RNAi及其在抗HIV中的初步應用第1頁/共93頁第2頁/共93頁RNAi的發現轉錄后基因沉默(posttranscriptional

gene

silencing，PTGS)在對牽?；ㄟM行研究時發現，將色素合成基因置于一個強啟動子后，導入牽?；ㄖ?，試圖加深花朵的紫顏色，結果是不僅轉入的基因未表達，而且自身色素合成也減弱了.

當時將這種現象稱為轉錄后基因沉默(posttranscriptional

gene

silencing，PTGS)或“共抑制”(co-suppression).

第3頁/共93頁起初，認為PTGS這是少數幾種植物中的特殊現象。轉基因導致的基因沉默PTGS廣泛存在于植物、真菌、動物中.

轉基因沉默并非偶然現象，而是普遍存在的一種基因調控機制.第4頁/共93頁

郭蘇（美國康乃爾大學Cornell復旦留美學生）1995年，用反義RNA阻遏華麗新小桿線蟲(caenorhabditis

elegans)

par-1基因的表達以探討該基因的功能。結果反義RNA確能阻斷par-1基因的表達。但奇怪的是，注入正義鏈RNA作為對照，同樣也阻斷了該基因的表達

第5頁/共93頁

Guo

S,

Kemphues

KJ.

par-1,

a

gene

required

for

establishing

polarity

in

C.

Elegans

embryos,

encodes

a

putative

Ser/Thr

kinase

that

is

asymmetrically

distributed.

Cell

1995;81:611-620

第6頁/共93頁AndyFire〔美國卡內磯研究所Carnegie）1998年首次將正義鏈和負義鏈的雙鏈RNA(dsRNA)注入線蟲，結果表現出比單獨注射正義鏈或負義鏈都強得多的基因沉默.

實際上每個細胞只需少數幾個dsRNA分子就能完全阻斷同源基因的表達.

注入雙鏈RNA不僅可以高效阻斷整個線蟲的同源基因表達，還會導致其下一代同源基因的沉默，Fire將這種現象稱為RNAi.

第7頁/共93頁Fire

A,

Xu

S,

Montgomery

MK,

Kostas

SA,

Driver

SE,

Mello

CC.

Potent

and

specific

genetic

interference

by

double-stranded

RNA

in

Caenorhabditis

elegans.

Nature

1998;391:806-811

第8頁/共93頁RNAi代表了一種的PTGS通路RNAi

現象已經在很多生物體中被發現比如植物、真菌、果蠅及包括小鼠在內的脊椎動物.

目前，認為是生物界廣泛存在的轉錄后調控的形式。

針對基因功能研究中的敲除技術，科學家將RNAi稱為對靶基因的“knockdown”，這是一個在后基因組研究中可與“knockout”相媲美的技術.

2001年，RNAi技術被成功地引入到哺乳動物細胞基因功能的研究中，

第9頁/共93頁RNAiandSiRNARNAi

：(RNA

interference)RNA干擾SiRNA：(smallinterferingRNAs）小分子干擾RNA片段將與mRNA對應的正義RNA和反義RNA組成的雙鏈RNA(dsRNA)導入細胞，可以使mRNA發生特異性的降解，導致其相應的基因沉默。這種轉錄后基因沉默（PTGS)被稱為RNA干擾（RNAi）第10頁/共93頁RNAi的作用機制

RNA干擾包括起始階段和效應階段(inititationandeffectorsteps)。在起始階段:加入的小分子RNA被切割為21-23核苷酸長的小分子干擾RNA片段SiRNAs。一個稱為Dicer的酶，是RNaseIII家族中特異識別雙鏈RNA的一員，它能以一種ATP依賴的方式逐步切割由外源導入或者由轉基因，病毒感染等各種方式引入的雙鏈RNA，切割將RNA降解為19-21bp的雙鏈RNAs(siRNAs)，每個片段的3’端都有2個堿基突出。第11頁/共93頁在RNAi效應階段:siRNA雙鏈結合一個核酶復合物從而形成所謂RNA誘導沉默復合物（RNA-inducedsilencingcomplex,RISC）。激活RISC需要一個ATP依賴的將小分子RNA解雙鏈的過程。激活的RISC通過堿基配對定位到同源mRNA轉錄本上，并在距離siRNA3’端12個堿基的位置切割mRNA。盡管切割的確切機制尚不明了，但每個RISC都包含一個siRNA和一個不同于Dicer的RNA酶。第12頁/共93頁processingthedsRNAinto21-23ntfragments3427212016short-interferingRNAstepone:第13頁/共93頁

DicercontainstwoRNAseIIIdomainssiRNAslongdsRNA第14頁/共93頁siRNAshaveadefinedstructure19ntduplex2nt3’overhangs第15頁/共93頁theantisensestrandofthesiRNAguidescleavagesteptwo:第16頁/共93頁RNAimechanismRNaseIIIlikeenzyme第17頁/共93頁RNAi高效性siRNA可作為一種特殊引物，在RNA依賴的RNA聚合酶RdRP的作用下，以靶mRNA為模板合成dsRNA，后者可被降解形成新的siRNA，又進入上述循環,新生成的dsRNA反復合成和降解，不斷產生新的siRNA,從而使靶mRNA,漸進性減少，呈現基因沉默現象.(flash)第18頁/共93頁第19頁/共93頁PTGS有著古老的根源從遺傳和生化的角度分別進行的研究同樣指出轉錄后基因沉默（PTGS）可能在生命進化的早期就存在。有人提出轉錄后基因沉默可能是進化過程中一種抵御轉座子或RNA病毒的防御機制，可能在植物和動物分化之前就已經出現（一國兩制現象）miRNA;長dsRNA第20頁/共93頁stRNA(smalltemporalRNAs,)

小短暫RNA一組小分子RNA，就是smalltemporalRNAs(stRNAs)，可以通過對特定目標轉錄本的翻譯抑制來調控線蟲的發育時鐘1993年,Lee等在秀麗線蟲上發現了第一個能時序調控胚胎后期發育的基因lin-42000年,Reinhart等再次在C.elegans中發現了第二個異時性開關基因let-7研究結果表明：線蟲lin-4和let-7stRNAs是由那些大約70個堿基的轉錄產物折疊成莖環節構后形成的。折疊的RNA分子被Dicer酶（在線蟲中稱為DCR-1）切割成為22個堿基的stRNAs，第21頁/共93頁第22頁/共93頁InhibitionoftranslationImperfectmatchBlocktranslationNear-perfectmatchDegrademRNA第23頁/共93頁miRNA(microRNAs)小分子RNAstRNA是研究miRNA的起始點隨后，在果蠅、線蟲和Hela細胞中有大約100個新的大約22個堿基的小分子RNA——microRNAs(miRNAs)被鑒定出來目前，現已發現miRNA廣泛存在于許多真核模式生物和細胞中,屬于非蛋白編碼RNAmiRNA和siRNA都是體內的小RNA基因,它們有許多相似之處并在生命活動中發揮了重要的調控作用第24頁/共93頁miRNA的特點miRNA一般來源于染色體非編碼蛋白區,本身不具有開放閱讀框(ORF)成熟的miRNA長度通常是21~25nt,其5’端有一磷酸基團,3’端為羥基,但在3’端可以有1~2個堿基的長度變化.miRNA能夠通過堿基互補配對結合于基因序列的側翼區域多數miRNA在進化上高度保守,各種miRNA都能在其他種系中找到同源體.（最為顯著的例子就是在昆蟲和哺乳動物hnRNP基因的內含子中都發現mir-7的存在）第25頁/共93頁miRNA的特點miRNA表達具有細胞特異性和組織特異性.大多數miRNA的表達具有時序性第26頁/共93頁miRNA的功能miRNA的主要功能很可能是進行轉錄后調控目前已經知道miRNA的功能多與發育的時序調控有關,但也參與了空間發育,應激性,細胞周期和基因重組等過程(McManusetal.,2002).某些miRNA與RISC(RNA-inducedsilencingcomplex)相關,能導致靶mRNA的裂解,產生基因沉默第27頁/共93頁miRNA的功能另外,miRNA還很可能與人類的某些疾病也有關聯.在慢性淋巴細胞白血病病人中發現miR15和miR16這兩個基因的表達有缺失或下調現象.這說明了miRNA很可能與人類腫瘤有關(Calinetal.,2002).最近研究還發現,miRNA還參與果蠅中的脂肪代謝(Xuetal.,2003)、在植物中控制葉和花的發育、以及在哺乳動物中造血細胞的分化(Chenetal.,2004)(細胞因子，網絡調節問題）第28頁/共93頁miRNA的作用機制miRNA與siRNA的作用機制類似動物miRNA作用機制翻譯抑制先由長的內源性轉錄本生成60-70nt的miRNA前體(pre-miRNA),pre-miRNA是長約70nt的非編碼的RNA,它由內源性基因的DNA反向重復序列轉錄而來并且具有莖-環結構（miRNA是pre-miRNA莖中的一個臂,可定位于5’端的臂或3’端的臂）Dicer的作用形成單鏈的miRNA被PPD蛋白家族成員識別結合,形成一個RNA-蛋白復合體,即miRNP(類似于RISC)第29頁/共93頁以反義RNA的形式與靶基因3’端非翻譯區(UTR)的特殊位點結合抑制其翻譯從而調控基因的表達**動物miRNA一般通過對靶基因的不完全配對從而抑制靶基因的翻譯,但是并不引起靶基因的降解植物miRNA的作用機制—切割降解第30頁/共93頁第31頁/共93頁miRNA和siRNA的區別與聯系項目miRNAsiRNA來源內源轉錄本轉基因或病毒RNA前體發夾結構的pre-miRNA雙鏈結構的dsRNA作用酶Dicer或DicerlikeproteinsrDicer作用方式不完全互補或完全互補完全互補第32頁/共93頁miRNA和siRNA的區別與聯系作用特異性相對較低高作用部位蛋白質合成水平轉錄后水平長度~22nt~22nt功能發育過程中,調節內源基因的表達抑制轉錄子活性和病毒感染.另還與表型遺傳有關第33頁/共93頁第34頁/共93頁由長dsRNA引起的非特異基因沉默在各種生物中（植物、原生動物、昆蟲、線蟲）中陸續發現了自然存在的RNAi現象哺乳動物細胞中存在RNAi的證據則費了一番功夫才找到將較長的雙鏈RNA(超過30個堿基對)轉染哺乳動物細胞會引起非特異的基因表達抑制這和在其他生物中的特異抑制不同，這種抑制可能基于一種抗病毒應答反應，是通過以下兩種途徑之一進行的第35頁/共93頁長的dsRNA激活蛋白激酶PKR，激活的PKR通過一系列的磷酸化使翻譯起始因子eIF2a失活，導致翻譯抑制長dsRNAs激活RNaseL，導致非特異的RNA降解第36頁/共93頁在設計RNAi實驗時，可以先在以下網站進行目標序列的篩選/business/products/order2.htm/techlib/misc/siRNA_finder.html/Stu/shilin/rnai.html/rnadesign/default.aspx?SID=45358710第37頁/共93頁RNAi目標序列的選取原則(1)從轉錄本（mRNA）的AUG起始密碼開始，尋找“AA”二連序列，并記下其3'端的19個堿基序列，作為潛在的siRNA靶位點。有研究結果顯示GC含量在45%—55%左右的siRNA要比那些GC含量偏高的更為有效。

Tuschl等建議在設計siRNA時不要針對5'和3'端的非編碼區（untranslatedregions，UTRs)，原因是這些地方有豐富的調控蛋白結合區域，而這些UTR結合蛋白或者翻譯起始復合物可能會影響siRNP核酸內切酶復合物結合mRNA從而影響siRNA的效果。

第38頁/共93頁RNAi目標序列的選取原則(2)將潛在的序列和相應的基因組數據庫（人，或者小鼠，大鼠等等）進行比較，排除那些和其他編碼序列/EST同源的序列。例如使用BLAST（/BLAST/）(3)選出合適的目標序列進行合成。通常一個基因需要設計多個靶序列的siRNA，以找到最有效的siRNA序列。第39頁/共93頁第40頁/共93頁第41頁/共93頁陰性對照

一個完整的siRNA實驗應該有陰性對照，作為陰性對照的siRNA應該和選中的siRNA序列有相同的組成，但是和mRNA沒有明顯的同源性。通常的做法是將選中的siRNA序列打亂，同樣要檢查結果以保證它和目的靶細胞中其他基因沒有同源性。第42頁/共93頁目前已證實的siRNA可以在下面的網頁找到/catalog/category.aspx?key=49/techlib/tb/tb_502.html/mmcmanus/www/siRNADB.html/Order_Entry/jsp/BrowseCatalog.jsp?Category=Published第43頁/共93頁siRNA的制備通過化學合成體外轉錄長片斷dsRNAs經RNaseIII類降解(e.g.Dicer,E.coli,RNaseIII)體外制備siRNA通過siRNA表達載體或者病毒載體，PCR制備的siRNA表達框在細胞中表達產生siRNA。第44頁/共93頁1.化學合成許多國外公司都可以根據用戶要求提供高質量的化學合成siRNA。主要的缺點包括價格高，定制周期長，特別是有特殊需求的。由于價格比其他方法高，為一個基因合成3—4對siRNAs的成本就更高了，比較常見的做法是用其他方法篩選出最有效的序列再進行化學合成。最適用于：已經找到最有效的siRNA的情況下，需要大量siRNA進行研究不適用于：篩選siRNA等長時間的研究，主要原因是價格因素第45頁/共93頁2.體外轉錄

以DNAOligo為模版，通過體外轉錄合成siRNAs，成本相對化學合成法而言比較低，而且能夠比化學合成法更快的得到siRNAs。不足之處是實驗的規模受到限制，雖然一次體外轉錄合成能提供足夠做數百次轉染的siRNAs，但是反應規模和量始終有一定的限制。而且和化學合成相比，還是需要占用研究人員相當的時間。優點：體外轉錄得到的siRNAs毒性小，穩定性好，效率高，只需要化學合成的siRNA量的1/10就可以達到化學合成siRNA所能達到的效果，從而使轉染效率更高。

第46頁/共93頁最適用于：篩選siRNAs，特別是需要制備多種siRNAs，化學合成的價格成為障礙時。不適用于：實驗需要大量的，一個特定的siRNA。長期研究。第47頁/共93頁3.用RNaseIII消化長片斷雙鏈RNA制備siRNA選擇通常是200—1000堿基的靶mRNA模版，用體外轉錄的方法制備長片斷雙鏈dsRNA，然后用RNaseIII(orDicer)在體外消化，得到一種siRNAs“混合雞尾酒”。在除掉沒有被消化的dsRNA后，這個siRNA混合物就可以直接轉染細胞，方法和單一的siRNA轉染一樣。由于siRNA混合物中有許多不同的siRNAs，通常能夠保證目的基因被有效地抑制。第48頁/共93頁主要優點：可以跳過檢測和篩選有效siRNA序列的步驟，為研究人員節省時間和金錢（注意：通常用RNAseIII通常比用Dicer要便宜）。缺點：有可能引發非特異的基因沉默，特別是同源或者是密切相關的基因?，F在多數的研究顯示這種情況通常不會造成影響。第49頁/共93頁最適用于：快速而經濟地研究某個基因功能缺失的表型

不適用于：長時間的研究項目，或者是需要一個特定的siRNA進行研究，特別是基因治療第50頁/共93頁體內表達采用siRNA表達載體和基于PCR的表達框架則屬于：從轉染到細胞的DNA模版中在體內轉錄得到siRNAs。這兩種方法的優點在于不需要直接操作RNA。第51頁/共93頁4.siRNA表達載體多數的siRNA表達載體依賴三種RNA聚合酶III啟動子(polIII)中的一種，操縱一段小的發夾RNA(shorthairpinRNA,shRNA)在哺乳動物細胞中的表達。這三類啟動子包括大家熟悉的人源和鼠源的U6啟動子和人H1啟動子。之所以采用RNApolIII啟動子是由于它可以在哺乳動物細胞中表達更多的小分子RNA，而且它是通過添加一串（3到6個）U來終止轉錄的。第52頁/共93頁要使用這類載體，需要訂購2段編碼短發夾RNA序列的DNA單鏈，退火，克隆到相應載體的polIII啟動子下游。由于涉及到克隆，這個過程需要幾周甚至數月的時間，同時也需要經過測序以保證克隆的序列是正確的第53頁/共93頁siRNA表達載體的優點在于可以進行較長期研究——帶有抗生素標記的載體可以在細胞中持續抑制靶基因的表達，持續數星期甚至更久。

病毒載體也可用于siRNA表達，其優勢在于可以直接高效率感染細胞進行基因沉默的研究，避免由于質粒轉染效率低而帶來的種種不便,而且轉染效果更加穩定。第54頁/共93頁最適用于：已知一個有效的siRNA序列，需要維持較長時間的基因沉默。不適用于：篩選siRNA序列（其實主要是指需要多個克隆和測序等較為費時、繁瑣的工作）。第55頁/共93頁第56頁/共93頁5.SiRNA表達框架SiRNA表達框架(siRNAexpressioncassettes，SECs)是一種由PCR得到的siRNA表達模版，包括一個RNApolIII啟動子，一段發夾結構siRNA，一個RNApolIII終止位點，能夠直接導入細胞進行表達而無需事前克隆到載體中。和siRNA表達載體不同的是，SECs不需要載體克隆、測序等頗為費時的步驟，可以直接由PCR得到，不用一天的時間。第57頁/共93頁SECs成為篩選siRNA的最有效工具，甚至可以用來篩選在特定的研究體系中啟動子和siRNA的最適搭配。如果在PCR兩端添加酶切位點，那么通過SECs篩選出的最有效的siRNA后，可以直接克隆到載體中構建siRNA表達載體。構建好的載體可以用于穩定表達siRNA和長效抑制的研究。第58頁/共93頁主要缺點：①PCR產物很難轉染到細胞中（晶賽公司的Protocol可以解決這一問題）②不能進行序列測定，PCR和DNA合成時可能差生的誤讀不能被發現導致結果不理想。第59頁/共93頁最適用于：篩選siRNA序列，在克隆到載體前篩選最佳啟動子

不適用于：長期抑制研究。（如果克隆到載體后就可以了）第60頁/共93頁

比較項目化學合成體外轉錄RNaseIII降解dsRNAsiRNA

表達載體PCR

表達框材料需求

21-merRNA

oligos(一對)29-merDNAoligos(一對)轉錄模版(200-1000bp，兩側帶T7啟動子)55-60-merDNAoligos(一對)

~50-merDNAoligos(一對)全部制備/合成時間所需時間4天—2周24小時+DNAoligo合成時間1天+轉錄模版制備時間5天以上+DNAoligo合成時間~6小時+DNAoligo合成時間個人所需操作時間幾乎不需要*中等中等多中等是否需要驗證和尋找最有效siRNA需要需要不需要需要需要能否標記能能能不能不能

比較項目化學合成體外轉錄RNaseIII降解dsRNAsiRNA

表達載體PCR

表達框材料需求

21-merRNA

oligos(一對)29-merDNAoligos(一對)轉錄模版(200-1000bp，兩側帶T7啟動子)55-60-merDNAoligos(一對)

~50-merDNAoligos(一對)全部制備/合成時間所需時間4天—2周24小時+DNAoligo合成時間1天+轉錄模版制備時間5天以上+DNAoligo合成時間~6小時+DNAoligo合成時間個人所需操作時間幾乎不需要*中等中等多中等是否需要驗證和尋找最有效siRNA需要需要不需要需要需要能否標記能能能不能不能第61頁/共93頁

比較項目化學合成體外轉錄RNaseIII降解dsRNAsiRNA

表達載體PCR

表達框轉染的相對難易程度好好好差差可篩選性(例如抗生素篩選)

不可以不可以不可以可以不可以能否用于長效抑制不可以不可以不可以可以（抗生素篩選）不可以能否大規模制備可以有限有限可以有限檢測總體轉染效率不可以不可以不可以可以不可以每個基因的相對費用（不包含人力）高中等低中等中等

比較項目化學合成體外轉錄RNaseIII降解dsRNAsiRNA

表達載體PCR

表達框轉染的相對難易程度好好好差差可篩選性(例如抗生素篩選)

不可以不可以不可以可以不可以能否用于長效抑制不可以不可以不可以可以（抗生素篩選）不可以能否大規模制備可以有限有限可以有限檢測總體轉染效率不可以不可以不可以可以不可以每個基因的相對費用（不包含人力）高中等低中等中等第62頁/共93頁第63頁/共93頁第64頁/共93頁SiRNA的轉染1.磷酸鈣共沉淀將氯化鈣，RNA(或DNA)和磷酸緩沖液混合，沉淀形成包含DNA且極小的不溶的磷酸鈣顆粒。磷酸鈣-DNA復合物粘附到細胞膜并通過胞飲進入目的細胞的細胞質。沉淀物的大小和質量對于磷酸鈣轉染的成功至關重要。在實驗中使用的每種試劑都必須小心校準，保證質量，因為甚至偏離最優條件十分之一個pH都會導致磷酸鈣轉染的失敗。第65頁/共93頁SiRNA的轉染2.電穿孔法

電穿孔通過將細胞暴露在短暫的高場強電脈沖中轉導分子。將細胞懸浮液置于電場中會誘導沿細胞膜的電壓差異，據認為這種電壓差異會導致細胞膜暫時穿孔。電脈沖和場強的優化對于成功的轉染非常重要，因為過高的場強和過長的電脈沖時間會不可逆地傷害細胞膜而裂解細胞。一般，成功的電穿孔過程都伴隨高水平（50%或更高）的毒性。第66頁/共93頁SiRNA的轉染3.DEAE-葡聚糖和polybrene

帶正電的DEAE-葡聚糖或polybrene多聚體復合物和帶負電的DNA分子使得DNA可以結合在細胞表面。通過使用DMSO或甘油獲得的滲透休克將DNA復合體導入。兩種試劑都已成功用于轉染。DEAE-葡聚糖僅限于瞬時轉染。第67頁/共93頁SiRNA的轉染4.機械法

轉染技術也包括使用機械的方法，比如顯微注射和基因槍（biolisticparticle）。顯微注射使用一根細針頭將DNA，RNA或蛋白直接轉入細胞質或細胞核?；驑屖褂酶邏簃icroprojectile將大分子導入細胞。第68頁/共93頁SiRNA的轉染5.陽離子脂質體試劑

在優化條件下將陽離子脂質體試劑加入水中時，其可以形成微小的（平均大小約100-400nm）單層脂質體。這些脂質體帶正電，可以靠靜電作用結合到DNA的磷酸骨架上以及帶負電的細胞膜表面。因此使用陽離子脂質體轉染的原理與以前利用中性脂質體轉染的原理不同。第69頁/共93頁使用陽離子脂質體試劑，DNA并沒有預先包埋在脂質體中，而是帶負電的DNA自動結合到帶正電的脂質體上，形成DNA-陽離子脂質體復合物。據稱，一個約5kb的質粒會結合2-4個脂質體。被俘獲的DNA就會被導入培養的細胞。第70頁/共93頁轉染實驗中，需要注意問題1.純化siRNA

在轉染前要確認siRNA的大小和純度。為得到高純度的siRNA，推薦用玻璃纖維結合，洗脫或通過15-20%丙烯酰胺膠除去反應中多余的核苷酸，小的寡核苷酸，蛋白和鹽離子。注意：化學合成的RNA通常需要跑膠電泳純化（即PAGE膠純化）。第71頁/共93頁轉染實驗中，需要注意問題2.避免RNA酶污染

微量的RNA酶將導致siRNA實驗失敗。由于實驗環境中RNA酶普遍存在，如皮膚，頭發，所有徒手接觸過的物品或暴露在空氣中的物品等，此保證實驗每個步驟不受RNA酶污染非常重要。第72頁/共93頁轉染實驗中，需要注意問題3.健康的細胞培養物和嚴格的操作確保轉染的重復性

通常，健康的細胞轉染效率較高。此外，較低的傳代數能確保每次實驗所用細胞的穩定性。為了優化實驗，推薦用50代以下的轉染細胞，否則細胞轉染效率會隨時間明顯下降。第73頁/共93頁轉染實驗中，需要注意問題4.避免使用抗生素

Ambion公司推薦從細胞種植到轉染后72小時期間避免使用抗生素?？股貢诖┩傅募毎蟹e累毒素。有些細胞和轉染試劑在siRNA轉染時需要無血清的條件。這種情況下，可同時用正常培養基和無血清培養基做對比實驗，以得到最佳轉染效果。第74頁/共93頁轉染實驗中，需要注意問題5.選擇合適的轉染試劑針對siRNA制備方法以及靶細胞類型的不同，選擇好的轉染試劑和優化的操作對siRNA實驗的成功至關重要。第75頁/共93頁轉染實驗中，需要注意問題

6.通過合適的陽性對照優化轉染和檢測條件

對大多數細胞，看家基因是較好的陽性對照。將不同濃度的陽性對照的siRNA轉入靶細胞（同樣適合實驗靶siRNA），轉染48小時后統計對照蛋白或mRNA相對于未轉染細胞的降低水平。過多的siRNA將導致細胞毒性以至死亡。第76頁/共93頁轉染實驗中，需要注意問題7.通過標記siRNA來優化實驗

熒光標記的siRNA能用來分析siRNA穩定性和轉染效率。標記的siRNA還可用作siRNA胞內定位及雙標記實驗（配合標記抗體）來追蹤轉染過程中導入了siRNA的細胞，將轉染與靶蛋白表達的下調結合起來。第77頁/共93頁RNAi的應用前景1.研究基因功能的新工具RNAi能夠在哺乳動物中滅活或降低特異性基因的表達，制作多種表型，而且抑制基因表達的時間可以隨意控制在發育的任何階段，產生類似基因敲除的效應。與傳統的基因敲除技術相比，RNAi有投入少，周期短，操作簡單等優勢近來RNAi成功用于構建轉基因動物模型的報道日益增多，標志著RNAi將成為研究基因功能不可或缺的工具。第78頁/共93頁RNAi的應用前景2.研究信號傳導通路的新途徑聯合利用傳統的缺失突變技術和RNAi技術可以很容易地確定復雜的信號傳導途徑中不同基因的上下游關系。Clemensy等應用RNAi研究了果蠅細胞系中胰島素信息傳導途徑,取得了與已知胰島素信息傳導通路完全一致的結果,在此基礎上分析了DSH3PX1與DACK之間的關系。證實了DACK是位于DSH3PX1磷酸化的上游激酶.RNAi技術將可能成為研究細胞信號傳導通路的新途徑。第79頁/共93頁RNAi的應用前景3.開展基因治療的新策略RNAi具有抵抗病毒入侵，抑制轉座子活動，防止某些基因序列過量增殖等作用。因此可以利用RNAi現象產生抗病毒的植物和動物，并可利用不同病毒轉錄序列中高度同源區段相應的dsRNA抵抗多種病毒。第80頁/