高效液相色譜法

highperformanceliquidchromatography

1以經典液相色譜法為基礎，引入氣相色譜的理論與實驗方法，發展而成的分離分析方法。以高壓泵輸送液體流動相，采用高效固定相，實現在線檢測和儀器化。具有分離效能高、分析速度快、應用范圍廣等的優點。第一節

概述

2與氣相色譜法對比GC快速、分離效率高、樣品用量少。在約300萬個有機化合物中，可以直接用該法分析的占20%。HPLC快速、分離效率高、樣品不受揮發性及熱穩定性的約束，因而分析對象廣。3第一節高效液相色譜法的主要類型和原理LLC和LSC分配、吸附、離子交換和空間排阻化學健合相色譜法ISC和PIC/IPC5二、化學鍵合相色譜法將固定液的官能團鍵合在載體的表面構成化學鍵合相。以化學鍵合相為固定相的色譜法稱為鍵合相色譜法。鍵合相色譜法是應用最廣的色譜法。6鍵合相色譜法正相色譜法反相色譜法RHPLCISCPICorIPC7（二）反相鍵合相色譜法常用固定相：十八烷基硅烷（C18，ODS）

常用流動相：甲醇—水，乙腈—水分析對象：非極性、中等極性的分子型化合物分離機制：疏溶劑理論認為在該法中溶質的保留是溶質分子與極性分子間的排斥力。9反相鍵合相色譜法影響保留行為的因素溶質的分子結構

極性，疏水性，k，tR

流動相

與其表面張力和介電常數有關，有機溶劑含量，k流動相的pH影響溶質的離解程度，離解程度，k固定相

隨碳鏈延長，鍵合相疏水性，k碳鏈一定時，鍵合相濃度，k10離子抑制色譜法ISCISC—調節RLLC流動相pH值以抑制組分的離解

抑制劑：弱酸(HAc)、弱堿(NH3H2O)或緩沖液

分離機制：調節流動相pH，抑制組分的理解，以中性分子的形式在固定相和流動相之間產生分配平衡。

分析對象：3.0≤pKa≤

7.0的弱酸7.0≤

pKa≤

7.0的弱堿

兩性化合物

11（三）反相離子對色譜法RPIC—在一般RLLC流動相中加入離子對試劑。

常用的離子對試劑：分析堿用烷基磺酸鹽，分析酸用四丁基季胺鹽。

分離機制：離子對試劑與被分析的離子形成中性離子對，在固定相和流動相之間產生分配平衡。分析對象：各類有機酸、堿、鹽及兩性化合物

13保留機制-離子對模型B+HBH+RSO3NaRSO3-+Na++BH+RSO3-固定相BH+RSO3-14影響容量因子的因素離子對試劑的種類和濃度

分析酸性類物質季銨鹽分析堿性類物質烷基磺酸鹽或硫酸鹽PIC試劑碳鏈，k在低于膠束濃度時，PIC試劑濃度，k流動相的pH影響PIC試劑和組分的離子化15三、其他高效液相色譜法離子色譜法（ionchromatography）手性色譜法（chialchromatography）親和色譜法（affinitychromatography）17離子色譜法（ionchromatography）離子交換色譜與電導檢測器相結合分析各種離子的方法抑制型（雙柱型）和非抑制型（單柱型）分離柱交換反應：R＋－OH－+NaX→R＋－X－+NaOH洗脫反應：R＋―X－+NaOH→R＋－OH－+NaX抑制柱與組分反應：R――H＋+NaX→R――Na＋+HX與洗脫劑反應：R－―H＋+NaOH→R――Na＋+H2O18第二節HPLC的固定相和流動相及其選擇固定相應滿足下列要求顆粒細、均勻傳質快機械強度高，耐高壓化學穩定性好，與流動相不發生反應19（一）鍵合相的種類

1.非極性鍵合相表面基團-C18H37-C8H17OHSiOSiOHOSiOHOSiOSiOHOH硅膠表面212.弱極性、極性鍵合相弱極性鍵合相：

O正相和反相均可極性鍵合相：

CNNH2

一般作正相OSiCH3CNCH3(CH)2nSi22（二）鍵合相的性質和特點鍵合反應含碳量和覆蓋度鍵合基團的鏈長增加，極性降低，載樣量增大，容量因子增加。鍵合相的特點

不流失、穩定、載樣量大注意點pH適用范圍23流動相對分離的影響

分離度R與n、、k2的關系n-決定于色譜柱（固定相）性能。、k-受溶劑系統（流動相）影響。

R=n4-1k2k2-1(a)(b)(c)25AB23AB12AB12增加246810110070030010060%乙腈Time(min.)mAU40%水溶劑洗脫強度增加20001600600080%乙腈Time(min.)mAU100020%水246810InjectTime高柱效低柱效柱效增加26在HPLC中縱向擴散項B=2Dm

Dm

T/B/u減小至忽略不計渦流擴散項A=2dp降低降低dp

傳質阻力系數CCm+CsmH=A+Cu=A+Cmu+Csmu

近似認為流動相的流速與板高成直線關系，流速增大，板高增加，柱效降低。一般采用1ml/min。29固定相粒度對板高的影響

Cm=dp2/Dmdp—固定相微粒直徑小粒度、均勻的球形化學鍵合相低粘度流動相，流速不宜太快柱溫適當30（二）正相鍵合相色譜法的分離條件固定性極性>流動相極性固定相：極性鍵合相

流動相：烷烴（底劑）+極性調節劑

正相洗脫時，依靠組分的極性差別而分離出峰順序：極性小的組分先出峰。31（三）反相鍵合相色譜法的分離條件流動相極性>固定相極性固定相：非極性鍵合相

流動相：甲醇-水、乙腈-水，常加入弱酸、弱堿或緩沖鹽調節流動相pH以抑制組分離解，增加保留

反相洗脫時，出峰順序：極性大的組分先出峰。

32（四）反相離子對色譜法的分離條件離子對試劑的選擇流動相pH的選擇有機溶劑及其濃度的選擇33四、其他固定相鍵合型離子交換劑手性固定相分析、分離對映體的最重要手段。制備單一構型的活性異構體是世界制藥業的大方向。親和色譜固定相雖然并非新方法，但近年來有了長足的發展。利用親合反應的專屬性