第14章核酸的重要理化(Hua)性質0第一頁，共七十四頁。DNA與RNA的(De)差異

DNA

RNA固體白色纖維狀大多為線形分子細長溶液粘度大與酸和二苯胺共熱產生藍紫色白色粉末狀分子量較DNA小得多溶液粘度小能在室溫條件下被稀堿水解成核苷酸與濃鹽酸和苔黑酚共熱產生綠色第二頁，共七十四頁。核酸的物(Wu)理化學性質核酸的糖苷鍵和磷酸二酯鍵可被酸、堿或各自相應的核酸酶水解成為各種成分，其水解程度因水解條件而異核酸和核苷酸既有磷酸基團，又有堿性基團，都是兩性電解質——酸堿性質DNA和RNA都微溶于水，不溶于有機溶劑，提取分離核酸時，可用乙醇將核酸從溶液中常沉淀出來核酸的紫外吸收特性因其所含堿基而引起核酸的變性與復性與其雙螺旋結構有關。第三頁，共七十四頁。一、核酸的水解二、核酸的酸堿性質三、核酸的紫(Zi)外吸收性質四、核酸的變性、復性及雜交核酸的物理化學性質第四頁，共七十四頁。一、核酸的(De)水解（一）酸水解糖苷鍵比磷酸二酯鍵更易被酸水解嘌呤堿基的糖苷鍵比嘧啶堿基的糖苷鍵對酸更不穩定第五頁，共七十四頁。（二(Er)）堿水解RNA的磷酸酯鍵易被堿水解，產生核苷酸。由于RNA的核糖上有2’-OH基，在堿作用下形成磷酸三酯。磷酸三酯極不穩定，隨即水解產生，產生2’,3’-環磷酸酯，再水解成2’-核苷酸及3’-核苷酸相對而言DNA一般對堿穩定。第六頁，共七十四頁。（三(San)）酶水解非特異性——磷酸二酯酶5′

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pOHB

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p3′BBBBBBB牛脾磷酸二酯酶（5′端外切5得3）蛇毒磷酸二酯酶（3′端外切3得5）5′3′結構式5'-核苷酸3'-核苷酸第七頁，共七十四頁。核(He)酸酶的分類（1）底物

RNaseDNase（2）按作用方式核酸內切酶核酸外切酶（5’→3’外切酶、3’→5’外切酶）（3）按斷裂磷酸二酯鍵的方式（4）其他：雙鏈酶、單鏈酶專一性水解磷酸二酯鍵——核酸酶有些核酸酶的特異性很高，能識別和切割DNA的特異序列，是重要的工具酶第八頁，共七十四頁。限制(Zhi)性內切酶

原核生物(及病毒)中存在著一類能識別外源DNA雙螺旋中4-8個堿基對所組成的特異的具有二重旋轉對稱性的回文序列，并在此序列的某位點水解DNA雙螺旋鏈，產生粘性末端或平末端，這類酶稱為限制性內切酶（ristrictionendonuclease）。山東落花生花落東山簾卷晚晴天，天晴晚卷簾WasitacatIsaw?第九頁，共七十四頁。常用的DNA限(Xian)制性內切酶的專一性酶辨認的序列和切口說明‥‥AGCT‥‥‥‥TCGA‥‥‥‥GGATCC‥‥‥‥CCTAGG‥‥‥‥AGATCT‥‥‥‥TCTAGA‥‥‥‥GAATTC‥‥‥‥CTTAAG‥‥‥‥AAGCTT‥‥‥‥TTCGAA‥‥‥‥GTCGAC‥‥‥‥CAGCTG‥‥‥‥CCCGGG‥‥‥‥GGGCCC‥‥BamHIAluIBglIEcoRIHindⅢSalISmaI四核苷酸，平端切口六核苷酸，平端切口六核苷酸，粘端切口六核苷酸，粘端切口六核苷酸，粘端切口六核苷酸，粘端切口六核苷酸，粘端切口第十頁，共七十四頁。限制性內切酶對細菌有何益處(Chu)呢？30多年前,當人們在對噬菌體的宿主特異性的限制-修飾現象進行研究時,首次發現了限制性內切酶.細菌可以抵御新病毒的入侵,而這種"限制"病毒生存的辦法則可歸功于細胞內部可摧毀外源DNA的限制性內切酶.作為微生物免疫機制的一部分行使其功能.當一個沒有限制性內切酶的細菌被病毒感染時,大部分病毒顆粒都能成功地進行感染.一個有限制性內切酶的同種細菌被成功感染的比率顯著下降.出現更多的限制性內切酶將會起到多重保護作用；而一個擁有4到5種各自獨立的限制性內切酶將會使細胞堅不可摧.

第十一頁，共七十四頁。限制性內切酶常常伴隨一到兩種修飾酶（甲基化酶）出現.后者的作用是保護細胞自身的DNA不被限制性內切酶破壞.修飾酶識別的位點與相應的限制性內切酶相同限制性內切酶和它的“搭檔”--甲基化酶一起就構成了限制-修飾（R-M）系統.在一些R-M系統中,限制性內切酶和修飾酶是兩種不同的蛋白,它們各自獨立行使自己的功能；而在另一些系統中,兩種功能由同一種限制-修飾酶的不同亞(Ya)基,或是同一亞基的不同結構域來執行.

第十二頁，共七十四頁。二、核酸的酸堿性(Xing)質1、堿基的解離2、核苷的解離3、核苷酸的解離結合及釋放質子的能力第十三頁，共七十四頁。堿基：含氮堿基，雜環化合物(Wu)（很多生物(Wu)堿的結構）1）、具有芳香環的結構特征，呈平面或近乎平面含有共軛雙鍵體系，紫外區有吸收（260nm）。2）、氮原子位于環上或取代氨基上弱堿性來自于環上氮原子，pKa約9.5，傾向于接受H取代氨基（或曰堿基環外的氨基）堿性很弱，生理條件下不能被質子化。1、堿基的解離第十四頁，共七十四頁。1、堿基的(De)解離胞嘧啶第十五頁，共七十四頁。DNA嘧啶(Ding)堿基的解離尿嘧啶胸腺嘧啶第十六頁，共七十四頁。DNA嘌呤(Ling)堿基的解離腺嘌呤第十七頁，共七十四頁。鳥嘌呤的解(Jie)離第十八頁，共七十四頁。2、核苷(Gan)的解離糖存在影響了堿基的解離——增強了堿基的酸性解離核糖中羥基也可以發生解離第十九頁，共七十四頁。3、核苷酸的解(Jie)離表14-1（重在看懂、理解）第二十頁，共七十四頁。HHH某一基團解離的離子化程(Cheng)度腺苷酸的等電點為？2.3第二十一頁，共七十四頁。鳥苷(Gan)酸的等電點為1.55第二十二頁，共七十四頁。胞(Bao)苷酸的等電點為2.65第二十三頁，共七十四頁。堿性極弱，尿苷酸(Suan)基本可看做酸(Suan)性核苷酸(Suan)，不能算作兼性離子第二十四頁，共七十四頁。多核苷酸中磷酸二酯鍵中的磷酸基團只有一(Yi)個解離常數第二十五頁，共七十四頁。4、核酸的滴(Di)定曲線圖14-2小牛胸腺DNA的滴定曲線反映出變性DNA的滴定曲線改變

堿基的暴露II從pH12或pH2.5分別反向滴定I從pH6.9用酸或堿正向滴定

I天然II變性

電極電位的變化，指示離子濃度的變化第二十六頁，共七十四頁。由于核酸分子中的磷酸是一個中等強度的酸，而堿性（氨基）是一個弱堿，所以核酸的等電點比較低。如DNA的等電點為(Wei)4～4.5，RNA的等電點為2～2.5。RNA的等電點比DNA低的原因，是RNA分子中核糖基2′-OH通過氫鍵促進了磷酸基上質子的解離。第二十七頁，共七十四頁。三、核酸的(De)紫外吸收性質兩類核酸的紫外吸收譜均為260~290nm其最高吸收峰接近260nm第二十八頁，共七十四頁。DNA的紫外吸收(Shou)譜光吸收（A）波長/nm1是天然DNA;2是變性DNA；3是核苷酸總吸收值第二十九頁，共七十四頁。小(Xiao)量DNA或RNA的紫外吸收法定量測定1、

對待測樣品是否純的判斷可用紫外分光光度計讀出260nm和280nm的A值，計算A260/A280，從此值大小判斷樣品的純度，純的DNA的A260/A280應為1.8；純的RNA應為2.0。2、

對純核酸樣品的定量測定只要測出260nm的A值，即可計算含量。通常以1個A單位相當于50ug/ml雙螺旋DNA；或40ug/ml的單鏈DNA(或RNA)；或20ug/ml的寡核苷酸（或單核苷酸）。第三十頁，共七十四頁。四、核酸的(De)變性、復性與雜交(一)核酸的變性（denaturation）1、DNA的變性：

在某些理化因素作用下，DNA雙鏈解開成兩條單鏈的過程。第三十一頁，共七十四頁。

某些理化因素破壞了氫鍵和堿基堆積力，使核酸分子高級結構(Gou)改變、理化性質及生物活性發生改變。

不涉及磷酸二酯鍵斷裂，一級結構不變2、變性的實質第三十二頁，共七十四頁。降解(Jie)：核苷酸骨架上3’，5’-磷酸二酯鍵的斷裂DNA變性的本質是雙鏈間氫鍵的斷裂第三十三頁，共七十四頁。DNA變(Bian)性第三十四頁，共七十四頁。

高溫（一般＞75℃）—熱變性(Xing)

強酸、堿

—酸堿變性

甲醛（Agarose中RNA）

尿素（PAGE中DNA）3、變性因素原理：與蛋白質變性相似，破壞空間結構中的次級鍵第三十五頁，共七十四頁。

OD260增高 粘(Zhan)度下降比旋度下降 浮力密度升高酸堿滴定曲線改變 生物活性喪失4、變性后理化性質變化第三十六頁，共七十四頁。第三十七頁，共七十四頁。完全變(Bian)性后核酸紫外吸收值增加：天然DNA25－40%、RNA約1.1%實質：堿基暴露由于變性或降解引起紫外吸收增加的現象稱增色效應提供了一個很好的檢測變性的方法！第三十八頁，共七十四頁。

變性RNA酶的分數是根據溶液的特性粘度(Du)增加、在365nm的旋光度變化和287nm紫外吸收變化變性RNA酶的分數溫度Tm第三十九頁，共七十四頁。5、DNA熱變性的特(Te)征變性過程是“躍yue變式”的，而非漸變解鏈曲線：連續加熱DNA，以溫度對A260作圖，所得的曲線稱為解鏈曲線。第四十頁，共七十四頁。指增色效應達50%時(Shi)的溫度一般DNATm值在85-90C之間Tm：DNA變性時，OD260達到最大值的50%時的溫度稱為DNA的解鏈溫度或融解溫度(Tm)。大小與G+C含量成正比。第四十一頁，共七十四頁。（1）DNA的均(Jun)一性：（2）G－C含量：

經驗公式：XG+C＝（Tm－69.3）×2.44（3）介質中的離子強度：

Tm值大小與下列因素有關：第四十二頁，共七十四頁。（1）DNA的均一性。均質DNA，如一些病毒DNA，人工合成的poly(A-T)、poly(G-C)的熔解過程(Cheng)發生在一個較小的溫度范圍內；異質DNA的熔解過程(Cheng)發生在一個較寬的溫度范圍內。Tm大小可反映出DNA的均一性。第四十三頁，共七十四頁。（2）G-C的含量。G-C的含量高，Tm值高。因而測定Tm值，可反映DNA分子(Zi)中G、C含量，可通過經驗公式計算：（G+C)%=(Tm-69.3)2.44第四十四頁，共七十四頁。（3）介質中的離子強度。Tm與介質中離子強度有關，一般來說，在離子強度低的介質中，DNA的Tm值較低，熔解(Jie)的范圍較寬。在離子強度高的介質中，DNA的Tm值較高，熔解的范圍較窄。DNA的保存應在含鹽的緩沖液中第四十五頁，共七十四頁。溶液(Ye)的pH

高pH下堿基廣泛去質子而喪失形成氫鍵的能力，pH大于11．3時，DNA完全變性pH低于5．0時，DNA易脫嘌呤對單鏈DNA進行電泳時，常在凝膠中加NaOH以維持變性狀態第四十六頁，共七十四頁。變(Bian)性劑與Tm甲酰胺、尿素、甲醛等可破壞氫鍵，妨礙堿基堆積，使Tm下降對單鏈DNA進行電泳時，常使用上述變性劑第四十七頁，共七十四頁。影響熱變性的的Tm(熔解溫(Wen)度）因素（1）DNA的均一性（2）GC對含量（3）溶液的離子強度（4）溶液的pH（5）變性劑第四十八頁，共七十四頁。RNA變性：從螺旋到線團之間的轉變RNA的變性引起(Qi)的性質變化沒有DNA明顯第四十九頁，共七十四頁。質粒是原核生物和部分真核生物中獨立于染色體外的自主復制的遺傳分子，除酵母的殺傷質粒已知是RNA外，其它均為DNA分子。1963年Bevan等發現酵母菌株間的相互殺死現象，其嗜殺特性由具有自我(Wo)復制能力的細胞質遺傳因子——雙鏈線狀RNA（dsRNA）（占全部核酸的0.1%）決定。同時dsRNA通常以蛋白質外殼包裹著的類病毒顆粒狀態存在于細胞質中。目前研究表明，只有兩種雙鏈RNA與嗜殺現象有關：MdsRNA編碼產生毒素蛋白及決定對自身毒素的免疫功能（90%以上），LdsRNA編碼自身和外殼主蛋白（6%）第五十頁，共七十四頁。(2)核(He)酸的復性變性DNA在適當的條件下，兩條彼此分開的單鏈可以重新締合成為雙螺旋結構，這一過程稱為復性。DNA復性后，一系列性質將得到恢復，但是生物活性一般只能得到部分的恢復。DNA復性的程度、速率與復性過程的條件有關。第五十一頁，共七十四頁。將熱變性的DNA驟然冷卻至低溫(Wen)時，DNA不可能復性。但是將變性的DNA緩慢冷卻時，可以復性。驟然冷卻變性核酸復性時需緩慢冷卻，故又稱退火第五十二頁，共七十四頁。第五十三頁，共七十四頁。核酸(Suan)復性動力學在一定條件下，DNA復性的速度可以用C0t1/2來衡量第五十四頁，共七十四頁。影響復性速度(Du)的因素(1)單鏈片段濃度越高，隨機碰撞的頻率越高，復性速度越快。(2)較大的單鏈片段擴散困難，鏈間錯配頻率高，復性較慢。(3)片段內的重復序列多，則容易形成互補區，因而復性較快。真核DNA的重復序列就是通過復性動力學研究發現的。（4）維持溶液一定的離子強度，消除磷酸基負電荷造成的斥力，可加快復性速度第五十五頁，共七十四頁。

熱變性的DNA在復性過程中，具有堿基序列部分(Fen)互補的不同的DNA之間或DNA與RNA之間形成雜化雙鏈的現象。核酸分子雜交

(hybridization)：第五十六頁，共七十四頁。核酸(Suan)分子的雜交變性復性

基于核酸變性和復性的原理，并依據堿基間互補配對的原則而建立的一門技術。主要用于確定兩種相同或不同的核酸分子間同源性的鑒定第五十七頁，共七十四頁。變(Bian)性復性復性第五十八頁，共七十四頁。第五十九頁，共七十四頁。第六十頁，共七十四頁。第六十一頁，共七十四頁。分(Fen)子雜交Southern印跡（雜交）Northern印跡（雜交）Western印跡法雜交技術與PCR技術結合，能夠檢出含量極低的DNA。第六十二頁，共七十四頁。一、單項選擇題1．關(Guan)于核酸分子組成下列哪項是正確的A．組成核酸的基本單位是三磷酸核苷B.組成DNA和RNA的戊糖相同C．組成DNA和RNA的堿基是相同的D.DNA的二級結構為α-螺旋E.以上都不對2．生物體的遺傳信息儲存在DNA的什么部位A．堿基配對B.某個核苷酸C.某種核苷D.磷酸戊糖骨架E.堿基順序中3．下列哪個是核酸的基本結構單位A.核苷B.磷酸戊糖C.單核苷酸D.多核苷酸E.以上都不是4．下列何物分子是C5上有甲基的堿基A.腺嘌呤B.鳥嘌呤C.胞嘧啶D.胸腺嘧啶E.尿嘧啶第六十三頁，共七十四頁。5．組成DNA分子的磷酸戊糖是：A.3’-磷酸脫氧核糖B.5’-磷酸脫氧核糖C.3’-磷酸核糖D.2’-磷酸核糖E.5’-磷酸核糖6．嘌呤核苷酸中下列何鍵是嘌呤與戊糖的連接鍵A.N9—C1'B.N8—C1'C.N1—C1'D.N3—C1'E.N7—C1'7．關于ATP生理功能的敘述下列哪項是錯誤的A.它是生物體內直接供能物質B.可生成環腺苷酸（cAMP）C.作為物質代謝調節劑D.RNA的合成原料E.以(Yi)上都不是8．核酸分子中，單核苷酸連接是通過下列何化學鍵A.氫鍵B.糖苷鍵C.3'，5'-磷酸二酯鍵D.疏水鍵E.鹽鍵第六十四頁，共七十四頁。9．下列所述哪個是DNA分子的一級結構A.脫氧(Yang)核糖核苷酸殘基的排列順序B.各種單核苷酸的連接方式C.雙螺旋結構D.連接單核苷酸間的磷酸二酯鍵E.以上都不是10．關于DNA二級結構的論述下列哪項是錯誤的A.兩條多核苷酸鏈互相平行方向相反B.兩條鏈堿基之間形成氫鍵C.堿基按A—T和G—C配對D.磷酸和脫氧核糖在內側，堿基在外側E.圍繞同一中心軸形成雙螺旋結構11．有關tRNA結構的敘述，下列哪項是錯誤的A.是RNA中最小的單鏈分子B.其二級結構通常為三葉草形C.分子中含有較多的稀有堿基D.3’末端是活化氨基酸的結合部位E.tRNA三級結構呈正“L”型12．下列哪個結構存在于真核生物mRNA5'端A.聚A尾巴B.帽子結構C.超螺旋結構D.核小體E.-C-C-A-OH順序第六十五頁，共七十四頁。13．下列哪個結構存在于tRNA3'端A.聚A尾巴B.帽子結構C.超螺旋結構D.核(He)小體E.-C-C-A-OH順序14．下列哪個結構存在于mRNA3'端A.聚A尾巴B.帽子結構C.超螺旋結構D.核小體E.-C-C-A-OH順序15．下列何構型是溶液中DNA分子最穩定的構型A.A型B.B型C.C型D.D型E.Z型16．下列何物是在蛋白質合成中作為直接模板A.DNAB.RNAC.mRNAD.rRNAE.tRNA第六十六頁，共七十四頁。二、多項選擇題1．下列哪些是維系DNA雙螺旋的主要因素A.鹽鍵B.磷酸二酯鍵C.疏水鍵D.氫鍵E.堿基堆砌作用2．rRNA具有下列哪些結構A.密碼子(Zi)

B.反密碼子C.反密碼環D.大亞基E.小亞基3．核酸變性可觀察到下列何現象A.黏度增加B.黏度降低C.紫外吸收值增加D.紫外吸收值降低E.磷酸二酯鍵斷裂第六十七頁，共七十四頁。4．組成核小體的成分有A.DNAB.RNAC.組蛋白D.磷脂E.酸性(Xing)蛋白5．tRNA二級結構含有下列哪些成分A.密碼子B.大亞基C.反密碼環D.稀有堿基E.氨基酸結合臂6．下列物質哪些含AMP結構A.NAD+B.NADP+C.CoQD.CoAE.FAD第六十八頁，共七十四頁。一、單項(Xiang)選擇題 1.E2.E3.C4.D5.B6.A7.E8.C9.A10.D 11.E12.B