代謝調(diào)節(jié)與代謝工程(1).直線式代謝途徑中的反饋抑制： 蘇氨酸脫氨酶α-酮丁酸 異亮氨酸 反饋抑制 其它實(shí)例：谷氨酸棒桿菌的精氨酸合成(2).分支代謝途徑中的反饋抑制：在分支代謝途徑中，反饋抑制的情況較為復(fù)雜，為了避免在一個(gè)分支上的產(chǎn)物過多時(shí)不致同時(shí)影響另一分支上產(chǎn)物的供應(yīng)，微生物發(fā)展出多種調(diào)節(jié)方式。主要有：同功酶的調(diào)節(jié)，順序反饋，協(xié)同反饋，積累反饋調(diào)節(jié)等。3.2.3反饋抑制的類型代謝調(diào)節(jié)與代謝工程(1)同功酶調(diào)節(jié)——isoenzyme定義：催化相同的生化反應(yīng)，而酶分子結(jié)構(gòu)有差別的一組酶。意義：在一個(gè)分支代謝途徑中，如果在分支點(diǎn)以前的一個(gè)較早的反應(yīng)是由幾個(gè)同功酶催化時(shí)，則分支代謝的幾個(gè)最終產(chǎn)物往往分別對(duì)這幾個(gè)同功酶發(fā)生抑制作用。———某一產(chǎn)物過量?jī)H抑制相應(yīng)酶活，對(duì)其他產(chǎn)物沒影響。舉例：大腸桿菌的天冬氨酸族氨基酸合成的調(diào)節(jié)代謝調(diào)節(jié)與代謝工程代謝調(diào)節(jié)與代謝工程

天冬氨酸 E,R

4-磷酸天冬氨酸

E 天冬氨酸半醛 E,R E二氫吡啶二羧酸 同型絲氨酸 同型絲氨酸磷酸

E,R R O-琥珀酰同型絲氨酸 蘇氨酸

E,R六氫吡啶二羧酸 胱硫醚 2-酮丁酸

R

二氨基庚二酸 同型半胱氨酸

R

賴氨酸 甲硫氨酸 異亮氨酸天冬氨酸族

（谷氨酸棒桿菌）代謝調(diào)節(jié)與代謝工程合作反饋抑制定義：兩種末端產(chǎn)物同時(shí)存在時(shí)，共同的反饋抑制作用大于二者單獨(dú)作用之和。舉例：在嘌呤核苷酸合成中，磷酸核糖焦磷酸酶受AMP和GMP（和IMP）的合作反饋抑制，二者共同存在時(shí)，可以完全抑制該酶的活性。而二者單獨(dú)過量時(shí)，分別抑制其活性的70%和10%。代謝調(diào)節(jié)與代謝工程(3)積累反饋抑制定義：每一分支途徑末端產(chǎn)物按一定百分比單獨(dú)抑制共同途徑中前面的酶，所以當(dāng)幾種末端產(chǎn)物共同存在時(shí)它們的抑制作用是積累的，各末端產(chǎn)物之間既無(wú)協(xié)同效應(yīng)，亦無(wú)拮抗作用。代謝調(diào)節(jié)與代謝工程(4)順序反饋抑制一種終產(chǎn)物的積累,導(dǎo)致前一中間產(chǎn)物的積累，通過后者反饋抑制合成途徑關(guān)鍵酶的活性，使合成終止。舉例：枯草芽孢桿菌芳香族氨基酸合成的調(diào)節(jié)代謝調(diào)節(jié)與代謝工程分支途徑上游的某個(gè)酶受到另一條分支途徑的終產(chǎn)物，甚至于本分支途徑幾乎不相關(guān)的代謝中間物的抑制或激活，使酶的活力受到調(diào)節(jié)，此即代謝互鎖。

4.1.8代謝互鎖代謝調(diào)節(jié)與代謝工程在分支合成途徑中，分支點(diǎn)后的兩種酶競(jìng)爭(zhēng)同一種底物，如AMP與GMP，Thr與Lys、Met，由于兩種酶對(duì)底物的Km值（即對(duì)底物的親和力）不同，故兩條支路的一條優(yōu)先合成。3.1.8優(yōu)先合成代謝調(diào)節(jié)與代謝工程工業(yè)發(fā)酵的目的——大量地積累人們所需要的微生物代謝產(chǎn)物。在正常生理?xiàng)l件下

微生物通過其代謝調(diào)節(jié)系統(tǒng)吸收利用營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)用于合成細(xì)胞結(jié)構(gòu)，進(jìn)行生長(zhǎng)和繁殖，它們通常不浪費(fèi)原料和能量，也不積累中間代謝產(chǎn)物代謝的人工控制人為地打破微生物的代謝控制體系，就有可能使代謝朝著人們希望的方向進(jìn)行代謝調(diào)節(jié)與代謝工程（1）對(duì)于直線式代謝途徑：選育營(yíng)養(yǎng)缺陷性突變株只能積累中間代謝產(chǎn)物

AaBbCcDdE

1)營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株的應(yīng)用

末端產(chǎn)物E對(duì)生長(zhǎng)乃是必需的，所以，應(yīng)在培養(yǎng)基中限量供給E，使之足以維持菌株生長(zhǎng)，但又不至于造成反饋調(diào)節(jié)（阻遏或抑制），這樣才能有利于菌株積累中間產(chǎn)物C。遺傳學(xué)方法代謝調(diào)節(jié)與代謝工程(2)分支代謝途徑：情況較復(fù)雜，可利用營(yíng)養(yǎng)缺陷性克服協(xié)同或累加反饋抑制積累末端產(chǎn)物，亦可利用雙重缺陷發(fā)酵生產(chǎn)中間產(chǎn)物ABCDEFG代謝調(diào)節(jié)與代謝工程谷氨酸棒桿菌的代謝調(diào)節(jié)與賴氨酸生產(chǎn)E：表示反饋抑制；R：表示反饋?zhàn)瓒?/p>

高絲氨酸脫氫酶（HSDH）天冬氨酸激酶（AK)賴氨酸生產(chǎn)菌:高絲氨酸缺陷型代謝調(diào)節(jié)與代謝工程分支途徑——①賴氨酸發(fā)酵

(谷氨酸棒桿菌的代謝調(diào)控)代謝調(diào)節(jié)與代謝工程分支途徑——②肌苷酸發(fā)酵

（IMP合成途徑的代謝調(diào)控）調(diào)控理論的實(shí)踐應(yīng)用代謝調(diào)節(jié)與代謝工程2)抗反饋控制突變株的應(yīng)用★抗反饋控制突變株——是指對(duì)反饋抑制不敏感或?qū)ψ瓒粲锌剐裕騼烧呒嬗兄木辍！锟狗答伩刂仆蛔冎昕梢詮慕K產(chǎn)物結(jié)構(gòu)類似物抗性突變株和營(yíng)養(yǎng)缺陷性回復(fù)突變株中獲得。★獲得方法及其原理：代謝調(diào)節(jié)與代謝工程目標(biāo)產(chǎn)物結(jié)構(gòu)類似物賴氨酸S-（2氨基乙基）-L半胱氨酸-(AEC)蘇氨酸-氨基--羥基戊酸（AHV)異亮氨酸乙硫氨酸精氨酸D-精氨酸苯丙氨酸對(duì)氟苯丙氨酸代謝調(diào)節(jié)與代謝工程營(yíng)養(yǎng)缺陷型回復(fù)突變株調(diào)節(jié)酶的變構(gòu)特性是由其結(jié)構(gòu)基因決定的，如果調(diào)節(jié)酶的基因發(fā)生突變而失活，則有兩種可能性：一是催化亞基和調(diào)節(jié)亞基的基因均發(fā)生突變；另一種可能僅僅是催化亞基發(fā)生突變。一是催化亞基和調(diào)節(jié)亞基恢復(fù)到第一次突變前的活性水平。如果前者發(fā)生回復(fù)突變，則又有兩種可能性另一種是催化亞基得以恢復(fù)，而調(diào)節(jié)亞基喪失了調(diào)節(jié)的功能。營(yíng)養(yǎng)缺陷型回復(fù)突變代謝調(diào)節(jié)與代謝工程組成型突變株結(jié)構(gòu)基因不受控制地轉(zhuǎn)錄，酶的生成將不再需要誘導(dǎo)劑或不再被末端產(chǎn)物或分解代謝物阻遏。調(diào)節(jié)基因發(fā)生突變產(chǎn)生無(wú)效的阻遏物而不能與操縱基因結(jié)合操縱基因突變突變操縱基因不能與阻遏物結(jié)合組成型突變代謝調(diào)節(jié)與代謝工程DABCEF2.生物化學(xué)方法1.添加前體繞過反饋控制點(diǎn)：亦能使某種代謝產(chǎn)物大量產(chǎn)生(-)(-)(-)2.添加誘導(dǎo)劑：從提高誘導(dǎo)酶合成量來(lái)說(shuō)，最好的誘導(dǎo)劑往往不是該酶的底物，而是底物的衍生物。3.發(fā)酵與分離過程耦合：4.控制發(fā)酵的培養(yǎng)基成分：代謝調(diào)節(jié)與代謝工程谷氨酸發(fā)酵一、谷氨酸發(fā)酵菌種：CorynebacteriumpekinenseCorynebacteriumglutamicumBrevibacteriumflavu二、發(fā)酵機(jī)理：①谷氨酸以-酮戊二酸為碳架；當(dāng)以糖質(zhì)為發(fā)酵原料時(shí)，合成途徑包括EMP,HMP,TCA循環(huán),乙醛酸循環(huán)等；②谷氨酸產(chǎn)生菌的-酮戊二酸氧化酶活力很弱或缺少，而谷氨酸脫氫酶的活力要很高；③生物素是谷氨酸產(chǎn)生菌必需的一種維生素，在谷氨酸生物合成中起著重要作用，缺乏或量太高都會(huì)使谷氨酸合成受阻。生物素通過影響細(xì)胞膜的通透性而影響谷氨酸發(fā)酵。代謝調(diào)節(jié)與代謝工程回補(bǔ)順序谷氨酸+NH3谷氨酸脫氫酶-酮戊二酸氧化酶代謝調(diào)節(jié)與代謝工程1.谷氨酸生產(chǎn)菌中存在2個(gè)糖酵解途徑EMP/HMP生物素參與糖代謝作用：增加糖代謝的速度而丙酮酸氧化脫羧的速度未改變丙酮酸積累乳酸積累2.α-酮戊二酸氧化酶缺失TCA環(huán)阻斷，α-酮戊二酸積累代謝調(diào)節(jié)與代謝工程3.四碳二羧酸的來(lái)源Δ在生產(chǎn)菌中檢出CO2固定反應(yīng)酶活性磷酸烯醇丙酮酸(PEF)羧化酶和蘋果酸酶谷氨酸對(duì)糖的轉(zhuǎn)化率達(dá)到81.7%Δ

DCA循環(huán)標(biāo)志酶：異檸檬酸裂解酶在谷氨酸發(fā)酵中，DCA環(huán)一方面可以作為TCA循環(huán)有缺陷時(shí)C4二羧酸的補(bǔ)充在谷氨基酸生產(chǎn)菌的生長(zhǎng)中提供能量作用谷氨酸生成期中要封閉DCA環(huán)？通過DCA環(huán)提供C4二羧酸時(shí)谷氨酸對(duì)糖的轉(zhuǎn)化率僅為54.4%代謝調(diào)節(jié)與代謝工程4.異檸檬酸脫氫酶活力強(qiáng)提供NADPH,用于還原α-酮戊二酸生成谷氨酸，形成氧化還原共扼體系5.氨的導(dǎo)入合成谷氨酸的反應(yīng)有3種：α-酮戊二酸+NH4+NADPH+谷氨酸H2ONADP++谷氨酸脫氫酶α-酮戊二酸+天冬氨酸或丙氨酸谷氨酸轉(zhuǎn)氨酶谷氨酸α-酮戊二酸+α-酮戊二酸+谷氨酰胺NADPH+2谷氨酸NADP+谷氨酸合成酶代謝調(diào)節(jié)與代謝工程生產(chǎn)菌中谷氨酸轉(zhuǎn)氨酶活力低，轉(zhuǎn)氨作用可以不考慮谷氨酸合成酶由于不受高濃度谷氨酸抑制，其作用值得重視谷氨酸脫氫酶是合成積累谷氨酸的主要酶氨的導(dǎo)入時(shí)生物素缺乏，NH4+影響糖代謝速度：提高糖代謝速度高效合成谷氨酸生物素充足時(shí)，NH4+不影響糖代謝速度6.谷氨酸合成的調(diào)節(jié)機(jī)制谷aa比天冬aa優(yōu)先合成谷aa脫氫酶谷aa對(duì)其反饋抑制和反饋?zhàn)瓒魴幟仕岷铣擅窽CA的關(guān)鍵酶，受能荷調(diào)節(jié)，谷aa反饋?zhàn)瓒簦瑸躅^酸反饋抑制異檸檬酸脫氫酶α-酮戊二酸反饋抑制α-酮戊二酸脫氫酶先天喪失或微弱PEP受天冬aa反饋抑制，受谷aa和天冬aa反饋?zhàn)瓒舸x調(diào)節(jié)與代謝工程7.細(xì)胞膜通透性控制代謝調(diào)節(jié)與代謝工程生物素阻斷脂肪酸的合成影響細(xì)胞膜的合成表面活性劑對(duì)生物素有拮抗阻斷脂肪酸的合成影響細(xì)胞膜的合成在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期添加青霉素抑制細(xì)胞壁合成細(xì)胞膜損傷甘油缺陷型磷脂的合成受阻影響細(xì)胞膜的合成油酸缺陷型阻斷不飽和脂肪酸的合成影響細(xì)胞膜的合成代謝調(diào)節(jié)與代謝工程三磷酸腺苷(ATP)是為許多反應(yīng)提供能量的高能磷酸化物,細(xì)胞中的ATP、ADP和AMP含量處于相對(duì)平衡的狀態(tài)——細(xì)胞中的能量狀態(tài)3.2.5.3能荷（Energycharge）能荷（Energycharge）來(lái)表示細(xì)胞中的能量狀態(tài)。能荷（EC）可用下式來(lái)表示：

系統(tǒng)中只有ATP時(shí)，EC值為1；只有AMP時(shí)，EC值等于0。代謝調(diào)節(jié)與代謝工程能荷不僅能調(diào)節(jié)分解代謝形成ATP的酶活性，也能調(diào)節(jié)合成代謝利用ATP的酶活性。細(xì)胞能荷可調(diào)節(jié)酶活性高能荷抑制異檸檬酸脫氫酶和磷酸果糖激酶等檸檬酸和ATP都是磷酸果糖激酶活性的抑制劑，從而限制了葡萄糖的利用速度。有氧條件下，大量合成ATP，細(xì)胞能荷增加異檸檬酸脫氫酶受到ATP抑制，導(dǎo)致檸檬酸的積累代謝調(diào)節(jié)與代謝工程在厭氧條件下，酵母菌無(wú)法通過呼吸鏈產(chǎn)生ATP，細(xì)胞能荷較低。ADP和AMP激活磷酸果糖激酶，使利用葡萄糖生產(chǎn)酒精的速度加快。代謝調(diào)節(jié)與代謝工程第十二章工業(yè)微生物發(fā)酵產(chǎn)品調(diào)節(jié)點(diǎn)主要在三個(gè)激酶，即己糖激酶、磷酸果糖激酶和丙酮酸激酶。它們是糖酵解途徑中的關(guān)鍵酶，是糖酵解途徑的三個(gè)不可逆步驟糖代謝的調(diào)節(jié)主要是能荷的控制代謝調(diào)節(jié)與代謝工程3.2.5.4無(wú)機(jī)聚磷酸的代謝與功能磷酸鹽和能量的儲(chǔ)存。重金屬陽(yáng)離子的解毒作用。代謝調(diào)節(jié)與代謝工程活性污泥中的聚磷菌

生活在營(yíng)養(yǎng)豐富的環(huán)境中，在將進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)，為大量分裂作準(zhǔn)備，細(xì)胞能從廢水中大量攝取溶解態(tài)的正磷酸鹽，在細(xì)胞內(nèi)合成多聚磷酸鹽。細(xì)菌經(jīng)過對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期而進(jìn)入靜止期時(shí)，若環(huán)境中的磷源仍有剩余，細(xì)胞又有一定的能量時(shí)，仍能從外界吸收磷元素，這種對(duì)磷的積累作用大大超過微生物正常生長(zhǎng)所需的磷量，可達(dá)細(xì)胞重量的6％-8％，有報(bào)道甚至可達(dá)10％。以多聚磷酸鹽的形式積累于細(xì)胞內(nèi)作為貯存物質(zhì)。當(dāng)細(xì)菌細(xì)胞處于極為不利的生活條件時(shí)，例如使好氧細(xì)菌處于厭氧條件下，即所謂細(xì)菌“壓抑”狀態(tài)時(shí)，聚磷菌能吸收污水中的乙酸、甲酸、丙酸及乙醇等極易生物降解的有機(jī)物質(zhì)，貯存在體內(nèi)作為營(yíng)養(yǎng)源，同時(shí)將體內(nèi)存貯的聚磷酸鹽分解，釋放到環(huán)境中來(lái)，以便獲得能量，供細(xì)菌在不利環(huán)境中維持其生存所需，此時(shí)菌體內(nèi)多聚磷酸鹽就逐漸消失，而以可溶性單磷酸鹽的形式排到體外環(huán)境中。代謝調(diào)節(jié)與代謝工程概念：有氧條件下，發(fā)酵作用受抑制的現(xiàn)象（或氧對(duì)發(fā)酵的抑制現(xiàn)象）。意義：合理利用能源通風(fēng)對(duì)酵母代謝的影響通風(fēng)（有氧呼吸）缺氧（發(fā)酵）酒精生成量耗糖量/單位時(shí)間細(xì)胞的繁殖低（接近零）少旺盛高多很弱至消失巴斯德效應(yīng)(ThePasteureffect)現(xiàn)象：代謝調(diào)節(jié)與代謝工程巴斯德效應(yīng)（Pasteureffect）機(jī)理巴斯德在研究酵母的酒精發(fā)酵時(shí)發(fā)現(xiàn)：厭氧條件下酵母菌進(jìn)行酒精發(fā)酵，葡萄糖的消耗速度很快；而在有氧條件下，酵母菌進(jìn)行呼吸作用，糖的消耗速度較低，酒精產(chǎn)量也降低。呼吸抑制發(fā)酵作用的的現(xiàn)象巴斯德效應(yīng)的本質(zhì)是能荷調(diào)節(jié)。代謝調(diào)節(jié)與代謝工程Cratree效應(yīng)

在一些代謝旺盛的正常組織和腫瘤細(xì)胞