織標本中總蛋白質進行提取，SDS-膜泡封閉液中室溫下孵育1小時，用TBS/T3次，每次5分鐘。把膜泡在mg/ml，5TBS/TLLC成瘤組織為對照組。6、腫瘤血管內皮細胞分離純化：Glioblastomaneurosphereisolationandcharacterization.Isolationandcultureofhumanglioblastomamicrovascularendothelialcells.處死種植與腋下腫瘤的NOD/SCID小鼠，把NOD/SCID小鼠浸泡在中2分ReageneVortex2min20μlCD31MicroBeads45min1ml5min1ml1640下離心5min。吸走上清液，用1ml不完全1640培養基混勻。在1ml1640EP3ml164033ml16403ml1640CD31+CD31-12006minPBSCD31+7、FISH核型驗證FISHoncellnucleiextractedfromtumour乙醇20℃，依次放置兩分鐘10μLFISH探針，玻片，洗片（快速將玻片轉移到46℃預熱的2XSSC的Coplin缸中，放置至少10分鐘，不要抖動。再將玻片轉移到裝有2XSSC/0.1%NP40的Coplin缸中，放置5片，獲得的原始經過FISHprogress軟件處理。8、腫瘤干細胞相關miRNA表達的檢測Geneexpressionysisandtativereal-timePCRforsortedcellpopulations.進行消化去除組DNA。分別使用分光光度法和瓊脂糖凝膠電泳的方法對RNA樣品進行定量。2μl,0.1MDTT2μl,dNTP(Takara)1μl,M-MLV（Invitrogen）(5U/μl)0.5μl,RNaseInhibitor(Promega)0.5U/μl)0.25μl,U6(50nM終濃度2μl,miRNA反轉錄引物(50nM終濃度)2μl,TotalRNA（400ng）xμl,H2O10.75-xμl,程序：1630min,371hour7515min,4℃。20微升體系的相對定量PCR反應：2×TransStartEcoGreenqPCRSuperMix(TransGen)10μl,50×PassiveReferenceDye0.2μl,ForwardPrimer(10μM)0.4μl,ReversePrimer(10μM)0.4μl,cDNAofmiRNA(1:5dilution)1μl，H2O9μl。程序：953min，955sec，601min，1s（40個循環），60~95℃熔解曲線，End。內參為U6，計算使用2?ΔΔCT的方法。miRNAPCRRefChen,C.etal.Real-timeficationofmicroRNAsbystem-loopRT-PCR.NucleicAcidsRes33,e179(2005).Chen,X.etal.CharacterizationofmicroRNAsinserumanovelclassofbiomarkersfordiagnosisofcancerandotherdiseases.CellRes18,