關于蛋白質的顏色反應和沉淀反應第一頁，共二十二頁，2022年，8月28日一、實驗目的1.熟悉蛋白質的沉淀反應、顏色反應2.了解蛋白質的沉淀反應、顏色反應的機理。第二頁，共二十二頁，2022年，8月28日二、實驗原理

蛋白質分子中的某些基團與顯色劑作用，可產生特定的顏色反應，不同蛋白質所含氨基酸不完全相同，顏色反應亦不同。顏色反應不是蛋白質的專一反應，一些非蛋白物質亦可產生相同顏色反應，因此不能僅根據顏色反應的結果決定被測物是否是蛋白質。顏色反應是一些常用的蛋白質定量測定的依據。（一）蛋白質的顏色反應原理第三頁，共二十二頁，2022年，8月28日（二）蛋白質的沉淀反應原理

蛋白質的水溶液是一種比較穩定的親水膠體，這是因為蛋白質顆粒表面帶有很多極性基團，如-NH3+，-COO-，-SH等和水有高度親和性，當蛋白質與水相遇時，就很容易被蛋白質吸住，在蛋白質顆粒外面形成一層水膜(又稱水化層)。水膜的存在使蛋白顆粒相互隔開，顆粒之間不會碰撞而聚成大顆粒。因此蛋白質在溶液中比較穩定而不會沉淀。第四頁，共二十二頁，2022年，8月28日

蛋白質能形成較穩定的親水膠體的另一個原因，是因為蛋白質顆粒在非等電狀態時帶有相同電荷，使蛋白質顆粒之間相互排斥，保持一定距離，不致相互凝集沉淀。

蛋白質由于帶有電荷和水膜，因此在水溶液中形成穩定的膠體。當某些物理化學因素破壞了蛋白質的水膜或中和了蛋白質的電荷，則蛋白質膠體溶液就不穩定而出現沉淀現象。第五頁，共二十二頁，2022年，8月28日蛋白質變性后,有時由于維持溶液穩定的條件仍然存在(如電荷),并不析出.因此變性蛋白質并不一定都表現為沉淀,而沉淀的蛋白質也未必都已變性.第六頁，共二十二頁，2022年，8月28日三、實驗儀器、試劑和材料1.卵清蛋白液：將雞蛋白用蒸餾水稀釋20～40倍，2～3層紗布過濾，濾液冷藏備用。2.飽和硫酸銨溶液：稱硫酸銨850g加于1000mL蒸餾水中，在70～80℃下攪拌促溶，室溫中放置過夜，瓶底析出白色結晶，上清液即為飽和硫酸銨溶液。3.1%醋酸鉛溶液4.1%硫酸銅溶液5.0.1%茚三酮溶液：0.1g茚三酮溶于95%乙醇并稀釋至100mL。6.濃硝酸：比重1.42。7.試管及試管架、吸管、量筒等。第七頁，共二十二頁，2022年，8月28日四、操作步驟(一)蛋白質的顏色反應1.雙縮脲反應原理：當尿素經加熱至180℃左右時，兩分子尿素脫去一分子氨，進而縮合成一分子雙縮脲。在堿性條件下雙縮脲與銅離子結合成紅紫色絡合物，此反應稱為雙縮脲反應。多肽及蛋白質分子結構中均含有許多肽鍵，其結構與雙縮脲分子中的亞酰胺鍵相同。因此，在堿性條件下與銅離子也能呈現出類似于雙縮脲的呈色反應。第八頁，共二十二頁，2022年，8月28日第九頁，共二十二頁，2022年，8月28日實驗過程①取少許結晶尿素放在干燥試管中，微火加熱，尿素溶化并形成雙縮脲，釋出的氨可用紅色石蕊試紙試之。至試管內有白色固體出現，停止加熱，冷卻。然后加10%NaOH溶液1mL混勻，觀察有無紫色出現。②另取一試管，加蛋白質溶液10滴，再加10%NaOH溶液10滴及1%CuSO4溶液4滴，混勻，觀察是否出現紫玫瑰色。第十頁，共二十二頁，2022年，8月28日2.蛋白質的黃色反應

實驗原理：含有苯環結構的氨基酸，如酷氨酸和色氨酸，遇硝酸后，可被硝化成黃色物質，該化合物在堿性溶液中進一步形成深橙色的硝醌酸鈉。多數蛋白質分子含有帶苯環的氨基酸，所以有黃色反應(苯丙氨酸不易硝化，需加入少量濃硫酸才有黃色反應)。第十一頁，共二十二頁，2022年，8月28日第十二頁，共二十二頁，2022年，8月28日實驗過程：在一試管內，加蛋白質溶液10滴及濃硝酸3～4滴，加熱，冷卻后再加10%NaOH溶液5滴，觀察顏色反應。第十三頁，共二十二頁，2022年，8月28日3.茚三酮反應

實驗原理：在弱酸條件下（pH5-7），蛋白質或氨基酸與茚三酮共熱，可生成藍紫色縮合物。此反應為一切蛋白質和α—氨基酸所共有(亞氨基酸如脯氨酸和羥脯氨酸產生黃色化合物)。含有氨基的其他化合物亦可發生此反應。第十四頁，共二十二頁，2022年，8月28日

茚三酮反應分為兩步，第一步是氨基酸被氧化形成CO2、NH3和醛，水合茚三酮被還原成還原型茚三酮;第二步是所形成的還原型茚三酮同另一個水合茚三酮分子和氨縮合成有色物質。第十五頁，共二十二頁，2022年，8月28日實驗過程：

取1mL蛋白質溶液置于試管中，加2滴茚三酮試劑，加熱至沸，即有藍紫色出現(注意：此反應必須在pH5～7進行)。第十六頁，共二十二頁，2022年，8月28日(一)蛋白質的沉淀反應

1.鹽析作用原理

用大量中性鹽(如硫酸銨、硫酸鎂、氯化鈉等)，使蛋白質沉淀析出的過程，稱為蛋白質的鹽析作用。它包括兩個過程：一是電解質破壞了蛋白質的水化層而出現沉淀；二是電解質中和了蛋白質分子所帶的電荷而出現沉淀。中性鹽能否沉淀各種蛋白質與中性鹽的濃度、蛋白質的種類、溶液的pH值以及蛋白質膠體顆粒大小有關。大顆粒蛋白質膠體比小顆粒更容易沉淀，如球蛋白多在半飽和硫酸銨溶液中析出，而清蛋白則在飽和硫酸銨溶液中才能析出。第十七頁，共二十二頁，2022年，8月28日實驗過程

取1支試管加入3mL蛋白質溶液和3mL飽和硫酸銨溶液，混勻，靜置約10min，球蛋白則沉淀析出。過濾后向濾液中加入硫酸銨粉末，邊加邊用玻璃棒攪拌，直至粉末不再溶解達到飽和為止，析出的沉淀為清蛋白，再加水稀釋，觀察沉淀是否溶解。第十八頁，共二十二頁，2022年，8月28日2.乙醇沉淀反應

原理：在水溶液中，蛋白質分子由于表面生成水化層和雙電層而成為穩定的親水膠體顆粒。在有機溶劑中，蛋白質顆粒因失去電荷或脫水而沉淀。第十九頁，共二十二頁，2022年，8月28日

取1支試管架蛋白質溶液1mL，加晶體氯化鈉少許(加速沉淀并使沉淀完全)待溶解后再加入95%乙醇2mL混勻。觀察有無沉淀析出。第二