高分辨率溶解曲線HRM第一頁，共二十四頁，2022年，8月28日高分辨率熔解曲線(highresolutionmelting)是在實時熒光PCR基礎上發展起來的一種新的實時定量新技術。常規Real-timePCR利用SYBRGreen染料標記DNA雙鏈，但是SYBRGreen是一種大分子即不飽和染料，不能保證PCR產物全部的小溝都嵌合上SYBRGreen，并且嵌合到產物中的染料如果在擴增過程中不能及時脫落，還會抑制PCR反應。HRM采用新型的飽和染料如LCGreen，SYTO9等。不僅沒有不飽和染料的缺點，而且更易于檢測單堿基突變、小片段插入或缺失。第二頁，共二十四頁，2022年，8月28日第三頁，共二十四頁，2022年，8月28日方法在PCR反應前將LCGreen飽和熒光染料與PCR反應體系混合，然后將PCR產物直接放入LightScanner、HR-1或Rotor-Gene6000儀器中，在一定的溫度范圍內將PCR擴增產物進行變性，就是對PCR的擴增子進行加熱，溫度從50°C逐漸上升到95°C。在此過程中，擴增子逐漸解鏈。在HRM分析的初期，熒光強度很高，隨著溫度升高，雙鏈DNA逐漸減少，熒光強度也就下降了。HRM儀器通過照相機，記錄下熒光變化的整個過程。通過對數據的作圖，就生成了熔解曲線。第四頁，共二十四頁，2022年，8月28日第五頁，共二十四頁，2022年，8月28日第六頁，共二十四頁，2022年，8月28日原理HRM是通過實時監測升溫過程中雙鏈DNA熒光染料與PCR產物的結合情況。SNP位點堿基不同會使雙鏈DNA的TM值發生變化從而雙鏈DNA在升溫過程中先后解開，形成不同的融解曲線形狀，熒光染料從局部解鏈的DNA分子上釋放，從熒光強度與時間曲線上就可以判斷是否存在SNP，而且不同SNP位點、雜合子與純合子等都會影響熔解曲線的峰形，因此HRM分析能夠有效區分不同SNP位點與不同基因型。第七頁，共二十四頁，2022年，8月28日第八頁，共二十四頁，2022年，8月28日條件要求1、高分辨率：擴增子的熔解曲線完全取決于DNA堿基序列。序列中如有一個堿基發生了突變，都會改變DNA鏈的解鏈溫度。但是這個差異極小，只有零點幾攝氏度，如果儀器的分辨率不高，是根本無法檢測的。那么什么樣的分辨率才是高分辨率呢？根據儀器現有的功能測試，在熔解操作時每攝氏度至少要獲得10個數據點，這是對儀器的最低要求。此外，溫度均一性也同樣重要。如果兩孔之間溫度相差0.1°C，就很可能導致最終的熔解溫度相差0.1°C，這樣就無法保證HRM分析結果的準確性。2、飽和染料：為什么要飽和染料呢？因為飽和染料飽和了DNA雙螺旋結構中的小溝，在DNA解鏈過程中就不會發生重排，熒光信號能準確的反映DNA的解鏈。這樣熔解曲線才有了更高的分辨率。第九頁，共二十四頁，2022年，8月28日HRM在分子診斷中的應用基因分型突變掃描甲基化分析序列配對第十頁，共二十四頁，2022年，8月28日基因分型

傳統的基因分型方法或者耗時費力，或者需要購買價格不菲的探針。HRM分析無需制備探針；有了飽和染料，PCR產物全程被標記，因此所有的熔解區域都能檢測到。對于同一擴增子內的不同雜合體，通過曲線形狀的差異也能區分開。HRM已經在人類(雙倍體)和微生物(單倍體)的基因分型中得到應用．人類疾病基因包括球蛋白、囊腫性纖維化、V因子、凝血素、血色沉著病蛋白、血小板抗原、乳糖分解酵素和MGMT啟動子區域的甲基化．微生物基岡有：hsp65、16srRNA基因、gyrA等．

第十一頁，共二十四頁，2022年，8月28日SNP相關研究方法比較：目前突變/SNP的研究手段大致有三大類，一類是以熒光共振能量傳遞為基礎的檢測方法，比如Taqman探針法。顯著特點是速度快，通量大。缺點是只能檢測已知SNP，昂貴。第十二頁，共二十四頁，2022年，8月28日第二類是酶切。步驟繁瑣，費時，檢測已知SNP。結果不穩定。第三類方法中包括測序、Pyrosequencing等技術。此外還有芯片等技術可用于SNP分析；Pyrosequencing技術它既可進行DNA序列分析，又可進行基于序列分析的SNP檢測及表觀遺傳學甲基化的分析以及大規模的等位基因頻率測定。第十三頁，共二十四頁，2022年，8月28日HRM主要特點高分辨率溶解曲線（高分辨溶解曲線突變檢測）是理想的SNP檢測手段：

快速、高通量—LightScanner5分鐘完成96/384孔板的PCR產物檢測，20000個SNP/天

準確、靈敏度高、特異性好—LightScanner100%準確性、特異性（<400bp）；準確性96.4%和特異性99.1%（400~1kb）

重復性好—LightScanner重復性100%

費用低—LightScanner檢測SNP每個樣品的成本為1RMB

操作簡便—LightScanner只需將PCR產物（96/384孔板）放入儀器內便可，軟件自動基因分型第十四頁，共二十四頁，2022年，8月28日第十五頁，共二十四頁，2022年，8月28日第十六頁，共二十四頁，2022年，8月28日突變掃描

目前應用HRM進行突變掃描的基因有：C-kit、乙酰輔酶A脫酶的中鏈、原肉毒堿缺乏癥、RET、表皮生長因子受體EGFR、K—ras、苯丙氨酸羥化酶、p53、HER2、囊腫性纖維化基因的幾個外顯子等等．第十七頁，共二十四頁，2022年，8月28日第十八頁，共二十四頁，2022年，8月28日第十九頁，共二十四頁，2022年，8月28日甲基化分析

HRM分析還為DNA甲基化狀態的檢測另辟蹊徑。DNA樣品通過亞硫酸氫鹽的處理，將未甲基化的胞嘧啶轉化成尿嘧啶。這樣，原先未甲基化模板所產生的PCR產物比甲基化模板的Tm要低。第二十頁，共二十四頁，2022年，8月28日NucleicAcidsResearch,2009,Vol.37,No.12第二十一頁，共二十四頁，2022年，8月28日序列配對

有些研究并不需要完全的基因型。而只需知道DNA序列是否匹配，例如：組織移植、基因型．表型的相關性和辯證性．在活器官移植中。需要對HLA進行基因分型．這個主要牽涉到HLA-A，B，C和DR等幾個位點．當兩個個體的熔解曲線完全相同時就說明HLA基因型完全匹配．第二十二頁，共二十四頁，2022年，8月28日HRM新技術的介紹1、未標記探針HRM在HMR的基礎上發明一種不帶熒光標記的探針，由原來的單一擴增產物的熔解曲線模式轉變為由擴增產物與探針兩部分組成的模式。2、彈回探針彈回探針(snapbackprimer)是在引物末端加一個與靶片段的突變區域互補的尾巴序列，反應體系是不對稱PCR(asymmetricPCR)，帶有彈回探針的引物為過剩引物(excessprimer，EP)，另一條引物為限制引物(1imitingprimer，LP)。