分子生物學(xué)實驗流程及相關(guān)第1頁/共33頁分子生物學(xué)實驗概述生物樣品（細胞、組織、細菌）細胞調(diào)節(jié)神經(jīng)科學(xué)分子診斷DNA分離RNA分離質(zhì)粒DNA噬菌體DNA基因組DNA總RNAmRNAcDNA重組DNAPCR遺傳鑒定DNA測序DNA標記突變基因表達第2頁/共33頁分子生物學(xué)實驗概述（續(xù)）基因表達報告基因載體基因轉(zhuǎn)化報告基因檢測真核轉(zhuǎn)錄體外轉(zhuǎn)錄翻譯蛋白蛋白分析蛋白分離第3頁/共33頁分子生物學(xué)主要實驗流程實驗起始材料的選取和準備mRNA的提取、純化目標片段的克隆和分析DNA、RNA的提取、純化和分析克隆化基因的表達及表達蛋白的純化和功能分析基因轉(zhuǎn)化實驗及轉(zhuǎn)基因結(jié)果分析第4頁/共33頁實驗起始材料的選取和準備常規(guī)材料組織器官原生質(zhì)體\細胞細菌\真菌\酵母特殊材料少量起始材料特殊病變組織亞細胞結(jié)構(gòu)第5頁/共33頁實驗起始材料的選取和準備水稻卵細胞的分離分離準備工作材料的速凍長期保存人工氣候箱、制冰機超凈工作臺、顯微操作系統(tǒng)RNase-free耗材、液氮罐超低溫冰箱RNase抑制劑第6頁/共33頁卵細胞mRNA的提取、純化Oligotex系列試劑盒細胞裂解勻漿去蛋白和細胞殘渣溫浴并結(jié)合洗脫去鹽和回收旋渦混勻器離心機恒溫水浴鍋離心機、旋渦混勻器200℃烘箱DEPC、RNase-freeDNaseI、RNase-free耗材第7頁/共33頁目標片段的克隆和分析利用SMARTcDNA文庫構(gòu)建試劑盒構(gòu)建水稻卵細胞cDNA文庫目標基因的獲得通過噬菌體載體自切割或T-Vector、平末端載體克隆獲得目標質(zhì)粒利用測序儀和通用引物對克隆的目的基因測序第8頁/共33頁通過SMART技術(shù)構(gòu)建cDNA文庫第一鏈的合成第二鏈的合成和擴增

酶切、純化和片段分離cDNA檢測插入載體并包裝文庫質(zhì)量檢測文庫擴增及保藏恒溫水浴鍋、制冰機RTase、RNase抑制劑PCR儀高保真Taq酶恒溫水浴鍋、離心機限制性內(nèi)切酶、過濾柱電泳儀器、凝膠成像系統(tǒng)瓊脂糖恒溫水浴鍋超凈工作臺、烘箱、PCR儀培養(yǎng)基超低溫冰箱DMSO第9頁/共33頁目標基因的克隆利用特異探針，通過核酸雜交的方法或利用特異的抗體，通過抗原-抗體反應(yīng)進行文庫目標基因的篩選利用GSP（基因特異引物）通過PCR擴增出目標基因通過5‘RACE和3’RACE克隆已知部分序列的目標基因第10頁/共33頁通過核酸雜交和免疫反應(yīng)篩庫將培養(yǎng)于平板的噬菌斑通過印跡轉(zhuǎn)于尼龍膜，并于核酸交聯(lián)儀中固定。在雜交箱中利用特定探針雜交。最后在恒溫搖床中洗膜（探針標記：放射性和非放射性）將噬菌體培養(yǎng)于平板，于42℃培養(yǎng)幾小時后，于37℃用IPTG誘導(dǎo)融合蛋白的表達并印記于尼龍膜上，利用抗原-抗體反應(yīng)進行雜交第11頁/共33頁利用PCR技術(shù)獲得目標基因利用GSP，以文庫為模板通過PCR擴增出目標基因，并通過電泳、凝膠成像系統(tǒng)檢測利用文庫載體序列和已知的目標基因的序列設(shè)計通用引物和GSP，通過5’RACE和3’RACE擴增出目標基因的5’和3’端序列。并通過電泳、凝膠成像系統(tǒng)檢測第12頁/共33頁DNA、RNA的提取、純化和分析包含有目標基因的質(zhì)粒的獲得水稻基因組DNA的提取、純化和分析水稻各器官TotalRNA的提取、純化和分析第13頁/共33頁包含有目標基因的質(zhì)粒的獲得對于通過篩庫技術(shù)獲得的目標基因通過噬菌體載體的自切割作用生成目標質(zhì)粒對于通過PCR技術(shù)獲得的目標基因通過回收純化后利用T載體等克隆并轉(zhuǎn)化細菌鋪板培養(yǎng)后通過藍白斑，原位裂解雜交分離出含有目標質(zhì)粒的單個菌落第14頁/共33頁對于通過PCR技術(shù)獲得的目標基因PCR或RACE電泳凝膠成像系統(tǒng)長波紫外觀察箱切膠膠回收試劑盒T載體、平末端載體轉(zhuǎn)化細菌并鋪板培養(yǎng)篩選目標菌落提取目標質(zhì)粒第15頁/共33頁對于通過PCR技術(shù)獲得的目標基因PCR或RACE瓊脂水平電泳凝膠成像系統(tǒng)、手提紫外燈長波紫外觀察箱PCR回收試劑盒膠回收試劑盒PCR儀電泳儀器恒溫水浴鍋、離心機Taq酶、薄壁管、礦物油瓊脂糖第16頁/共33頁對于通過PCR技術(shù)獲得的目標基因（續(xù)）純化產(chǎn)物PCR產(chǎn)物測序T載體、平末端載體連接細菌轉(zhuǎn)化、鋪板培養(yǎng)藍白斑篩選、菌落原位雜交質(zhì)粒提取、酶切分析、測序測序儀低溫冰箱雜交箱、恒溫搖床、低溫冰箱超凈工作臺、電轉(zhuǎn)化儀離心機、恒溫水浴鍋感受態(tài)細胞、培養(yǎng)基、抗生素X-gal、IPTG、尼龍膜和探針限制性內(nèi)切酶第17頁/共33頁質(zhì)粒提取、分析常規(guī)質(zhì)粒提取方法：通過細菌的適當(dāng)裂解釋放出質(zhì)粒，利用酚和氯仿抽提掉蛋白，再利用無水乙醇沉淀質(zhì)粒DNA質(zhì)粒提取試劑盒：裂解方法一致。裂解完成后利用過濾柱純化出質(zhì)粒DNA質(zhì)粒提取后，根據(jù)以后實驗要求利用不同的限制性內(nèi)切酶在水浴鍋中進行酶切電泳，用凝膠成像系統(tǒng)分析測序第18頁/共33頁水稻基因組DNA的提取、

純化和分析利用SDS法或Qiagen提供的基因組提取試劑盒提取水稻基因組DNA：利用SDS在高鉀離子濃度的情況下能沉淀蛋白和多糖等雜質(zhì)的原理提取基因組DNA利用酚-氯仿抽提或過濾柱純化基因組DNA水稻基因組文庫的構(gòu)建利用特異的探針，通過Southernblotting檢測目標基因的拷貝數(shù)第19頁/共33頁水稻各器官TotalRNA的提取、純化和分析分離所需的水稻各器官組織，并利用Qiagen的RNeasy系列試劑盒提取總RNA：將材料裂解后，通過過濾柱純化出總RNA在RNase-free的情況下，通過甲醛變性膠電泳檢測總RNA的質(zhì)量利用特異性的探針，通過Northernblotting檢測目標基因在各器官的表達情況第20頁/共33頁Southernblotting和NorthernblottingSouthernblotting基因組DNA完全消化探針制備瓊脂水平電泳比活性測定印跡轉(zhuǎn)膜DNA交聯(lián)限制性內(nèi)切酶、恒溫水浴鍋手提紫外燈、電泳儀器真空轉(zhuǎn)膜儀紫外交聯(lián)儀同位素檢測儀探針制備試劑盒尼龍膜第21頁/共33頁Southernblotting和Northernblotting（續(xù)）制備好的尼龍膜探針（放射性或非放射性）雜交雜交箱放射自顯影熒光同位素檢測儀磷屏成像系統(tǒng)熒光掃描成像系統(tǒng)第22頁/共33頁克隆化基因的表達及表達蛋白的純化和功能分析

克隆化基因的表達表達蛋白的純化

功能分析第23頁/共33頁克隆化基因的表達基因的克隆：利用高保真的Taq酶和合適的反應(yīng)系統(tǒng)，通過PCR獲得與目標基因完全一致的DNA片段（通過測序確證）體內(nèi)表達：選擇合適的表達載體插入目標片段。利用化學(xué)方法或電轉(zhuǎn)化儀等手段轉(zhuǎn)入細胞表達體外轉(zhuǎn)錄和翻譯系統(tǒng)：兔網(wǎng)織紅細胞裂解物、小麥胚芽提取物等第24頁/共33頁表達蛋白的純化SDS聚丙烯酰胺膠回收：利用SDS聚丙烯酰胺膠分離不同大小的的蛋白。利用6×HIS、GST（谷胱甘肽）等和親和樹脂純化：通過表達目標基因的融合蛋白，利用親和層析洗脫出目標蛋白自動核酸/蛋白純化工作站第25頁/共33頁目標蛋白功能分析抗體的制備：多抗、單抗DNA-蛋白質(zhì)相互作用研究：Gel-shift實驗、蛋白質(zhì)磷酸化分析、酵母單雜交系統(tǒng)等蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用研究：酵母雙雜交系統(tǒng)、噬菌體表面展示技術(shù)等第26頁/共33頁蛋白體內(nèi)表達研究Westernblotting：利用抗原-抗體反應(yīng)，對蛋白質(zhì)混合物中的目標蛋白進行鑒別和定量免疫組織化學(xué)研究：通過切片技術(shù)和免疫反應(yīng)，利用特異抗體檢測特定蛋白在組織細胞內(nèi)的表達和定位蛋白質(zhì)芯片系統(tǒng)第27頁/共33頁基因轉(zhuǎn)化實驗和轉(zhuǎn)基因結(jié)果分析轉(zhuǎn)基因載體的構(gòu)建：載體、農(nóng)桿菌、特殊抗生素植株的轉(zhuǎn)化：葉盤轉(zhuǎn)化法、基因槍植株的篩選：熒光檢測、GUS染色、PCR法基因功能分析：激光共聚焦顯微鏡、FISH等第28頁/共33頁部分分子生物學(xué)實驗必需儀器

純水儀移液器

pH計電子天平生化培養(yǎng)箱滅菌鍋第29頁/共33頁謝謝第30頁/共33頁人有了知識，就會具備各種分析能力