華南農業大學LDH同工酶圓盤聚丙烯酰胺凝膠電泳第1頁/共22頁二、實驗原理1.聚丙烯酰胺凝膠原理及影響因素（同實驗三）2．聚丙烯酰胺凝膠電泳原理（同實驗三）第2頁/共22頁3.乳酸脫氫酶(LDH)同工酶圓盤電泳同工酶是指生物體中結構和性質不同而能催化相同反應的一類酶。許多酶都具有同工酶（約占已知酶的40～50%），凝膠電泳可利用同工酶結構上的差異而將之分離。第3頁/共22頁乳酸脫氫酶（lactatedehydrogenase簡稱LDH，EC.1.1.1.27）是催化丙酮酸和乳酸可逆轉化的酶。1959年Markert等用電泳的方法將牛心肌提純的LDH結晶分離出5條區帶，靠近陽極一端的稱LDHl，靠近陰極一端的稱為LDH5；其余3種，由陽極到陰極依次命名為LDH2，LDH3及LDH4。它們均具有LDH催化活性，從而首先提出了同工酶(isoenzyme)的概念。目前已知LDH同工酶是由亞基及M亞基按不同比例組成的四聚體，它們是H4（LDHl），H3M（LDH2），H2M2（LDH3），HM3（LDH4）及M4（LDH5）5種。心肌中以LDHl含量高，骨骼肌及肝中LDH5含量高。第4頁/共22頁LDH同工酶底物染色顯色反應如下：

反應式中PMS為甲硫吩嗪（phenazinemethosulfate），NBT為氯化硝基四氮唑藍（nitrobluetetrazoliumchloride）的縮寫，它們都是接受電子的染料。LDH與底物染色液在37℃溫浴中脫下的氫最后傳遞給NBT生成藍紫色的NBTH2稱為甲膝，此物不溶于水，有利于顯色后區帶的保存，但可溶于氯仿及95%乙醇（9∶1）的混合液。因此電泳后的顯色區帶可通過浸泡法浸出，于560nm比色，也可用光吸收掃描儀得出LDH同工酶間的相對百分含量。第5頁/共22頁目前，LDH及同工酶檢測已廣泛用于臨床，作為某些疾病鑒別診斷的依據，常用醋酸纖維薄膜電泳，瓊脂糖電泳及聚丙稀酰胺凝膠電泳分離LDH及共同工酶，這3種不同支持物電泳及染色原理完全相同，但靈敏度不同。第6頁/共22頁三、實驗材料、儀器和試劑(一)實驗材料（由老師準備）兔子血清和組織(肝臟組織、心臟組織、腎臟組織、肌肉組織、肺等)提取液（組織重量與組織勻漿緩沖液體積比為1∶10（g/mL）。組織樣品處理：稱取0.5克兔血清和肝臟等組織，各加入5mLPBS和少量石英沙于研缽磨成勻漿，離心10000r/10～15min，取上層清液4 ℃保存作為母液。電泳樣品：用移液槍各取1mL上述提取液，加1mL40%蔗糖溶液和20uL溴酚蘭，混勻。第7頁/共22頁

(二)儀器及器皿1全班共用：圓盤電泳槽直流穩壓電電泳儀恒溫水浴鍋微量加樣器移樣器電爐等電泳槽3個(12個管/個)，電泳儀3個，200mL燒杯10個，100mL容量瓶5個，1000mL容量瓶1個(或1000mL量筒1個)，廣泛pH試紙，塑料大燒杯（2L）2個,塑料大燒杯（L）1個，剪細濾紙條1杯。2每組配備長滴管1支，玻管及乳膠管（帶玻珠）2個，長針頭注射器1支，試管2支，洗耳球1個，10mL離心管2個，玻棒。第8頁/共22頁(三)、試劑1制備樣品有關試劑（老師配）（1）0.01mo1／LpH6.5磷酸鹽緩沖液（PBS），用于組織勻漿緩沖液及LDH的染色液Na2HPO4·12H2O0.2256g，NaH2PO4·H2O0.2137g，加水定容到200mL。（2）40%蔗糖溶液20g蔗糖用水溶解定容至50mL。（3）0.5％溴酚蘭10mL第9頁/共22頁2、制備PAGE的試劑

（在通風櫥里加濃HCl），每大組（3個小組）配以下試劑（1）凝膠貯備液A：稱Tris（三羥甲基氨基甲烷）9g于100mL燒杯中，加濃HCl1mL，TEMED（四甲基乙二胺）原液0.18mL，于量筒加水定容至25mL，用試紙檢測pH為8.9。（2）凝膠貯備液B：丙烯酰胺（Acr）15g，甲叉雙丙烯酰胺（Bis）0.4g;，加水于100mL燒杯中溶解，然后混合于容量瓶加水定容至50mL，如果有沉淀要過濾。（3）凝膠貯備液C：過硫酸銨0.14g，溶解后，于容量瓶加水定容至50mL（制膠時現配現用）。（4）電極緩沖液：Tris3g，甘氨酸16g，加蒸餾水溶解并定容至300mL，pH為8.3，使用時稀釋10倍。（每個電泳槽可裝1000mL的電極緩沖液，12支管/盤，3個圓盤/班）第10頁/共22頁3、LDH同工酶染色貯存液(電泳過程中配制)(1)、5mg/mLNAD+（氧化型輔酶I）溶液：稱400mgNAD+定容至80mL，置棕色瓶中，4°C可保存2星期。(2)、1mol/L乳酸鈉（分子量112.06）：取60%乳酸鈉4.6mL定容至50mL，置棕色瓶中，4°C度保存。(3)、0.1mol/LNaCl：取0.584gNaCl，加蒸餾水溶解并定容至100mL。(4)、1mg/mL甲硫吩嗪(PMS)：取甲硫吩嗪(PMS)25mgPMS，加蒸餾水溶解并定容至25mL。第11頁/共22頁(5)、1mg/mL氯化硝基四氮唑藍(NBT)溶液：160mgNBT，加蒸餾水溶解并定容至160mL,于棕色瓶4℃保存。每次用完請妥善保管。當黃色NBT變綠色或出現沉淀，不能再使用。（6）、0.01mol/LpH6.5PBS（磷酸鹽緩沖液，全班共用的量）：Na2HPO4·12H2O0.2256g，NaH2PO4·H2O0.2137g，加水定容到200mL第12頁/共22頁四操作步驟1．凝膠柱的制備(每人做1條膠，玻璃管體積2mL，膠量1.5mL)將凝膠貯備液A、B及水按1：2：1的比例混合于燒杯中，另量取4份的C液于另一燒杯中[注意：每6人配制如下：1個燒杯配A：B：水＝1(3mL)：2(6mL):1(3mL)另一燒杯配C液4份(12mL)第13頁/共22頁當準備好帶有玻珠乳膠管封底的玻璃管后，可把兩燒杯中的溶液混合，輕攪均勻，用長滴管沿玻管壁小心加到玻管中。膠液應灌到離管口約5～8mm處。用手指輕彈管壁，將管中膠液可能混有的氣泡趕出，然后用滴管在膠液面上小心注入一層3～5mm蒸餾水，以防膠凝結時表面形成彎月面并隔絕空氣。當見到水層與膠液交界處有一清晰界面時，表明膠已聚合。第14頁/共22頁2、預電泳將乳膠管從凝膠聚合后的玻管中小心拔出，用濾紙吸去凝膠上層的水，把凝膠管插入到圓盤電泳槽的槽洞橡皮塞中。上下槽中加入稀釋好的約250mL電極緩沖液，并使兩管口都不存氣泡。為防止LDH及其同工酶受凝膠聚合后殘留物(如AP等)的影響，引起酶的鈍化或其它人為效應，在加樣前，應進行預電泳，電泳條件：以每管2mA的電流進行電泳，約15～30min。第15頁/共22頁3．加樣和電泳（每人點1個樣，樣品：血、肝、肌肉、心、腎、肺）關閉電源后準備加樣，用2移液槍加樣品(血加50uL，其它樣品加25uL)。上槽接負極，下槽接正極，以每管2mA的電流進行電泳。當電泳指示劑溴酚藍帶遷移出凝膠柱30～60min時，可停止電泳。電泳時間約2～3.5h。第16頁/共22頁4．脫膠、染色和脫色把從電泳槽中取出的凝膠管用帶長針頭的注射器脫膠。將吸滿水的注射器針頭沿壁插入玻管壁與凝膠之間，邊注水邊推進針頭并緩慢旋轉玻管，使凝膠與管壁分離，則凝膠柱自然滑出，若不能滑出可用洗耳球吹出。第17頁/共22頁（1）每個試管按下表1的順序，在臨用前將有關試劑混和配制約12mLLDH活性染液（每6人大組共配12×6＝72mL）。NAD+

乳酸鈉NaClNBTPMSPBS總體積（mL）每人用量（mL）21.21.250.52.512六人用量（mL）127.27.23031572表1LDH活性染色液（每組用量）第18頁/共22頁（2）把配好的染色液倒入試管中，脫出的凝膠放入盛有染色液的試管中,避光置37℃水浴中保溫10～20min，待LDH同工酶呈現藍紫色區帶,回收染色液。（3）用蒸餾水洗3次除去染色液，加入水浸泡，凝膠底色脫凈，背景清晰，把凝膠柱放在灌滿水的試管中，對光觀察過乳酸脫氫酶同工酶譜，并畫電泳圖或拍照。（也可將凝膠板放在保存液中浸泡）第19頁/共22頁四.結果與分析1對同工酶譜帶進行繪圖、記錄或照相。2分析健康兔子的各組織的LDH的差別，試分析原因。第20頁/共22頁五.注意事項1組織勻漿制備時一般用0.01mol/LpH6.5磷酸鹽緩沖液，此溶液需4℃預冷。組織重量（g）與緩沖液體積（mL）